Summary
In questo protocollo, descriviamo come generare monostrati epiteliali primari murini direttamente dalle cripte intestinali. Forniamo approcci sperimentali per generare monostrati confluenti su filtri permeabili, monostrati confluenti per la guarigione delle ferite da graffio e studi biochimici e monostrati sparsi e confluenti per l'analisi dell'immunofluorescenza.
Abstract
L'epitelio intestinale è composto da un singolo strato di cellule che fungono da barriera tra il lume intestinale e l'interno del corpo. L'interruzione della continuità di questa barriera può causare disturbi infiammatori come la malattia infiammatoria intestinale. Uno dei limiti nello studio della biologia epiteliale intestinale è stata la mancanza di modelli di coltura cellulare primaria, che ha costretto i ricercatori a utilizzare linee cellulari modello derivate da carcinomi. L'avvento degli enteroidi tridimensionali (3D) ha dato ai biologi epiteliali un potente strumento per generare colture cellulari primarie, tuttavia, queste strutture sono incorporate nella matrice extracellulare e mancano della maturità caratteristica delle cellule epiteliali intestinali differenziate. Sono state pubblicate diverse tecniche per generare monostrati epiteliali intestinali, ma la maggior parte deriva da enteroidi 3D consolidati che rende il processo laborioso e costoso. Qui descriviamo un protocollo per generare monostrati epiteliali primari direttamente dalle cripte intestinali murine. Dettagliamo anche approcci sperimentali che possono essere utilizzati con questo modello come la generazione di colture confluenti su filtri permeabili, monostrato confluente per studi di guarigione delle ferite da graffio e monostrati sparsi e confluenti per l'analisi dell'immunofluorescenza.
Introduction
Le cellule epiteliali intestinali (IEC) allineano l'intestino formando una barriera selettivamente permeabile che consente l'assorbimento di nutrienti e acqua prevenendo al contempo l'ingresso di microrganismi e tossine nel corpo 1. La mucosa intestinale è composta da proiezioni luminali chiamate villi (presenti solo nell'intestino tenue) e invaginazioni chiamate cripte. Villi e la superficie delle cripte del colon sono coperte da cellule epiteliali differenziate mentre la base delle cripte è composta da cellule staminali che fanno il rapido rinnovamento dell'epitelia intestinale, che ha un fatturato da 3 a 7 giorni. Le cellule staminali intestinali (ISC) sono importanti non solo per mantenere l'omeostasi intestinale, ma per un'adeguata riparazione dell'epiteliadanneggiata 2.
Lo studio della biologia dell'epitelia intestinale è stato limitato dalla mancanza di colture cellulari primarie con linee cellulari trasformate che sono l'unico strumento disponibile. Le linee cellulari del modello epiteliale intestinale non sono in grado di replicare con precisione la fisiologia del normale epitelio intestinale. Lo sviluppo di colture 3D derivate dall'ISC ha fornito ai biologi della mucosa intestinale modelli in vitro che assomigliano alle condizioni della mucosa intestinale in vivo3. Le cripte possono essere facilmente isolate da campioni murini, incorporate in un mezzo a matrice di membrana basale (ad esempio Matrigel) e coltivate in mezzi condizionati contenenti Wnt3a, R-spodina e Noggin, generando strutture 3D note come enteroidi (intestino tenue) o colonoidi (intestino crasso)4. Enteroidi e colonoidi sono strutture sferoidali polarizzate in cui il dominio apicale si trova di fronte a un lume interno e la regione basolaterale è a diretto contatto con la matrice extracellulare. Enteroidi e colonoidi contengono tutti i principali sottotipi epiteliali intestinali differenziati come enterociti/colonociti, paneth, enteroendocrine e cellule di calice e appaiono in proporzioni relativamente simili a quanto fanno nella sezione intestinale in cui sono stati isolati da5. Anche se gli enteroidi e i colonoidi 3D rappresentano un importante progresso nello studio dello sviluppo intestinale e della fisiologia, questi modelli presentano alcuni inconvenienti come l'accesso limitato alla superficie apicale delle cellule epiteliali (lume) e la capacità di scalare le colture verso l'alto o verso il basso per ottenere uno screening ad alta produttività delle molecole di interesse. Per superare queste limitazioni, sono stati generati protocolli per ottenere colture 2D primarie di IEC derivate da enteroidi/colonoidi 3D. Enteroidi/colonoidi 2D crescono come foglio di cellule proprio come fanno le linee cellulari modello e sono ideali per studiare la riparazione delle ferite intestinali, le interazioni ospite-patogeno e la medicina rigenerativa, tra gli altri. Diversi articoli pubblicati descrivono come generare monostrati 2D da strutture 3D o direttamente da cripte intestinali (vedi6,7,8,9,10,11) ma questi metodi tendono ad essere laboriosi e difficili da riprodurre. Un metodo veloce, semplice e riproducibile per ottenere monostrati direttamente da cripte intestinali di topo appena isolate è delineato in questo protocollo.
Qui spieghiamo in dettaglio il processo di estrazione della cripta con generazione minima di detriti, scelta della matrice extracellulare e diverse superfici e applicazioni per questa tecnica. Questo approccio sperimentale è stato ottimizzato per le cripte del colon, ma risultati simili si ottengono quando vengono applicati per l'intestino tenue.
Protocol
Tutte le procedure descritte di seguito sono state approvate e condotte in conformità con le linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan.
1. Preparazione dei reagenti per l'isolamento e la coltura della cripta (preparati nella cappa di coltura tissutale)
- Acido tetraacetico di etilenediammina da 50 mM (EDTA): aggiungere 50 mL 0,5 M stock a 450 mL di salina tamponata con fosfato, senza calcio (Ca2+) e magnesio (Mg2+) per preparare 500 mL. In questo protocollo PBS farà riferimento a PBS senza calcio e magnesio se non diversamente indicato.
- Shake buffer: Sciogliere 7,4 g di saccarosio (43,3 mM) e 5 g di sorbitolo (54,9 mM) in PBS per preparare 500 mL.
- L-WRN (L-Wnt-3A, Supporti R-spondin e Noggin): Supplemento Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) con siero bovino fetale al 20% (FBS) (200 mL), 1x integratore di glutammina disponibile in commercio (10 mL), 100 U/mL penicillina e, 100 g/mL di streptomicina (10 mL) e filtrare la sterilizzazione con filtro da 0,22 μm.
- Ottenere cellule L-WRN attraverso ATCC, crescere in matracci T175 e selezionare utilizzando geneticina e igromicina. I supporti vengono modificati e raccolti per 12 giorni.
NOTA: ogni lotto di supporti viene testato per l'attività Wnt utilizzando un test TOPflash Wnt Reporter. In questo caso sono stati seguiti i protocolli del Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory (https://www.umichttml.org/protocols) . La linea cellulare TOPflash HEK 293 viene coltivata fino alla confluenza in un mascella T75, tripsinziata e placcata su una piastra da 96 poggia. Il giorno seguente diverse diluizioni del supporto raccolto vengono aggiunte alle cellule e incubate in un incubatore di CO2 del 5% a 37 °C durante la notte. Il giorno dopo, le cellule vengono lisciviate e il saggio Firefly Luciferase viene eseguito secondo le istruzioni del produttore. Il saggio viene normalizzato utilizzando il ricombinante Wnt-3A. Il supporto è diviso in aliquote da 25 ml in tubi conici da 50 ml e conserva a -80 °C.
- Ottenere cellule L-WRN attraverso ATCC, crescere in matracci T175 e selezionare utilizzando geneticina e igromicina. I supporti vengono modificati e raccolti per 12 giorni.
- Supporti di base: Per 500 mL, supplemento Advanced DMEM/F12 (448 mL) con 2x integratore di glutammina disponibile in commercio (10 mL), 20 mM HEPES (10 mL), 100 U/mL penicillina e, 100 g/mL streptomicina (10 mL), 2 mM N-acetil-L-cisteina (2 mL), supplemento N2 (10 mL) e supplemento B27 (20 mL), sterilizzare il filtro con filtro da 0,22 μm. Dividere il supporto in aliquote da 25 ml in tubo conico da 50 ml e conservare a -80 °C.
- Supporto completo LWRN: combina supporti LWRN da 25 mL con 25 mL di supporti di base e integratore con fattore di crescita epidermico 200 ng/mL (EGF) (20μL) e 2 soluzione antibiotico-antimicotica (1 mL). Conservare il supporto completo a 4 °C.
- Collagene e Laminina: Sciogliere 5 mg di polvere in 5 mL di filtro sterilizzato 100 mM acido acetico (aggiungere 60 μL di brodo di acido acetico a 9,94 mL di acqua di grado molecolare) per produrre una concentrazione di stock di 1 mg/mL. Ruotare a 4 °C per 4 ore e creare aliquote da 100 μL in tubi da 0,2 ml. Congelare a -20 °C. La laminina viene acquistata ad una concentrazione di 100 μg/mL.
- Supporti completi senza fattori di crescita (CMGF-): Supplemento DMEM/F12 avanzato (500 mL) con 1x integratore di glutammina disponibile in commercio (5 mL), 10 mM HEPES (5 mL), 100 U/mL penicillina e, 100 g/mL streptomicina (5 mL).
- Mezzi di differenziazione: A 9,2 mL di supporti CMGF, aggiungere 200 μL di integratore B27, 100 μL di integratore N2, 20 μL di N-acetil-L-cisteina, 500 μL di media Noggin12 (fatto da cellule produttrici di Noggin) e 2 μL di EGF per fare 10 mL di mezzi di differenziazione.
2. Preparazione di lastre, vetrini da camera e inserti a membrana per coltura cellulare
- Rivestimento di vetrini a piastra e camera a 48 pozzi per placcatura monostrato 2D: utilizzare la soluzione di rivestimento che costituisce laminina (diluizione 1:40, vedi Tabella dei materiali)e collagene (diluizione 1:30) nella soluzione salina tamponata di fosfato di Dulbecco freddo, con Ca2 + e Mg2 + (DPBS). Aggiungere 200 μL di soluzione di rivestimento ad ogni pozzo e pre-incubare il vetrino piastra/camera in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per almeno 2 ore.
- Rivestimento inserti di membrana di coltura cellulare da 0,4 μm: Effettuare la diluizione 1:30 del collagene in acqua di grado molecolare e aggiungere 200 μL ad ogni inserto. Mantenere la piastra contenente l'inserto a membrana sul ghiaccio a 4 °C per 30 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione, tenere la piastra in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C per 1,5-2 ore. Gli inserti in poliestere e membrana in policarbonato danno risultati comparabili.
NOTA: Qualsiasi piastra di coltura tissutale può essere seminata (è possibile eseguire la su e la downscaling) utilizzando questo protocollo regolando il volume collagene / laminina per ottenere una copertura completa della superficie di placcatura.
3. Isolamento della cripta
NOTA: Prima di iniziare la dissezione, preparare inserti/vetrini rivestiti di collagene e/o laminina/scivolo a camera e lasciarli in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. Preparare un banco di lavoro pulito e strumenti chirurgici sterili appropriati per la chirurgia e un armadietto di sicurezza biologico per la coltivazione di monostrati 2D. Confermare che tutte le altre apparecchiature standard per la coltura monostrato 2D come incubatore di CO2 umidificato, centrifughe da tavolo (mantenute a 4 °C), microscopio e pipette (comprese pipette sierologiche) sono pronte.
- Utilizzare topi C57Bl/6, di età 8-12 settimane. Eutanasia dei topi con un metodo approvato di eutanasia.
- Spruzzare le carcasse dei topi con soluzione di etanolo al 70% (EtOH) per pulire l'area di dissezione e rimuovere l'EtOH in eccesso utilizzando il tessuto di carta.
NOTA: Assicurarsi che i reagenti di isolamento della cripta (come PBS, EDTA da 50 mM, shake buffer) siano mantenuti freddi. Questi reagenti possono essere preparati un giorno prima e sono buoni da usare per almeno 3 mesi se conservati a 4 °C. Inoltre, assicurarsi che il supporto completo LWRN sia conservato in un bagno di perline / acqua mantenuto a 37 °C fino all'uso. - Usando forbici e forcende di dissezione pulite, sezionare il colon dal retto al cieco. Tenere l'estremità del colon con forcette e sciacquare molto delicatamente le feci utilizzando PBS ghiacciato in una siringa da 10 ml, dotata di un tubo di alimentazione da 20 G(Figura 1A). Assicurarsi di non rompersi i due punti.
- Rimuovere i due punti prossimali. Questa sarà la porzione del colon più vicina alla giunzione ileocecale.
- Con le forcep, far scorrere delicatamente il colon distale sul tubo di alimentazione da 20 G, legando il colon all'estremità del tubo dalla punta con filo di sutura di seta 4-0(Figura 1B).
- Invertire il colon verso l'interno con le dita sopra l'estremità legate e legare l'altra estremità con filo di sutura di seta 4-0. Utilizzando forbici chirurgiche, tagliare i due punti sotto la punta del tubo dialimentazione (Figura 1C,D,E).
- Utilizzando lo stantuffo di una siringa ripetuta da 1,25 ml, aprire delicatamente l'estremità slegata del colon invertito sulla punta di una siringa ripetuta da 1,25 ml. Far scorrere il colon rovesciato sull'estremità della siringa e legare saldamente con filo di sutura di seta 4-0 (Figura 1F, G).
- Inserire lo stantuffo nella siringa e gonfiare il colon per formare una salsiccia. Gonfiare fino a quando la salsiccia del colon sembra turgente senza rughe visibili (Figura 1H).
- Posizionare siringa/colon in un tubo da 15 ml con 5 ml di soluzione di recupero cellulare sul ghiaccio per 20 minuti, gonfiare e sgonfiare il colon una volta ogni 5 minuti(Figura 1I). La salsiccia deve rimanere gonfiata durante l'incubazione.
- Legare usando 4-0 filo di sutura di seta sotto la punta della siringa ripetuta con il colon gonfiato. Tagliare la salsiccia dalla siringa ripetuta e posizionare in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di 50 mM (2mM per l'intestino tenue) EDTA per 40 minuti e ruotare a 4 °C(Figura 1J,K).
- Decantare la soluzione EDTA e sostituire con 5 mL di shake buffer. Agitare manualmente la salsiccia in posizione verticale (vigorosamente) per 2 min.
- Decantare la soluzione di scuotimento in un nuovo tubo da 15 ml e ripetere il passaggio di scuotimento per un totale di 10 ml di cripte nel tampone di scuotimento.
- Prendi 20 μL della sospensione della cripta in una piastra di Petri e conta il numero di cripte al microscopio. Calcola la concentrazione della cripta nelle cripte/μL. A seconda della concentrazione, diluire i campioni per ottenere 5 cripte/ μL al momento della placcatura (1000 cripte/cm2).
- Ruotare il tubo con cripte isolate utilizzando centrifuga da tavolo a 400 x g per 10 min a 4 °C.
- Nel frattempo, rimuovere la piastra/inserto/camera a 48 elementi dall'incubatore e posizionarla nell'armadio di biosicurezza. Aspirare la soluzione di rivestimento utilizzando P200 e lasciare la piastra con il coperchio leggermente sfalsato fino a quando le celle non sono pronte per essere placcate.
4. Coltivare monostrato 2D
NOTA: Per un protocollo dettagliato su come generare monostrati epiteliali intestinali dai protocolli di controllo dei colonoidi 3D da parte dei laboratori Estes e Kovbasnjuk (7,11).
- Rimuovere il tampone di scuotimento utilizzando pipetta sierologica da 10 mL. Assicurarsi che il pellet sia intatto e che sia possibile utilizzare P1000 per rimuovere il liquido rimasto. Sospendere di nuovo il pellet in 3 mL di supporti completi LWRN e pipettare su e giù con P1000. Aggiungere 200 μL di cripte ad ogni pozzo di un vetrino/camera pre-rivestito da 48 porcile e incubare in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C.
- Il giorno seguente aspirare il supporto utilizzando P200 e aggiungere nuovi supporti. Le cellule diventano confluenti in 24-48 h.
- Per gli inserti a membrana di coltura cellulare, aggiungere 200 μL di cripte (5 cripte/μL) alla parte superiore degli inserti e 600 μL di supporti L-WRN completi nella parte inferiore. Il giorno seguente aspirare i supporti utilizzando P200 e aggiungere nuovi supporti solo alla camera superiore. Incubare la piastra in un incubatore di CO2 al 5% a 37 °C. La resistenza elettrica transepiteliale (TEER) viene misurata ogni giorno utilizzando il misuratore Epiteliale Volt/Ohm (EVOM).
NOTA: se la cultura ha una lettura TEER maggiore di 300 Ω,cm2, sono pensati per essere confluenti. La confluenza si ottiene in 3-4 giorni. Cambia supporto ogni 2 giorni.
Representative Results
Per illustrare l'affidabilità delle prime culture monostrato epiteliali del colon, viene mostrato un riassunto dell'isolamento della cripta e delle immagini rappresentative derivate dal protocollo. L'utente deve avere in mente che le cripte isolate sono coltivate in condizioni sterili, quindi una corretta dissezione e pulizia del colon è una priorità. La figura 1 presenta i passaggi chiave durante l'isolamento della cripta. Le cripte isolate (Figura 2A) sono ora contate e concentrate (Figura 2B) per ottenere una concentrazione di 5 cripte/μL. Dopo una preparazione concentrata delle cripte, le cellule saranno placcate nel formato desiderato (piatto di coltura, inserti a membrana o scivoli da camera) e incubate con i mezzi appropriati a seconda delle esigenze sperimentali. La figura 3 mostra la progressione della cultura dopo 24 e 48 ore di coltura in piastre a 48 pozzi. Le cellule vengono incubate fino al raggiungere la confluenza desiderata. Per esemplificare possibili applicazioni di questo metodo, abbiamo permesso ai pozzi di piastre da 48 porsi di raggiungere la confluenza e abbiamo proceduto a fare un saggio graffiato. La figura 4 raffigura un graffio appena creato (Figura 4A) in un monostrato colonoide 2D e la stessa ferita 24 ore dopo (Figura 4B). È chiaro che la cultura è ancora sana e vitale e che vi è riparazione delle ferite. Per generare monostrati differenziati, i supporti vengono modificati da LWRN a mezzi di differenziazione. La differenziazione si ottiene mostrando alti valori di TEER(Figura 5A), diminuzionedei marcatori ISC (recettore accoppiato a proteina G ricco di leucina 5 (Lgr5) e Achete-scute come 2 (Ascl2)) e aumento dei marcatori di differenziazione (Alanyl aminopeptidasi (Anpep), Mucin 2 (Muc2), lisozima 1 (Lyz1), Saccarosio iso-maltasi (Sis) e Chrmogranin A (Chga)) (Figura 5B,C) di PCR. Altri marcatori come CDX2 e KRT20 possono anche essere inclusi in questo pannello. Oltre ai livelli di espressione dell'mRNA, la comparsa di sottotipi di cellule epiteliali differenziate nei colonoidi 2D coltivati in condizioni di differenziazione è dimostrata anche dall'immunofluorescenza (Muc2 e Chga; Figura 5D).
Figura 1: Preparazione del campione per la generazione di monostrati sani. La preparazione del campione è fondamentale per la generazione di monostrati sani. I passaggi chiave del processo di isolamento sono illustrati in questa figura per facilitare il lettore. Il colon viene asportato dal topo, assicurandosi che non ci siano avanzi di pelliccia. Rimuovere con cura le feci assicurandosi di non perforare i due punti; questo è di vitale importanza in quanto il colon deve essere in grado di trattenere l'aria ed essere gonfiato e sgonfiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Conteggio e concentrazione dell'isolamento della cripta. (A)Cripte coloniche dopo aver scosso le salsicce del colon. L'immagine raffigura un campo di una goccia di 20 μL. (B) Concentrazione di cripta per ottenere 5 cripte/μL. Barra di scala: 1 mm.
Figura 3: Crescita primaria dei monostrati IEC. (A) Monostrati IEC 2D dopo 24 ore di placcatura e rimozione dei detriti cellulari. (B) Monostrati 2D IEC confluenti 48 ore dopo la placcatura. Barra di scala: 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Saggi di graffio con IEC primario murino. Immagini che mostrano la guarigione delle ferite dopo un graffio è stato fatto nel monostrato epiteliale del colon. Barra di scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Differenziazione dei monostrati epiteliali del colon. (A) I mezzi di differenziazione creano strette barriere epiteliali, come dimostrato dal TEER. I mezzi di differenziazione causano una zione di mRNA deimarcatori di cellule staminali (B)e l'upregolazione dei marcatori di differenziazione(C). (D) Marcatori di cellule epiteliali differenziate specializzate come Muc2 e Cromogranina-A possono anche essere rilevati tramite immunofluorescenza dei colonoidi 2D diretti. Barra di scala: 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il nostro protocollo fornisce un metodo rapido, riproducibile e affidabile per generare monostrati IEC 2D primari diretti. Una delle principali differenze nel nostro protocollo rispetto ai protocolli precedentemente pubblicati per generare monostrati epiteliali colon è che non tagliamo i due punti in piccoli pezzi per liberare le cripte. Invece, abbiamo adattato un protocollo per separare l'epitelio intestinale dal mesenchima13 da una combinazione di forze chimiche e meccaniche per rilasciare cripte in una preparazione estremamente pulita, (Figura 2), fornendo al ricercatore materiale ideale per generare colture primarie. Il nostro metodo di isolamento può anche essere utilizzato per generare enteroidi e colonoidi 3D. È importante fare un conteggio delle cripte ogni volta che viene eseguito un esperimento per normalizzare il numero di cripte che vengono placcate. Variabili come il turgore della salsiccia del colon, la velocità di isolamento, l'esperienza dell'utente possono influenzare il numero di cripte isolate. La concentrazione suggerita della cripta di placcatura menzionata nel protocollo è un punto di partenza, ma ogni utente per tenere conto delle variabili guidate dall'utente deve ottimizzarla. Abbiamo usato questa tecnica con topi WT maschi e femmine che vanno da 8 a 20 settimane e non abbiamo visto grandi differenze nella sopravvivenza cellulare, in teoria le cripte isolate dai topi più giovani hanno maggiori possibilità di sopravvivere. Le cripte sono placcate in eccesso poiché solo una piccola percentuale di esse si attacca alla superficie e sopravvive. Un equilibrio in cui ci sono abbastanza cripte per avere una confluenza del 50% un giorno dopo la placcatura, ma non troppe cripte in cui le cripte morenti avranno un effetto citotossico è l'obiettivo. I supporti LWRN devono essere accuratamente rimossi 24 ore dopo la placcatura per eliminare cripte e detriti morti, questo deve essere fatto con attenzione per evitare di staccare le cellule che stanno già crescendo come monostrato.
Dopo la rimozione iniziale dei supporti LWRN, l'utente deve decidere se le condizioni sperimentali richiedono monostrati IEC primari che rimangono più vicini alle cellule staminali e aggiungono nuovi mezzi LWRN o se si desidera differenziare il monostrato, sostituire con mezzi di differenziazione. Il singolo fattore più importante in questo protocollo è quello di garantire l'integrità dei due punti durante il processo di isolamento. Se si verifica una rottura, la salsiccia può essere accorciata per eliminare l'area danneggiata. Prima di mettere la salsiccia in EDTA assicurarsi che i nodi siano il più stretti possibile. Se la salsiccia viene sgonfiata dopo l'incubazione EDTA, il protocollo può essere continuato con poco o nessun effetto nella resa complessiva della cripta. Se la siringa ripetuta non è disponibile, è possibile utilizzare anche una normale punta in micropipetta attaccata a una siringa normale per il processo di gonfiaggio e deflazione. Inoltre, se non è disponibile alcuna soluzione di recupero cellulare, i passaggi di inflazione e deflazione possono essere eseguiti in EDTA (intestino tenue 2mM, 50 mM colon), ma questa sostituzione non è raccomandata. Se non è richiesta la confluenza, le cripte possono crescere in piastre rivestite solo di collagene e persino in piastre non rivestite. Usa solo casse di piastre non rivestite non c'è altra opzione, ma le cellule non cresceranno sane come farebbero nelle piastre rivestite di collagene. Quando si tratta di salute e stabilità della coltura, i monostrati placcati in plastica sono sani da 4 a 5 giorni mentre i monostrati placcati in transwell possono essere trasportati per un massimo di 8 giorni.
Uno dei principali limiti di questo metodo è il supporto cellulare necessario per far crescere i monostrati epiteliali del colon. Le celle LWRN sono disponibili presso ATCC, ma la generazione di supporti condizionati LWRN richiede un'intensa intensità di manodopera e richiede l'accesso a uno spettrometro fluorescente per determinare l'attività Wnt. I mezzi di differenziazione richiedono una serie di reagenti che vengono aggiunti freschi prima dell'uso, il che lo rende un processo noioso. Infine, la maggior parte di questi reagenti sono costosi ed è facile bruciare i reagenti a un ritmo veloce. Se un laboratorio desidera stabilire questa tecnica senza precedenti culture cellulari primarie intestinali, si consiglia vivamente di trovare un collaboratore / college con esperienza e formare uno dei loro membri.
Il mantenimento della coltura 3D potrebbe essere costoso a causa del costo del mezzo della matrice a membrana basale e degli alti volumi di mezzi condizionati necessari per le colture organoidi, ma ha il vantaggio di utilizzare un numero ridotto di topi e le strutture generate possono essere passaggi molte volte. Gli enteroidi (derivati dall'intestino tenue) sono relativamente facili da isolare e mantenere mentre i colonoidi sono più delicati, crescono a un ritmo più lento e hanno una capacità di passaggio più limitata. La generazione di monostrati da colonoidi 3D richiede una quantità sproporzionata di strutture 3D, che rendono questo tipo di esperimenti dispendiosi in termini di tempo e denaro. Al contrario, la preparazione diretta del monostrato del colon epiteliale è veloce ed è un modo rapido per ottenere i risultati. Una preparazione del colon può generare un'area confluente di 75 cm2 (da 10 a 15 mL di supporti condizionati, sostituisce una volta) da 2 a 3 giorni dopo la placcatura (quest'area richiederebbe 144 pozzi di colonoidi 3D, il che significa quasi 6 mL di Matrigel e più di 250 mL di supporti condizionati). Il minor consumo di mezzi, il mantenimento a basso costo della coltura cellulare e la capacità di eseguire test funzionali e una rapida lavorazione a valle sono grandi vantaggi dei monostrati del colon epiteliale.
Questo protocollo è uno strumento prezioso nello studio della biologia cellulare epiteliale intestinale in aree come l'adesione cellulare, la polarità e la differenziazione. Dà il vantaggio di generare colture cellulari primarie da topi geneticamente modificati (knock-out, sovraespressivi, giornalisti). I monostrati epiteliali intestinali primari consentono un facile accesso alle superfici apicali e basolaterali (quando placcate su transwell) consentendo lo studio della permeabilità, della barriera e della migrazione transepiteliale di diversi tipi di cellule. Infine, questo modello può essere utile in diversi campi come le interazioni ospite-patogeni, i danni epiteliali e la riparazione e la scoperta di farmaci.
Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da un Crohn's and Colitis Foundation Career Development Award (544599, a MQ) e dalle sovvenzioni NIH (DK055679, DK089763, DK059888, ad AN). Vorremmo ringraziare il Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory per il loro continuo aiuto e accesso ai loro reagenti e protocolli.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
| B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
| Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
| Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
| Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
| Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
| N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
| Noggin | Conditioned media | - | |
| Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
| Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
| Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
| rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
| TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
| Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |
References
- Quiros, M., Nusrat, A. Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair. Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).
- Blutt, S. E., et al. Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).
- Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Cardenas, D., et al. Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium. Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Zou, W. Y., et al. Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections. Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Nik, A. M., Carlsson, P. Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme. Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).
