Summary
В этом протоколе мы описываем, как генерировать первичные монослои толстой кишки мышей непосредственно из кишечных крипт. Мы предлагаем экспериментальные подходы к созданию слиющихся монослоев на проницаемых фильтрах, сливающихся монослоев для заживления царапин и биохимических исследований, а также разреженных и слежающихся монослоев для иммунофлуоресцентного анализа.
Abstract
Кишечный эпителий состоит из одного слоя клеток, которые действуют как барьер между просветом кишечника и внутренней частью тела. Нарушение непрерывности этого барьера может привести к воспалительным заболеваниям, таким как воспалительные заболевания кишечника. Одним из ограничений в изучении биологии эпителия кишечника было отсутствие моделей первичных клеточных культур, что вынудило исследователей использовать модельные клеточные линии, полученные из карцином. Появление трехмерных (3D) энтероидов дало эпителиальным биологам мощный инструмент для генерации первичных клеточных культур, тем не менее, эти структуры встроены во внеклеточный матрикс и не имеют зрелости, характерной для дифференцированных эпителиальных клеток кишечника. Было опубликовано несколько методов генерации монослоев кишечного эпителия, но большинство из них получены из установленных 3D-энтероидов, что делает процесс трудоемким и дорогостоящим. Здесь мы описываем протокол для генерации первичных монослоев эпителиальной толстой кишки непосредственно из мышиных кишечных крипт. Мы также подробно описываем экспериментальные подходы, которые могут быть использованы с этой моделью, такие как генерация сливающихся культур на проницаемых фильтрах, слияние монослоя для исследований заживления ран царапин и разреженных и слеивающихся монослоев для иммунофлуоресцентного анализа.
Introduction
Кишечные эпителиальные клетки (IEC) выстилают кишечник, образуя селективно проницаемый барьер, который позволяет всасывать питательные вещества и воду, предотвращая попадание микроорганизмов и токсинов в организм1. Слизистая оболочка кишечника состоит из просветных проекций, называемых ворсинками (присутствующими только в тонкой кишке), и инвагинации, называемой криптами. Ворсинки и поверхность крипт толстой кишки покрыты дифференцированными эпителиальными клетками, в то время как основание крипт состоит из стволовых клеток, которые производят быстрое обновление кишечного эпителия, который имеет оборот от 3 до 7 дней. Кишечные стволовые клетки (ISC) важны не только для поддержания гомеостаза кишечника, но и для адекватного восстановления поврежденного эпителия2.
Изучение биологии кишечного эпителия было ограничено отсутствием первичных клеточных культур с преобразованными клеточными линиями, являющимися единственным доступным инструментом. Клеточные линии кишечной эпителиальной модели не способны точно воспроизвести физиологию нормального кишечного эпителия. Развитие 3D-культур, полученных из ISC, обеспечило биологов слизистой оболочки кишечника моделями in vitro, которые напоминают in vivo состояния слизистой оболочки кишечника3. Крипты могут быть легко выделены из образцов мышей, встроены в матричную среду базальной мембраны (например, Matrigel) и выращены в кондиционированных средах, содержащих Wnt3a, R-спондин и Ноггин, генерируя 3D-структуры, известные как энтероиды (тонкая кишка) или колоноиды (толстая кишка)4. Энтероиды и колоноиды представляют собой поляризованные сфероидальные структуры, где апикальный домен обращен к внутреннему просвету, а базолатеральная область находится в прямом контакте с внеклеточным матриксом. Энтероиды и колоноиды содержат все основные дифференцированные подвиды кишечного эпителия, такие как энтероциты / колоноциты, панет, энтероэндокрин и бокалы, и они появляются в относительно тех же пропорциях, что и в участке кишечника, где они были выделены из5. Несмотря на то, что 3D-энтероиды и колоноиды представляют собой значительный прогресс в изучении кишечного развития и физиологии, эти модели представляют определенные недостатки, такие как ограниченный доступ к апикальной поверхности эпителиальных клеток (просвет) и способность масштабировать культуры вверх или вниз для достижения высокопроизводительного скрининга интересующих молекул. Чтобы преодолеть эти ограничения, были сгенерированы протоколы для получения первичных 2D-культур IEC, полученных из 3D-энтероидов / колоноидов. 2D-энтероиды / колоноиды растут как лист клеток так же, как это делают модельные клеточные линии, и идеально подходят для изучения восстановления ран кишечника, взаимодействия хозяина и патогена и регенеративной медицины среди других. В нескольких опубликованных работах описывается, как генерировать 2D-монослои из 3D-структур или непосредственно из кишечных крипт (см.6,7,8,9,10,11),но эти методы, как правило, трудоемки и трудны для воспроизведения. Быстрый, простой и воспроизводимый метод получения монослоев непосредственно из свежеизолированных кишечных крипт мыши описан в этом протоколе.
Здесь мы подробно объясняем процесс извлечения крипты с минимальным образованием мусора, выбор внеклеточной матрицы и различные поверхности и приложения для этой техники. Этот экспериментальный подход был оптимизирован для крипт толстой кишки, но аналогичные результаты получены при применении для тонкой кишки.
Protocol
Все процедуры, описанные ниже, были одобрены и проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по институциональным уходу и использованию животных Мичиганского университета.
1. Подготовка реагентов для выделения и культивирование крипты (подготовка в тканевом культуре вытяжки)
- 50 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты (ЭДТА): Добавьте 50 мл 0,5 мл к 450 мл фосфатного буферного физиологического раствора без кальция (Ca2+)и магния (Mg2+)для приготовления 500 мл. В этом протоколе PBS будет относиться к PBS без кальция и магния, если не указано иное.
- Коктейльный буфер: Растворите 7,4 г сахарозы (43,3 мМ) и 5 г сорбита (54,9 мМ) в PBS для приготовления 500 мл.
- L-WRN (L-Wnt-3A, R-спондин и Ноггин) среды: Дополнение Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 мл) с 20% фетальной бычим сывороткой (FBS) (200 мл), 1x коммерчески доступной добавкой глутамина (10 мл), 100 Ед /мл пенициллина и 100 г/мл стрептомицина (10 мл) и стерилизовать фильтр с фильтром 0,22 мкм.
- Получайте клетки L-WRN через ATCC, выращивайте в колбах T175 и выбирайте с помощью Geneticin и Hygromycin. Медиа меняется и собирается в течение 12 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая партия носителей проверяется на активность Wnt с использованием анализа TOPflash Wnt Reporter. В этом случае были соблюдена протоколы Лаборатории трансляционного моделирования тканей Мичиганской медицины (https://www.umichttml.org/protocols). Клеточная линия TOPflash HEK 293 выращивается до слияния в колбе T75, трипсинизируется и наносится на пластину из 96 скважин. На следующий день различные разведения собранной среды добавляют к клеткам и инкубировали в 5% инкубаторе CO2 при 37 °C в течение ночи. На следующий день клетки льются, а анализ люциферазы светлячков проводится в соответствии с инструкциями производителя. Анализ нормализуют с помощью рекомбинантного Wnt-3A. Среда делится на 25 мл аликвот в конических трубках по 50 мл и хранится при -80 °C.
- Получайте клетки L-WRN через ATCC, выращивайте в колбах T175 и выбирайте с помощью Geneticin и Hygromycin. Медиа меняется и собирается в течение 12 дней.
- Базовые среды: Для 500 мл добавка Advanced DMEM/F12 (448 мл) с 2x коммерчески доступной добавкой глютамина (10 мл), 20 мМ HEPES (10 мл), 100 ЕД/мл пенициллина и 100 г/мл стрептомицина (10 мл), 2 мМ N-ацетил-L-цистеина (2 мл), добавка N2 (10 мл) и добавка B27 (20 мл), фильтр стерилизовать фильтром 0,22 мкм. Разделите жиму на 25 мл аликвот в конической трубке по 50 мл и храните при -80 °C.
- LWRN complete media: Комбинируйте 25 мл среды LWRN с 25 мл базовой среды и добавку с 200 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF) (20 мкл) и 2x антибиотик-антимикотический раствор (1 мл). Храните всю мупли при 4 °C.
- Коллаген и ламинин: Растворите 5 мг порошка в 5 мл стерилизованной фильтрующей 100 мМ уксусной кислоты (добавьте 60 мкл уксусной кислоты к 9,94 мл воды молекулярного класса) для получения концентрации запаса 1 мг / мл. Вращают при 4 °C в течение 4 ч и делают 100 мкл аликвот в пробирках по 0,2 мл. Заморозить при -20 °C. Ламинин приобретается в концентрации 100 мкг/мл.
- Полная среда без факторов роста (CMGF-): Добавка Advanced DMEM/F12 (500 мл) с 1x коммерчески доступной добавкой глютамина (5 мл), 10 мМ HEPES (5 мл), 100 Ед/мл пенициллина и 100 г/мл стрептомицина (5 мл).
- Дифференцировка среды: к 9,2 мл CMGF-среды добавьте 200 мкл добавки B27, 100 мкл добавки N2, 20 мкл N-ацетил-L-цистеина, 500 мкл noggin media12 (изготовленной из Noggin-продуцирующих клеток) и 2 мкл EGF, чтобы получить 10 мл дифференцировки среды.
2. Подготовка пластин, камерных слайдов и вкладышек клеточных культур
- Покрытие 48-скважинной пластины и камерных слайдов для покрытия 2D монослоя: Используйте раствор покрытия, который представляет собой ламинин (разбавление 1:40, см. Таблицу материалов)и коллаген (разбавление 1:30) в холодном буферном фосфатном физиологическом растворе Dulbecco с Ca2+ и Mg2+ (DPBS). Добавляют 200 мкл раствора покрытия в каждую скважину и предварительно инкубируют пластину/камерный слайд в 5% инкубаторе CO2 при 37 °C в течение не менее 2 ч.
- Покрытие мембранных вставок клеточной культуры 0,4 мкм: Сделайте разбавление коллагена 1:30 в воде молекулярного класса и добавьте 200 мкл к каждой вставке. Держите пластину, содержащую мембранную вставку, на льду при 4 °C в течение 30 мин. После 30 мин инкубации держите пластину в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C в течение 1,5-2 ч. Мембранные вставки из полиэстера и поликарбоната дают сопоставимые результаты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Любая пластина для посева тканей может быть посеяна (может быть выполнено масштабирование вверх и вниз) с использованием этого протокола путем регулировки объема коллагена / ламинина для получения полного покрытия поверхности покрытия.
3. Изоляция крипты
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом рассечения приготовьте коллагеновые и/или пластинчатые вставки/мембранные вставки/слайд камеры с покрытием коллагеном и/ламинином и оставьте их в инкубаторе с 5% CO2 при 37 °C. Подготовьте чистый рабочий стол и стерильные хирургические инструменты, подходящие для хирургии, а также шкаф биологической безопасности для культивирования 2D-монослоев. Убедитесь, что все другое стандартное оборудование для 2D-однослойного культивирования, такое как увлажненный инкубатор CO2, настольные центрифуги (поддерживается при 4 °C), микроскоп и пипетки (включая серологические пипетки), готовы.
- Используйте мышей C57Bl/6, 8-12 недель. Усыпленить мышей, используя одобренный метод эвтаназии.
- Опрыскивайте туши мышей 70% раствором этанола (EtOH) для очистки области рассечения и удаления избытка EtOH с помощью бумажной салфетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что крипты изоляции крипт (такие как PBS, 50 мМ ЭДТА, буфер встряхивания) хранятся в холодном состоянии. Эти реагенты могут быть приготовлены за один день до этого и хороши для использования в течение не менее 3 месяцев при хранении при 4 °C. Кроме того, убедитесь, что полная среда LWRN хранится в шариковой / водяной бане при 37 °C до использования. - Используя чистые ножницы для рассечения и щипцы, рассеките толстую кишку от прямой кишки до слепой кишки. Удерживайте конец толстой кишки с помощью щипцов и очень осторожно смывайте фекалии с помощью ледяного PBS в шприце 10 мл, оснащенном питательной трубкой 20 Г(рисунок 1A). Убедитесь, что вы не разорваны толстой кишкой.
- Удалить проксимальную часть толстой кишки. Это будет участок толстой кишки, ближайший к илеоцекальному соединению.
- С помощью щипцов осторожно сдвиньте дистальную обитель на питательную трубку 20 г, связав толстую кишку в конце трубки наконечником с помощью 4-0 шелковой шовной нити(рисунок 1B).
- Переверните толстую кишку наизнанку пальцами через связанный конец и свяжите другой конец шелковой шовной нитью 4-0. Используя хирургические ножницы, срежьте толстую кишку ниже кончика питательной трубки(рисунок 1C,D, E).
- Используя поршень повторного шприца 1,25 мл, осторожно откройте развязанный конец перевернутой толстой кишки на кончике повторного шприца 1,25 мл. Сдвиньте перевернутую обхватку на конец шприца и плотно завяжите шелковой шовной нитью 4-0(рисунок 1F,G).
- Вставьте поршень в шприц и надувайте толстую кишку, чтобы сформировать колбасу. Надувать до тех пор, пока колбаса толстой кишки не будет выглядеть тургентной без видимых морщин(рисунок 1H).
- Поместите шприц/толстую кишку в 15 мл пробирки с 5 мл раствора для восстановления клеток на льду в течение 20 мин, раздувайте и сдувайте толстую кишку один раз в 5 мин(Рисунок 1I). Колбаса должна оставаться надутой во время инкубации.
- Завяжите 4-0 шелковой шовной нитью ниже кончика повторного шприца с надутой толстой кишкой. Отрежьте колбасу от повторного шприца и поместите в 15 мл пробирку, содержащую 10 мл 50 мМ (2 мМ для тонкой кишки) ЭДТА в течение 40 мин и вращайте при 4 °C(рисунок 1J,K).
- Отстой от раствора ЭДТА и замените 5 мл встряхивания буфера. Взбалтнуть колбасу вручную в вертикальном положении (энергично) в течение 2 мин.
- Декантирует встряхивающий раствор в новую трубку объемом 15 мл и повторяет шаг встряхивания в общей сложности 10 мл крипт в встряхивающий буфер.
- Возьмите 20 мкл суспензии крипты в чашке Петри и подсчитайте количество склепов под микроскопом. Рассчитайте концентрацию крипты в криптах/мкл. В зависимости от концентрации разбавьте образцы до получения 5 крипт/мклв момент нанесения покрытия (1000 крипт/см2).
- Вращайте трубку с изолированными криптами с помощью настольной центрифуги при 400 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Тем временем извлеките из инкубатора 48-скважинную пластину/вставку/камеру и поместите ее в шкаф для обеспечения биобезопасности. Аспирировать раствор покрытия с помощью P200 и оставить пластину с крышкой, слегка смещенной, пока ячейки не будут готовы к покрытию.
4. Культивирование 2D монослоя
ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробного протокола о том, как генерировать монослои кишечного эпителия из 3D-колоноидов, проверьте протоколы лабораторий Эстеса и Ковбаснюка (7,11).
- Снимите трясущийся буфер с помощью серологической пипетки 10 мл. Убедитесь, что гранула цела и может использовать P1000 для удаления оставшейся жидкости. Повторно суспензируют гранулы в 3 мл полной среды LWRN и пипетки вверх и вниз с P1000. Добавьте 200 мкл крипт в каждую скважину предварительно покрытой 48-скважинной пластинчатой/камерной горки и инкубируют в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C.
- На следующий день аспирировать носитель с помощью P200 и добавить свежие носители. Клетки слиются через 24-48 ч.
- Для мембранных вставок клеточной культуры добавьте 200 мкл крипт (5 крипт/мкл) в верхнюю часть вкладышей и 600 мкл полной среды L-WRN в нижнюю часть. На следующий день аспирировать носитель с помощью P200 и добавлять свежие носители только в верхнюю камеру. Инкубировать пластину в 5% CO2 инкубаторе при 37 °C. Трансэпителиальное электрическое сопротивление (TEER) измеряется каждый день с помощью эпителиального вольт/Омметра (EVOM).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если культура имеет значение TEER более 300 Ω,см2, они должныбытьслижены. Слияние достигается через 3-4 дня. Меняйте медиафайлы каждые 2 дня.
Representative Results
Чтобы проиллюстрировать надежность монослойных культур первичного эпителия толстой кишки, показано краткое изложение изоляции крипты и репрезентативные изображения, полученные из протокола. Пользователь должен иметь в виду, что изолированные крипты культивируются в стерильных условиях, поэтому правильное рассечение и очистка толстой кишки является приоритетом. На рисунке 1 представлены ключевые шаги во время изоляции крипты. Изолированные крипты(рисунок 2A)теперь подсчитывают и концентрируют(рисунок 2B)для получения концентрации 5 крипт/мкл. После концентрированного приготовления крипт клетки будут покрыты в нужном формате (культуральная чашка, мембранные вставки или камерные слайды) и инкубированы с соответствующими средами в зависимости от экспериментальных потребностей. На рисунке 3 показана прогрессия культуры после 24 и 48 ч культуры в 48-скважинных пластинах. Клетки инкубируют до тех пор, пока не будет достигнуто желаемое слияние. Чтобы проиллюстрировать возможные применения этого метода, мы позволили 48-скважинным пластинчатым скважинам достичь слияния и приступили к анализу с царапинами. На рисунке 4 изображена только что созданнаяцарапина (рисунок 4A)в 2D-монослое колоноида и та же рана через 24 ч после(рисунок 4B). Понятно, что культура по-прежнему здорова и жизнеспособна и есть заживление ран. Для генерации дифференцированных монослоев среда изменяется с LWRN на дифференциацию сред. Дифференцировка достигается за счет демонстрации высоких значений TEER(Рисунок 5A),снижения маркеров ISC ((богатый лейцином повторно содержащий G-белок рецептор 5 (Lgr5) и Achaete-scute like 2 (Ascl2)) и увеличение маркеров дифференцировки ((Аланиламинопептидаза (Anpep), Муцин 2 (Muc2), лизоцим 1 (Lyz1), изо-мальтаза сахарозы (Sis) и Chrmogranin A (Chga))(Рисунок 5B,C)с помощью ПЦР. Другие маркеры, как CDX2 и KRT20, также могут быть включены в эту панель. Помимо уровней экспрессии мРНК, появление подвидов дифференцированных эпителиальных клеток в 2D-колоноидах, выращенных в условиях дифференцировки, проявляется также иммунофлуоресценцией (Muc2 и Chga; Рисунок 5D).
Рисунок 1:Пробоподготовка для генерации здоровых монослоев. Пробоподготовка имеет решающее значение для генерации здоровых монослоев. Ключевые этапы процесса изоляции изображены на этом рисунке, чтобы облегчить его читателю. Толстая кишка иссякается у мыши, чтобы убедиться, что нет остатков меха. Осторожно удалите кал, убедившись, что вы не перфорируете толстую кишку; это имеет жизненно важное значение, так как толстая кишка должна быть в состоянии удерживать воздух и быть надутой и сдутой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Количество и концентрация изоляции крипты. (A) Толстые склепы после встряхивания колбас толстой кишки. На изображении изображено поле капли размером 20 мкл. (B) Концентрация крипты для получения 5 крипт / мкл. Шкала: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Первичный монослойный рост МЭК. (А)2D монослои МЭК после 24 ч покрытия и удаления клеточного мусора. (B) Слияние монослоев 2D IEC через 48 ч после нанесения покрытия. Шкала: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Анализы на царапины с использованием первичной МЭК мышмы. Изображения, показывающие заживление ран после того, как в монослое эпителиальной кишки была сделана царапина. Шкала: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Дифференциация монослоев эпителиальной кишки. (A) Дифференцированные среды создают плотные эпителиальные барьеры, как показано в TEER. Дифференцировка сред вызывает падение экспрессии мРНК маркеров стволовых клеток(B)и увеличение регуляции маркеров дифференцировки(C). Маркерыспециализированных дифференцированных эпителиальных клеток, таких как Muc2 и хромогранин-А, также могут быть обнаружены с помощью иммунофлуоресценции прямых 2D-колоноидов. Шкала: 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Наш протокол обеспечивает быстрый, воспроизводимый и надежный метод генерации прямых первичных монослоев 2D IEC. Одно из основных различий в нашем протоколе по сравнению с ранее опубликованными протоколами для генерации эпителиальных монослоев толстой кишки заключается в том, что мы не разрезаем толстую кишку на мелкие кусочки, чтобы освободить крипты. Вместо этого мы адаптировали протокол для отделения кишечного эпителия от мезенхимы13 путем комбинации химических и механических сил для высвобождения крипт в чрезвычайно чистом препарате(рисунок 2),предоставляя исследователю идеальный материал для создания первичных культур. Наш метод изоляции также может быть использован для генерации 3D-энтероидов и колоноидов. Важно подсчитывать крипты каждый раз, когда проводится эксперимент, чтобы нормализовать количество позолочиваемых крипт. Такие переменные, как толстоберная кишка, скорость изоляции, опыт пользователя могут влиять на количество изолированных крипт. Предлагаемая концентрация крипты, упомянутая в протоколе, является отправной точкой, но каждый пользователь для учета пользовательских переменных должен оптимизировать ее. Мы использовали эту технику с самцами и самками мышей WT в диапазоне от 8 до 20 недель, и мы не видели серьезных различий в выживании клеток, теоретически крипты, выделенные от молодых мышей, имеют больше шансов на выживание. Крипты покрыты в избытке, так как только небольшой процент из них прикрепляется к поверхности и выживает. Целью является баланс, где достаточно крипт, чтобы иметь 50% слияние через день после покрытия, но не слишком много крипт, где умирающие крипты будут иметь цитотоксический эффект. Носители LWRN должны быть тщательно удалены через 24 часа после покрытия, чтобы устранить мертвые крипты и мусор, это должно быть сделано осторожно, чтобы избежать отсоединения клеток, которые уже растут как монослой.
После первоначального удаления среды LWRN пользователь должен решить, требуют ли экспериментальные условия первичных монослоев IEC, которые остаются ближе к стволовым клеткам и добавляют свежие среды LWRN, или, если дифференцировка монослоя желательна, заменить их дифференцировочной средой. Единственным наиболее важным фактором в этом протоколе является обеспечение целостности толстой кишки во время процесса изоляции. Если происходит разрыв, колбасу можно укоротить, чтобы устранить поврежденный участок. Перед тем, как положить колбасу в ЭДТА, убедитесь, что узлы максимально тугие. Если колбаса сдувается после инкубации ЭДТА, протокол может быть продолжен практически без влияния на общий выход крипты. Если повторный шприц недоступен, для процесса инфляции и дефляции также может быть использован обычный наконечник микропипетки, прикрепленный к обычному шприцевому шприцу. Кроме того, если нет раствора для восстановления клеток, этапы инфляции и дефляции могут быть выполнены в ЭДТА (2 мМ тонкой кишки, 50 мМ толстой кишки), но эта замена не рекомендуется. Если слияние не требуется, крипты могут расти в пластинах, покрытых только коллагеном и даже в непокрытных пластинах. Используйте только незакрытую пластинчатую оболочку, нет другого варианта, но клетки не будут расти здоровыми, как в пластинах с коллагеновым покрытием. Когда дело доходит до здоровья и стабильности культуры, монослои, покрытые пластиком, полезны для здоровья в течение 4-5 дней, в то время как монослои, покрытые трансвеллами, можно перевозить до 8 дней.
Одним из основных ограничений этого метода является клеточная среда, необходимая для выращивания монослоев эпителиальной толстой кишки. Ячейки LWRN доступны в ATCC, но генерация кондиционированных сред LWRN является трудоемкой и требует доступа к флуоресцентной спектрометре для определения активности Wnt. Дифференциация сред требует ряда реагентов, которые добавляются свежими перед использованием, что делает его утомительным процессом. Наконец, большинство из этих реагентов являются дорогостоящими и легко сжигают реагенты в быстром темпе. Если лаборатория желает установить эту технику без предварительной культуры первичных клеток кишечника, настоятельно рекомендуется найти сотрудника / колледж с опытом и обучить одного из их членов.
Поддержание 3D-культуры может быть дорогостоящим из-за стоимости среды матрицы базальной мембраны и больших объемов кондиционированных сред, необходимых для органоидных культур, но оно имеет преимущество в использовании уменьшенного количества мышей, и генерируемые структуры могут быть проезжены много раз. Энтероиды (полученные из тонкой кишки) относительно легко изолируются и поддерживаются, в то время как колоноиды более деликатны, растут более медленными темпами и имеют более ограниченную способность к прохождению. Монослойная генерация из 3D-колоноидов требует непропорционально большого количества 3D-структур, что делает такие эксперименты трудоемкими и дорогостоящими. Напротив, прямая подготовка монослоя эпителиальной кишки происходит быстро и является быстрым способом получения результатов. Одна толстая кишка может генерировать площадь слияния 75см2 (от 10 до 15 мл кондиционированных сред, заменяет один раз) через 2-3 дня после покрытия (для этой области потребуется 144 скважины 3D-колоноидов, что означает почти 6 мл Матрикеля и более 250 мл кондиционированных сред). Более низкое потребление сред, низкое стоимость поддержания клеточной культуры и способность выполнять функциональные тесты и быструю переработку являются большими преимуществами монослоев эпителиальной толстой кишки.
Этот протокол является ценным инструментом в изучении биологии эпителиальных клеток кишечника в таких областях, как клеточная адгезия, полярность и дифференцировка. Это дает преимущество для генерации первичных клеточных культур из генетически модифицированных мышей (нокаутных, сверхвыражающих, репортеров). Первичные монослои эпителия кишечника обеспечивают легкий доступ к апикальной и базолатеральной поверхностям (при покрытии трансвеллами), что позволяет изучать проницаемость, барьерную и трансэпителиальную миграцию различных типов клеток. Наконец, эта модель может быть полезна в различных областях, таких как взаимодействие хозяина и патогенов, повреждение эпителия и восстановление и открытие лекарств.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана премией Фонда Крона и Колита за развитие карьеры (544599, MQ) и грантами NIH (DK055679, DK089763, DK059888, AN). Мы хотели бы поблагодарить Лабораторию трансляционного моделирования тканей Мичиганской медицины за их постоянную помощь и доступ к их реагентам и протоколам.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
| B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
| Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
| Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
| Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
| Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
| N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
| Noggin | Conditioned media | - | |
| Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
| Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
| Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
| rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
| TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
| Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |
References
- Quiros, M., Nusrat, A. Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair. Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).
- Blutt, S. E., et al. Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).
- Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Cardenas, D., et al. Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium. Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Zou, W. Y., et al. Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections. Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Nik, A. M., Carlsson, P. Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme. Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).
