Summary
In dit protocol beschrijven we hoe murine primaire epitheliale colon monolayers rechtstreeks uit intestinale crypten kunnen worden gegenereerd. We bieden experimentele benaderingen om samenvloeiende monolagen te genereren op doorlatende filters, confluente monolagen voor kraswondgenezing en biochemische studies, en schaarse en samenvloeiende monolagen voor immunofluorescentieanalyse.
Abstract
Het darmepitheel bestaat uit een enkele laag cellen die fungeren als een barrière tussen het darmlumen en het binnenste van het lichaam. Verstoring in de continuïteit van deze barrière kan leiden tot ontstekingsstoornissen zoals inflammatoire darmziekten. Een van de beperkingen in de studie van intestinale epitheelbiologie is het gebrek aan primaire celkweekmodellen, die onderzoekers hebben verplicht om modelcellijnen afgeleid van carcinomen te gebruiken. De komst van driedimensionale (3D) enteroïden heeft epitheliale biologen een krachtig hulpmiddel gegeven om primaire celculturen te genereren, niettemin zijn deze structuren ingebed in extracellulaire matrix en missen ze de volwassenheid die kenmerkend is voor gedifferentieerde intestinale epitheelcellen. Verschillende technieken om intestinale epitheliale monolagen te genereren zijn gepubliceerd, maar de meeste zijn afgeleid van gevestigde 3D-enteroïden die het proces arbeidsintensief en duur maken. Hier beschrijven we een protocol om primaire epitheliale colon monolayers rechtstreeks uit muriene intestinale crypten te genereren. We beschrijven ook experimentele benaderingen die met dit model kunnen worden gebruikt, zoals het genereren van samenvloeiende culturen op permeabele filters, confluente monolayer voor scratch wondgenezingsstudies en schaarse en samenvloeiende monolagen voor immunofluorescentieanalyse.
Introduction
Intestinale epitheelcellen (IEC) lijn de darmen vormen een selectief doorlatende barrière die nutriënten en water absorptie mogelijk maakt, terwijl voorkomen dat micro-organismen en toxines in het lichaam 1. Het darmslijmvlies bestaat uit lichtgevende projecties genaamd villi (alleen aanwezig in de dunne darm) en invaginaties genaamd crypten. Villi en het oppervlak van colon crypten zijn bedekt met gedifferentieerde epitheelcellen, terwijl de basis van de crypten bestaat uit stamcellen die de snelle vernieuwing van de darmepithlia maken, die een omzet heeft van 3 tot 7 dagen. Intestinale stamcellen (ISC) zijn niet alleen belangrijk voor het behoud van de darmhomeostase, maar ook voor een adequaat herstel van beschadigde epithelia2.
Studie van de darmepithliabiologie werd beperkt door het gebrek aan primaire celculturen, waarbij getransformeerde cellijnen het enige beschikbare hulpmiddel waren. Intestinale epitheliale modelcellijnen zijn niet in staat om de fysiologie van het normale darmepitheel nauwkeurig te repliceren. De ontwikkeling van 3D-culturen afgeleid van ISC voorzag intestinale mucosale biologen van in vitro modellen die lijken op in vivo darmslijmvliesaandoeningen3. Crypten kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit muriene monsters, ingebed in een keldermembraanmatrixmedium (bijv. Matrigel) en gekweekt in geconditioneerde media met Wnt3a, R-spondin en Noggin, waardoor 3D-structuren worden gegenereerd die bekend staan als enteroïden (dunne darm) of colonoïden (dikke darm)4. Enteroïden en colonoïden zijn gepolariseerde sferoïdale structuren waarbij het apicale domein wordt geconfronteerd met een intern lumen en het basolaterale gebied in direct contact staat met de extracellulaire matrix. Enteroïden en colonoïden bevatten alle belangrijke gedifferentieerde intestinale epitheelsubtypen zoals Enterocyten/Colonocyten, Paneth,Enteroendocrine en Bekercellen en ze verschijnen in relatief dezelfde verhoudingen als in het gedeelte van de darm waar ze werden geïsoleerd van5. Hoewel 3D-enteroïden en colonoïden een belangrijke vooruitgang betekenen in de studie van darmontwikkeling en fysiologie, vertonen deze modellen bepaalde nadelen, zoals beperkte toegang tot het apicale oppervlak van de epitheelcellen (lumen) en het vermogen om culturen omhoog of omlaag te schalen om een screening met hoge doorvoer van moleculen van belang te bereiken. Om deze beperkingen te overwinnen, werden protocollen gegenereerd om primaire 2D-culturen van IEC te verkrijgen die zijn afgeleid van 3D-enteroïden / colonoïden. 2D-enteroïden/colonoïden groeien als een blad cellen, net als modelcellijnen en zijn ideaal om onder andere darmwondherstel, gastheer-pathogene interacties en regeneratieve geneeskunde te bestuderen. Verscheidene gepubliceerde documenten beschrijven hoe 2D monolayers van 3D structuren of direct van darmcrypten te genereren, (zie6,7,8,9,10,11) maar deze methodes neigen om arbeidsintensief en moeilijk te reproduceren te zijn. Een snelle, eenvoudige en reproduceerbare methode om monolagen rechtstreeks uit vers geïsoleerde darm crypten van muizen te verkrijgen, wordt in dit protocol beschreven.
Hier leggen we in detail het proces voor crypte-extractie uit met minimale generatie puin, extracellulaire matrixkeuze en verschillende oppervlakken en toepassingen voor deze techniek. Deze experimentele aanpak werd geoptimaliseerd voor colon crypten, maar vergelijkbare resultaten worden verkregen wanneer toegepast voor dunne darm.
Protocol
Alle hieronder beschreven procedures zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Voorbereiding van reagentia voor crypte-isolatie en -kweek (voorbereiden in weefselkweekkap)
- 50 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA): Voeg 50 ml 0,5 m bouillon toe aan 450 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing, zonder calcium (Ca2+) en magnesium (Mg2+) om 500 ml te bereiden. In dit protocol verwijst PBS naar PBS zonder calcium en magnesium, tenzij anders vermeld.
- Schudbuffer: Los 7,4 g sacharose (43,3 mM) en 5 g sorbitol (54,9 mM) op in PBS om 500 ml te bereiden.
- L-WRN (L-Wnt-3A, R-spondin en Noggin) media: Supplement Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (DMEM/F12) (780 mL) met 20% Foetale Runderserum (FBS) (200 ml), 1x in de handel verkrijgbaar glutaminesupplement (10 ml), 100 U/ml penicilline
- Haal L-WRN-cellen door ATCC, kweek in T175-kolven en selecteer met Geneticine en Hygromycine. Media worden gedurende 12 dagen gewijzigd en verzameld.
OPMERKING: Elke batch media wordt getest op Wnt-activiteit met behulp van een TOPflash Wnt Reporter-test. In dit geval werden de Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory protocollen (https://www.umichttml.org/protocols) gevolgd. De TOPflash HEK 293 cellijn wordt gekweekt tot samenvloeiing in een T75 kolf, trypsinized en geplateerd op een 96-well plaat. De volgende dag worden verschillende verdunningen van de verzamelde media toegevoegd aan cellen en geïncubeerd in een couveuse van 5% CO2 bij 37 °C 's nachts. De volgende dag worden de cellen gelyseerd en wordt de Firefly Luciferase-test uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. De test wordt genormaliseerd met behulp van recombinant Wnt-3A. De media zijn verdeeld in 25 ml aliquots in 50 ml conische buizen en bewaren bij -80 °C.
- Haal L-WRN-cellen door ATCC, kweek in T175-kolven en selecteer met Geneticine en Hygromycine. Media worden gedurende 12 dagen gewijzigd en verzameld.
- Basismedia: Voor 500 ml, supplement Advanced DMEM/F12 (448 mL) met 2x in de handel verkrijgbaar glutaminesupplement (10 ml), 20 mM HEPES (10 ml), 100 U/ml penicilline en 100 g/ml streptomycine (10 ml), 2 ml N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 ml N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 ml N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 100 ml streptomycine (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 ml N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 100 ml streptomycine (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml streptomycine (10 ml), 2 mM N-acetyl-L-cysteïne (2 ml), N2-supplement (10 ml) en 10 ml Verdeel de media in 25 ml aliquots in 50 ml conische buis en bewaar bij -80 °C.
- LWRN complete media: Combineer 25 ml LWRN-media met 25 ml basismedia en vul aan met 200 ng/ml epidermale groeifactor (EFG) (20μL) en 2x antibioticum-antimycotische oplossing (1 ml). Bewaar de volledige media bij 4 °C.
- Collageen en laminine: Los 5 mg poeder op in 5 ml gesteriliseerd filter 100 mM azijnzuur (voeg 60 μL azijnzuurvoorraad toe aan 9,94 ml water van moleculaire kwaliteit) om een voorraadconcentratie van 1 mg/ml te produceren. Draai bij 4 °C gedurende 4 uur en maak 100 μL aliquots in buizen van 0,2 ml. Vries in bij -20 °C. Laminine wordt gekocht bij een voorraadconcentratie van 100 μg/ml.
- Complete media zonder groeifactoren (CMGF-): Supplement Advanced DMEM/F12 (500 ml) met 1x in de handel verkrijgbaar glutaminesupplement (5 ml), 10 ml HEPES (5 ml), 100 U/ml penicilline en 100 g/ml streptomycine (5 ml).
- Differentiatiemedia: Voeg aan 9,2 ml CMGF-media 200 μL B27-supplement, 100 μL N2-supplement, 20 μL N-acetyl-L-cysteïne, 500 μL Noggin-media12 (gemaakt van Noggin-producerende cellen) en 2 μL EFG toe om 10 ml differentiatiemedia te maken.
2. Voorbereiding van platen, kamerglijbanen en celkweekmembraaninzetstukken
- Coating 48-put plaat en kamerglijbanen voor het plateren van 2D monolayer: Gebruik de coatingoplossing die laminine (1:40 verdunning, zie Tabel van Materialen)en collageen (1:30 verdunning) vormt in koude Dulbecco's Fosfaat gebufferde zoutoplossing, met Ca2+ en Mg2+ (DPBS). Voeg 200 μL coatingoplossing toe aan elke put en incubeer de plaat/kamerschuif in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C gedurende ten minste 2 uur.
- Coating 0,4 μm celkweekmembraan inserts: Maak 1:30 verdunning van collageen in moleculair water en voeg 200 μL toe aan elke insert. Houd de plaat met de membraaninzet gedurende 30 minuten op ijs bij 4 °C. Na 30 minuten incubatie, houd de plaat in een 5% CO2 incubator bij 37 °C gedurende 1,5-2 uur. Polyester en polycarbonaat membraan inzetstukken leveren vergelijkbare resultaten op.
OPMERKING: Elke weefselkweekplaat kan worden gezaaid (omhoog en omlaag kan worden gezaaid) met behulp van dit protocol door het collageen/ lamininevolume aan te passen om volledige dekking van het platingoppervlak te verkrijgen.
3. Crypte isolatie
OPMERKING: Voordat u met de dissectie begint, moet u collageen en/of laminine gecoate plaat/membraaninzetstukken/kamerschuif bereiden en in een couveuse van 5% CO2 bij 37 °C laten staan. Bereid een schone werkbank en steriele chirurgische instrumenten voor die geschikt zijn voor chirurgie, en een biologische veiligheidskast voor het cultiveren van 2D-monolagen. Controleer of alle andere standaarduitrusting voor 2D-monolaagse cultivering, zoals bevochtigde CO2-incubator, tafelcentrifuges (onderhouden bij 4 °C), microscoop en pipetten (inclusief serologische pipetten) klaar zijn.
- Gebruik C57Bl/6 muizen, 8-12 weken oud. Euthanasie van muizen met behulp van een goedgekeurde methode van euthanasie.
- Besproei de karkassen van muizen met 70% ethanol (EtOH) oplossing om het dissectiegebied schoon te maken en overtollige EtOH te verwijderen met behulp van papierweefsel.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de crypte-isolatiereagentia (zoals PBS, 50 mM EDTA, schudbuffer) crypten koud worden gehouden. Deze reagentia kunnen een dag van tevoren worden bereid en zijn goed te gebruiken gedurende ten minste 3 maanden wanneer ze bij 4 °C worden bewaard. Zorg er ook voor dat de LWRN complete media tot gebruik in een kraal/waterbad bij 37 °C worden bewaard. - Ontleed met een schone dissectieschaar en tang de dikke darm van het rectum naar het cecum. Houd het uiteinde van de dikke darm vast met een tang en spoel de ontlasting heel voorzichtig af met behulp van ijskoud PBS in een spuit van 10 ml, uitgerust met een voedingsbuis van 20 G (figuur 1A). Zorg ervoor dat u de dikke darm niet scheurt.
- Verwijder de proximale dikke darm. Dit is het deel van de dikke darm dat het dichtst bij de ileocecal junction ligt.
- Schuif met een tang de distale dikke darm voorzichtig op de 20 G-voedingsbuis enbind de dikke darm aan het einde van de buis af met de punt met 4-0 zijden hechtdraad(afbeelding 1B).
- Keer de dikke darm binnenstebuiten met de vingers over het uiteinde vastgebonden en bind het andere uiteinde vast met 4-0 zijden hechtdraad. Snijd met behulp van een chirurgische schaar de dikke darm onder de punt van de voedingsbuis(figuur 1C,D, E).
- Open met behulp van de zuiger van een herhaalspuit van 1,25 ml voorzichtig het losgemaakte uiteinde van de omgekeerde dikke darm op de punt van een herhaalspuit van 1,25 ml. Schuif de omgekeerde dikke darm op het uiteinde van de spuit en bind stevig vast met 4-0 zijden hechtdraad(afbeelding 1F, G).
- Steek de zuiger in de spuit en blaas de dikke darm op tot een worst. Blaas op tot de darmworst er turgent uitziet zonder zichtbare rimpels(figuur 1H).
- Plaats de spuit/dikke darm in een buis van 15 ml met 5 ml celhersteloplossing gedurende 20 minuten op ijs, blaas de dikke darm eens in de 5 minuten op en laat deze leeglopen (figuur 1I). De worst moet tijdens de incubatie opgeblazen blijven.
- Bind af met 4-0 zijden hechtdraad onder de punt van de herhaalspuit met de dikke darm opgeblazen. Snijd de worst van de herhaalspuit en plaats deze in een buis van 15 ml met 10 ml 50 mM (2 mM voor de dunne darm) EDTA gedurende 40 minuten en draai bij 4 °C(figuur 1J, K).
- Decanteer de EDTA-oplossing en vervang deze door 5 ml schudbuffer. Schud de worst 2 min. handmatig in verticale positie (krachtig).
- Decanteer de schudoplossing in een nieuwe buis van 15 ml en herhaal de schudstap voor in totaal 10 ml crypten in de schudbuffer.
- Neem 20 μL van de crypte suspensie in een petrischaal en tel het aantal crypten onder een microscoop. Bereken de crypteconcentratie in crypten/μL. Verdun de monsters afhankelijk van de concentratie om 5 crypten/μL te verkrijgen op het moment van plateren (1000 crypten/cm2).
- Draai de buis met geïsoleerde crypten met behulp van tafelbladcentrifuge op 400 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijder ondertussen de 48-put plaat/insert/kamerschuif uit de incubator en plaats deze in de bioveiligheidskast. Aspireer de coatingoplossing met P200 en laat de plaat met het deksel iets verschoven totdat de cellen klaar zijn om te worden geplateerd.
4. Cultiveren van 2D monolaag
OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol over het genereren van intestinale epitheliale monolagen uit 3D-colonoïden, controleert u protocollen van Estes en Kovbasnjuk labs (7,11).
- Verwijder de schudbuffer met een serologische pipet van 10 ml. Zorg ervoor dat de pellet intact is en gebruik P1000 om de overgebleven vloeistof te verwijderen. Hang de pellet opnieuw op in 3 ml LWRN complete media en pipet op en neer met P1000. Voeg 200 μL crypten toe aan elke put van een voorgecoate 48-put plaat/kamerschuif en incubeer in een CO2-incubator van 5% bij 37 °C.
- De volgende dag aspireren de media met behulp van P200 en voeg nieuwe media toe. De cellen worden samenvloeiend in 24-48 uur.
- Voeg voor celkweekmembraaninzetstukken 200 μL crypten (5 crypten/μL) toe aan de bovenkant van de inserts en 600 μL volledige L-WRN-media aan het onderste deel. De volgende dag aspireren de media met behulp van P200 en voeg alleen nieuwe media toe aan de bovenste kamer. Incubeer de plaat in een CO2 incubator van 5% bij 37 °C. Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) wordt elke dag gemeten met behulp van epitheliale volt / ohm meter (EVOM).
OPMERKING: Als de cultuur een TEER-meting van meer dan 300Ω,cm 2heeft, zijn ze bedoeld om samen te komen. Confluency wordt bereikt in 3-4 dagen. Verander elke 2 dagen van medium.
Representative Results
Om de betrouwbaarheid van de primaire epitheliale colon monolayer culturen te illustreren, wordt een samenvatting van de crypte isolatie en representatieve afbeeldingen afgeleid van het protocol getoond. De gebruiker moet in gedachten hebben dat de geïsoleerde crypten in steriele omstandigheden worden gekweekt, dus een juiste dissectie en reiniging van de dikke darm is een prioriteit. Figuur 1 bevat belangrijke stappen tijdens crypte-isolatie. Geïsoleerde crypten (figuur 2A) worden nu geteld en geconcentreerd (figuur 2B) om een concentratie van 5 crypten/μL te verkrijgen. Na een geconcentreerde bereiding van crypten worden de cellen in het gewenste formaat geplateerd (kweekschaal, membraaninzetstukken of kamerdia's) en geïncubeerd met de juiste media, afhankelijk van de experimentele behoeften. Figuur 3 toont de cultuurprogressie na 24 en 48 uur cultuur in 48-putplaten. De cellen worden geïncubeerd totdat de gewenste samenvloeiing is bereikt. Om mogelijke toepassingen van deze methode te illustreren, lieten we 48-put plaatputten samenvloeien en gingen we verder met een kraswondtest. Figuur 4 toont een vers gecreëerde kras (Figuur 4A) in een 2D colonoïde monolayer en dezelfde wond 24 uur na (Figuur 4B). Het is duidelijk dat de cultuur nog steeds gezond en levensvatbaar is en dat er wondherstel is. Om gedifferentieerde monolagen te genereren, worden media gewijzigd van LWRN in differentiatiemedia. Differentiatie wordt bereikt door het tonen van hoge TEER-waarden(figuur 5A),afname van ISC-markers ((Leucine-rijke repeat-containing G-eiwit gekoppelde receptor 5 (Lgr5) en Achaete-scute zoals 2 (Ascl2)) en toename van differentiatiemarkers ((Alanyl aminopeptidase (Anpep), Mucin 2 (Muc2), lysozyme1 (Lyz1),Sucrose iso-malta Andere markeringen als CDX2 en KRT20 kunnen ook in dit paneel worden opgenomen. Naast mRNA-expressieniveaus wordt het verschijnen van subtypen gedifferentieerde epitheelcellen in 2D-colonoïden die in differentiatieomstandigheden worden gekweekt, ook aangetoond door immunofluorescentie (Muc2 en Chga; Figuur 5D).
Figuur 1: Monstervoorbereiding voor gezonde monolagengeneratie. Monstervoorbereiding is cruciaal voor het genereren van gezonde monolagen. De belangrijkste stappen van het isolatieproces worden in deze afbeelding weergegeven om het de lezer gemakkelijker te maken. De dikke darm wordt uit de muis verwijderd, waardoor er geen bontresten overblijven. Verwijder voorzichtig de uitwerpselen en zorg ervoor dat u de dikke darm niet perforeert; dit is van vitaal belang omdat de dikke darm lucht moet kunnen vasthouden en opgeblazen en leeggelopen moet kunnen worden. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Crypte isolatie aantal en concentratie. (A) Colonische crypten na het schudden van de darmworsten. De afbeelding toont een veld van een daling van 20 μL. (B) Crypteconcentratie om 5 crypten/μL te verkrijgen. Schaalbalk: 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Primaire IEC Monolayer groei. (A) 2D IEC monolayers na 24 uur plateren en verwijderen van celresten. (B) Confluent 2D IEC monolayers 48 h na plating. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Kraswondtesten met behulp van muriene primaire IEC. Beelden die wondgenezing tonen nadat een kras in epitheliale epideminonlaag werd gemaakt. Schaalbalk: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Differentiatie van epitheliale colon monolayers. (A) Differentiatiemedia creëren strakke epitheelbarrières zoals aangetoond door TEER. Differentiatiemedia veroorzaken een daling van de mRNA-expressie van (B) stamcellenmarkers en upregulatie van (C) differentiatiemarkers. (D) Markers van gespecialiseerde gedifferentieerde epitheelcellen zoals Muc2 en Chromogranin-A kunnen ook worden gedetecteerd via immunofluorescentie van directe 2D-colonoïden. Schaalbalk: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Ons protocol biedt een snelle, reproduceerbare en betrouwbare methode om directe primaire 2D IEC-monolagen te genereren. Een van de belangrijkste verschillen in ons protocol in vergelijking met eerder gepubliceerde protocollen om epitheliale monolagen van de dikke darm te genereren, is dat we de dikke darm niet in kleine stukjes snijden om de crypten te bevrijden. In plaats daarvan pasten we een protocol aan om darmepitheel van mesenchyme13 te scheiden door een combinatie van chemische en mechanische krachten om crypten vrij te geven in een uiterst schoon preparaat (figuur 2), waardoor de onderzoeker ideaal materiaal had om primaire culturen te genereren. Onze isolatiemethode kan ook worden gebruikt om 3D-enteroïden en colonoïden te genereren. Het is belangrijk om elke keer dat een experiment wordt uitgevoerd een cryptetelling uit te voeren om het aantal crypten dat wordt geplateerd te normaliseren. Variabelen zoals colon worst turgor, snelheid van isolatie, gebruikersexpertise kunnen het aantal geïsoleerde crypten beïnvloeden. De voorgestelde crypteconcentratie die in het protocol wordt genoemd, is een startpunt, maar elke gebruiker die rekening houdt met door de gebruiker aangestuurde variabelen moet deze optimaliseren. We hebben deze techniek gebruikt met mannelijke en vrouwelijke WT-muizen variërend van 8 tot 20 weken en we hebben geen grote verschillen in celoverleving gezien, in theorie hebben crypten geïsoleerd van jongere muizen betere kansen om te overleven. Crypten zijn meer dan geplateerd omdat slechts een klein percentage ervan zich aan het oppervlak hecht en overleeft. Een balans waar er genoeg crypten zijn om een dag na plating een 50% samenvloeiing te hebben, maar niet te veel crypten waar de stervende crypten een cytotoxisch effect zullen hebben, is het doel. LWRN-media moeten 24 uur na het plateren zorgvuldig worden verwijderd om dode crypten en puin te verwijderen, dit moet zorgvuldig worden gedaan om te voorkomen dat cellen die al als monolaag groeien, worden losgemaakt.
Na de eerste verwijdering van LWRN-media moet de gebruiker beslissen of de experimentele omstandigheden primaire IEC-monolagen vereisen die dichter bij stamcellen blijven en nieuwe LWRN-media toevoegen of als differentiatie van de monolaag gewenst is, vervangen door differentiatiemedia. De belangrijkste factor in dit protocol is het waarborgen van de integriteit van de dikke darm tijdens het isolatieproces. Als er een breuk optreedt, kan de worst worden ingekort om het beschadigde gebied te elimineren. Voordat u de worst in EDTA doet, moet u ervoor zorgen dat de knopen zo strak mogelijk zijn. Als de worst na de EDTA-incubatie leegloopt, kan het protocol met weinig tot geen effect in de totale crypteopbrengst worden voortgezet. Als de herhaalspuit niet beschikbaar is, kan ook een gewone micropipettip aan een gewone spuit worden gebruikt voor het proces van inflatie en deflatie. Ook als er geen celhersteloplossing beschikbaar is, kunnen de inflatie- en deflatiestappen worden uitgevoerd in EDTA (2mM dunne darm, 50 mM dikke darm), maar deze vervanging wordt niet aanbevolen. Als samenvloeiing niet nodig is, kunnen crypten groeien in platen die alleen zijn bedekt met collageen en zelfs in ongecoate platen. Gebruik alleen ongecoate platen gevallen er is geen andere optie, maar de cellen zullen niet gezond worden zoals ze zouden doen in collageen-gecoate platen. Als het gaat om de gezondheid en stabiliteit van cultuur, zijn monolayers geplateerd in plastic 4 tot 5 dagen gezond, terwijl monolayers geplateerd in transwells maximaal 8 dagen kunnen worden gedragen.
Een van de belangrijkste beperkingen van deze methode is de celmedia die nodig zijn om de epitheliale colonmonolagen te laten groeien. LWRN-cellen zijn beschikbaar bij ATCC, maar LWRN-geconditioneerde mediageneratie is arbeidsintensief en vereist toegang tot een fluorescerende spectrometer om Wnt-activiteit te bepalen. Differentiatiemedia vereisen een aantal reagentia die vers worden toegevoegd voor gebruik, waardoor het een vervelend proces is. Ten slotte zijn de meeste van deze reagentia duur en zijn ze gemakkelijk om de reagentia in een snel tempo te verbranden. Als een laboratorium deze techniek wil opzetten zonder eerdere intestinale primaire celcultuur, wordt het ten zeerste aanbevolen om een medewerker / college met ervaring te vinden en een van hun leden op te leiden.
Onderhoud van 3D-cultuur kan duur zijn vanwege de kosten van keldermembraanmatrix medium en grote hoeveelheden geconditioneerde media die nodig zijn voor organoïde culturen, maar het heeft het voordeel dat het een verminderd aantal muizen gebruikt en de gegenereerde structuren kunnen vele malen worden doorgepasseerd. Enteroïden (afgeleid van de dunne darm) zijn relatief gemakkelijk te isoleren en te onderhouden, terwijl colonoïden delicater zijn, in een langzamer tempo groeien en een beperktere doorgangscapaciteit hebben. Monolaaggeneratie van 3D-colonoïden vereist een onevenredige hoeveelheid 3D-structuren, die dit soort experimenten tijdrovend en duur maken. Integendeel, directe epitheliale colon monolayer prep is snel en is een snelle manier om de resultaten te verkrijgen. Eén colon prep kan een samenvloeiend gebied van 75 cm2 (10 tot 15 ml geconditioneerde media, vervangt eenmaal) 2 tot 3 dagen na plating genereren (dit gebied vereist 144 putten van 3D-colonoïden, wat bijna 6 ml Matrigel en meer dan 250 ml geconditioneerde media betekent). Het lagere mediaverbruik, het goedkope onderhoud van de celkweek en het vermogen om functionele tests uit te voeren en snelle downstreamverwerking zijn grote voordelen van epitheliale colonmonolagen.
Dit protocol is een waardevol hulpmiddel bij de studie van intestinale epitheelcelbiologie op gebieden zoals celadhesie, polariteit en differentiatie. Het geeft het voordeel om primaire celculturen te genereren van genetisch gemodificeerde muizen (knock-out, overexpressie, verslaggevers). De primaire intestinale epitheliale monolagen bieden gemakkelijke toegang tot de apicale en basolaterale oppervlakken (wanneer geplateerd op transwells) waardoor de studie van permeabiliteit, barrière en transepitheliale migratie van verschillende celtypen mogelijk is. Ten slotte kan dit model nuttig zijn op verschillende gebieden, zoals interacties tussen gastheer en ziekteverwekkers, epitheliale schade en reparatie en medicijnontdekking.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een Crohn's and Colitis Foundation Career Development Award (544599, aan MQ) en de NIH-beurzen (DK055679, DK089763, DK059888, aan AN). We willen het Michigan Medicine Translational Tissue Modeling Laboratory bedanken voor hun voortdurende hulp en toegang tot hun reagentia en protocollen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Antibiotic Antimycotic solution | Corning | 30-004CI | |
| B27 supplement (50X) | Gibco | 12587-010 | |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen from human placenta (type IV) | Sigma-Aldrich | C5533 | |
| D-Sorbitol | Sigma | 85529-250G | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, with Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-030-CV | |
| Epithelial Volt/Ohm meter | World Precision Instruments | 0-10KΩ with STX2 (EVOM2) | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) | Lonza | 51201 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-016-CV | |
| Firefly Luciferase assay | Biotium | 30085-2 | |
| Geneticin | Gibco | 10131-035 | |
| GlutaMAX (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEPES (1M) | Corning | 25060CI | |
| Human recombinant EGF | R&D systems | 236-EG | Stock Concentration: 500µg/mL |
| Human recombinant Wnt-3A | R&D systems | W3a-H-005 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
| LWRN cells | ATCC | CRL-3276 | |
| Molecular grade water | Corning | 46-000-CV | |
| N2 supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| N-acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | Stock Concentration: 500mM |
| Noggin | Conditioned media | - | |
| Nunc Lab-Tek Chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182-1PAK | |
| Pencillin-Streptomycin (10,000U/mL) | Corning | 30002CI | |
| Phospahte buffered saline, Ca2+ and Mg2+ free (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Plastic 20G feeding tube | Fisher Scientific | 50-810-46 | |
| rh-laminin-521 | Gibco | A29248 | Stock concentration: 100µg/mL |
| Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided 100YD | Fisher Scientific | NC9452680 | |
| TOPflash HEK293 cells | ATCC | CRL-3249 | |
| Transwell Permeable supports (0.4µm) | Corning | 3470 |
References
- Quiros, M., Nusrat, A. Contribution of wound-associated cells and mediators in orchestrating gastrointestinal mucosal wound repair. Annual Reviews in Physiology. 81, 189-209 (2019).
- Blutt, S. E., et al. Use of organoids to study regenerative responses to intestinal damage. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 317 (6), 845-852 (2019).
- Zhang, M., Liu, Y., Chen, Y. G. Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications. Cell Regeneration. 9 (1), 6 (2020).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Kozuka, K., et al. Development and characterization of a human and mouse intestinal epithelial cell monolayer platform. Stem Cell Reports. 9 (6), 1976-1990 (2017).
- In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. Journal of Visualized Experiments. (146), e59357 (2019).
- Cardenas, D., et al. Two- and three-dimensional bioengineered human intestinal tissue models for cryptosporidium. Methods in Molecular Biology. 2052, 373-402 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- VanDussen, K. L., et al. Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays. Gut. 64 (6), 911-920 (2015).
- Zou, W. Y., et al. Human intestinal enteroids: New models to study gastrointestinal virus infections. Methods in Molecular Biology. 1576, 229-247 (2019).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell Reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Nik, A. M., Carlsson, P. Separation of intact intestinal epithelium from mesenchyme. Biotechniques. 55 (1), 42-44 (2013).
