Summary
Denne artikel demonstrerer en effektiv kirurgisk tilgang til at etablere akut iskæmi hos mus med et lille snit. Denne tilgang kan anvendes af de fleste forskningsgrupper uden laboratorieopgraderinger.
Abstract
Formålet med denne undersøgelse er at indføre og evaluere en modificeret kirurgisk tilgang til at fremkalde akut iskæmi hos mus, der kan implementeres i de fleste dyrelaboratorier. I modsætning til den konventionelle tilgang til dobbelt ligation af lårpulsåren (DLFA), blev der foretaget et mindre snit i den rigtige lyske region for at udsætte den proksimale lårpulsåre (FA) til at udføre DLFA. Derefter, ved hjælp af en 7-0 sutur, snittet blev slæbt til knæet regionen for at afsløre den distale FA. Magnetisk resonans imaging (MRI) på bilaterale bagben blev brugt til at opdage FA okklusion efter operationen. Ved 0, 1, 3, 5 og 7 dage efter operationen blev funktionel genopretning af bagbenene visuelt vurderet og klassificeret ved hjælp af Tarlov-skalaen. Histologisk evaluering blev udført efter aflivning af dyrene 7 dage efter DLFA. Procedurerne blev udført med succes på højre ben i ti ApoE-/- mus, og ingen mus døde under efterfølgende observation. Snitstørrelserne i alle 10 mus var mindre end 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MR-scanningsresultater viste, at FA's blodgennemstrømning i den iskæmiske side var tydeligt blokeret. Tarlov-skalaresultaterne viste, at bagbensfunktionen faldt betydeligt efter proceduren og langsomt kom sig i løbet af de følgende 7 dage. Histologisk evaluering viste en betydelig inflammatorisk reaktion på den iskæmiske side og reduceret mikrovaskulær tæthed i det iskæmiske bagben. Afslutningsvis introducerer denne undersøgelse en modificeret teknik ved hjælp af et miniature snit til at udføre bagbenskæmi (HLI) ved hjælp af DLFA.
Introduction
Der er et uopfyldt behov for prækliniske dyremodeller til forskning i vaskulære sygdomme som perifer arteriesygdom (PAD). På trods af den avancerede udvikling inden for diagnose og behandling var der mere end 200 millioner patienter med PAD i 20181, og deres antal er konstant stigende. Selv om flere nye terapeutiske tilgange2,3,4,5,6,7 er blevet beskrevet, vellykket oversættelse af disse terapeutiske modaliteter til klinisk anvendelse er stadig en skræmmende opgave. Derfor er der behov for pålidelige og relevante in vivo-eksperimentelle modeller, der simulerer tilstanden af mennesker, for at undersøge den potentielle mekanisme og effektivitet af disse nye terapeutiske tilgange til behandling af PAD6,7.
Hyperlipidæmi og åreforkalkning (AS) er de vigtigste risikofaktorer for udviklingen af PAD. ApoE-/- mus (på en fedtrig kost) udviser unormal fedtstofskifte og hyperlipidæmi og udvikler efterfølgende aterosklerotiske plaques, der gengiver ApoE- / - mus som det bedste valg til at simulere den klinisk relevante PAD. Prækliniske HLI dyremodeller genereres gennem dobbelt ligation af lårpulsåren (DLFA), som er den mest udbredte tilgang i laboratorier over hele verden8,9,10,11,12,13,14,15 for at simulere akut-on-kronisk iskæmi. Denne tilgang kræver dog normalt et relativt stort og invasivt snit. Desuden fører det uundgåeligt til, at dyrene (især mus) lider af øget smerteskade og betændelse, hvilket også påvirker de efterfølgende eksperimentelle resultater5,6,16,17. Dette papir beskriver en akut-on-kronisk HLI model i APOE-/- mus ved hjælp af et meget lille snit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Alle forsøgsprocedurer blev udført i henhold til EF's retningslinje EF 2010/63/EU og er godkendt af den lokale tyske lovgivning (35-9185.81/G[1]239/18). Ti mandlige ApoE-/- mus med C57BL/6J baggrund, vejer 29,6-38,0 g, blev opstaldet på en 12 timers lys / mørk cyklus og fodret med en vestlig kost (1,25% kolesterol og 21% fedt) og vand ad libitum i 12 uger fra en alder af 8 uger. HLI blev udført på 20 uger gamle mus som beskrevet nedenfor.
1. Induktion af HLI i ApoE-/- mus
- Forbered det nødvendige udstyr og værktøj til kirurgi (se materialetabellen og figur 1). Steriliser de kirurgiske instrumenter via autoklavering før brug og brug en glas perle sterilisator under operationen.
- Bedøve musen med en subkutan injektion (S.C.) af en blanding af midazolam (5 mg/kg), medetomidin (0,05 mg/ml/kg) og fentanyl (0,5 mg/kg) før alle kirurgiske indgreb.
- Efter debut af anæstesi, bruge dyrlægen salve på øjnene for at forhindre tørhed, og bekræfte fraværet af pedal tilbagetrækning refleks i forben og bagben.
- Derefter placeres musen på en varmepude for at holde kernekropstemperaturen på ca. 37 °C. Brug vatpinde og hårfjerning creme, forsigtigt fjerne hår fra bagben huden på højre side.
BEMÆRK: Hårfjerningscremen skal anvendes i tilstrækkelig mængde til at dække baglimb, især den lyske region, hvor snittet vil blive lavet. Hårfjerningscremen skal anvendes i en varighed på mindre end 3 minutter og skal efterfølgende fjernes med fugtede vatpinde 2 til 3 gange. - Læg musen i liggende position på varmepuden under et dissekeringmikroskop. Brug en hud antiseptisk (se tabellen over materialer)til at desinficere musens hud. Derefter skal du bruge spidse pincet og kirurgisk saks til at lave et ca. 3-4 mm snit midt i lyskeregionen. Se figur 2 for at få et skema over proceduren.
- Fjern det subkutane fedtvæv omhyggeligt ved hjælp af fine spidse pincet for at eksponere det proksimale neurovaskulære bundt. Brug forsigtigt de fine spidse pincet til at gennembore membranen på lårskeskeden. Brug en vatpind fugtet med saltvand til at flytte lårpulsåren (FA) forsigtigt væk fra lårnerven (FN) og lårbenet vene (FV).
- Pass to 7-0 absorberes suturer gennem den proksimale FA, og gøre dobbelt knob ved hjælp af foråret saks til at transect FA mellem de to bånd.
- For at eksponere den distale FA skal du passere en 7-0 absorberbar sutur gennem underkanten af snittet og forsigtigt trække snittet til området på højre side af bagbenets knæ.
- Flyt det subkutane væv til side omhyggeligt for at eksponere det neurovaskulære bundt. Brug fine spidse pincet til at gennembore membranen på lårmorskeden, og dissekere FA fra FV og FN.
- Pass to 7-0 absorberes suturer gennem distal FA, og gøre dobbelt knob. Brug fjedersaks til at transect FA mellem de to bånd.
BEMÆRK: Ingen ligation blev udført på venstre lem, som tjente som en kontrol i hver mus. - Derefter skal du bruge 6-0 absorberelige suturer til at sy snittet. Placer musen på en varmepude i et rent bur og fortsætte med at overvåge sine vitale parametre, indtil inddrivelse. Giv postoperativ smertestillende midler: Buprenorphin s.c. (0,1 mg/kg kropsvægt hver 8. time i 48 timer). 48 timer efter operationen skal metamizol i drikkevandet administreres (24 mg/5 mL vand svarer til en dosis på 200 mg/kg 4 gange dagligt).
2. Magnetisk resonansbilleddannelse
BEMÆRK: En dag efter DLFA skal musene gennemgå MR-scanninger for at vurdere FA-blokering.
- Placer musen i et gennemsigtigt induktionskammer, og bedøve musen med 1,5-2% isoflurane i luften, indtil du mister retterefleks.
- Placer musen på en opvarmet dyreseng udstyret med en bidholder og placeret mod magneten med et laserstyret system. Kropstemperaturen fastholdes ved 37±1 °C.
- Under billedopsamling skal du opretholde anæstesi med 1,5-2% isoflurane i luften og overvåge åndedrættet ved hjælp af en tryksonde.
- Hent billeder i tværgående udsnitsretning ved hjælp af en tredimensionel (3D) flyvetid (TOF) angiografisekvens med parameter ekkotid (TE)/gentagelsestid (TR)/flip vinkel (FA) = 2 ms/12 ms/13°, fire gennemsnit, en anskaffelsesmatrix på 178 x 144 rekonstrueret til 256 x 192 og 121 skiver, hvilket resulterer i en isotropisk opløsning på 0,15 mm3. For at undertrykke signalet fra venerne skal du placere en mætningsskive distally til bagbenene.
3. Klinisk evaluering og opfølgning
- Anslå den funktionelle opsving i 1st,3rd,5th,og 7th dage efter operationen ved hjælp af den funktionelle scoring Tarlov skala18,19 (Tabel 1).
4. Histologisk evaluering
- Syv dage efter operationen skal du anvende pentobarbital injektion (115 mg/kg) for at aflive musene.
- Gennemtræng fosfat-buffered saltvand (PBS), der indeholder 1% paraformaldehyd (PFA) gennem venstre hjertetritrikel (100 mL pr. Mus). Fastgør musenes bilaterale gastrocnemius (Gm) i 4% PFA natten over ved 4 °C.
- Integrer eksemplet i paraffin i henhold til den tidligere beskrevne protokol20.
- Skær 4-5 μm tykke dele af den paraffin-indlejrede vævsblok på en mikrotom. Ved hjælp af en rund pensel skal du placere de afskårne vævssektioner i vandbadet, der vedligeholdes ved 42 °C.
- Sæt mikroskopet i vandet i en 45° vinkel, og placer det forsigtigt under den gruppe sektioner, der skal indsamles.
- Løft forsigtigt rutsjebanen op af vandet, og lad sektionerne fastgøres til rutsjebanen og tørre natten over i bænkekuvøsen ved 37 °C.
- Udfør hæmatoxylin/eosin (HE) farvning af paraffinsektionerne.
- Placer de dias, der indeholder sektionerne, i diasholdere. Forbered 3 beholdere med frisk xylen, og læg diasene i hver beholder i 5 minutter for at deparaffinere sektionerne.
- Rehydrere sektionerne ved at dyppe skiverne successivt i 96%, 80%, 70%, 50%, 30% ethanol og deioniseret vand i 5 min hver.
- Plet i hæmatoxylinopløsning i 10 min.
- Overfør skiverne til en beholder med deioniseret vand og skyl ved at placere under rindende vand fra hanen i 5 min.
- Brug et mikroskop, kontrollere intensiteten af hæmatoxylin farvning. Hvis farvningen gør det muligt at identificere cellekernerne tydeligt, skal du fortsætte til næste trin. Hvis farvningsintensiteten ikke letter identifikationen af cellekerner, eller hvis intensiteten af farvningen er svag, skal du placere rutsjebanen i hæmatoxylinopløsningen i 1 min, gentage vask med vand (trin 4.4.4) og derefter kontrollere igen.
- Counterstain i eosin-Y opløsning i 5 min.
- Dehydrere sektionerne ved at dyppe skiverne successivt i beholdere, der indeholder deioniseret vand og 30%, 50%, 70%, 80% og 96% ethanol successivt for en varighed 10 s hver. Derefter placere sektioner sekventielt i tre beholdere med frisk xylen for 10 s hver.
- Placer diasene vandret på mikroskopiske slidelagringskort med sektionerne opad. Tilføj nok monteringsmedium på diaset, og monter diasene med coverslips.
- Udfør immunohistokemisk (IHC) farvning af paraffin sektioner.
- Gentag deparaffinerings- og rehydreringstrin 4.4.1-4.4.2. Derefter nedsænkes sektionerne i en beholder med 10 mM natriumcitratbuffer, pH 6, og kog prøven i en mikrobølgeovn.
BEMÆRK: Da over- eller underopvarmning af prøver kan forårsage inkonsekvent farvning, skal temperaturen holdes lige under kogepunktet i 10 min. - Derefter afkøles sektionerne på en bordplade i 30 minutter. Derefter vaskes sektionerne i PBS tre gange i 5 min. Tør forsigtigt området omkring prøven, og tegn en stor cirkel rundt om prøven ved hjælp af en hydrofob pen. .
BEMÆRK: Rør aldrig ved prøven. Mærkning med en hydrofob pen skaber en hydrofob grænse, som letter brugen af en mindre mængde antistofopløsning. - Sluk endogen peroxidaseaktivitet ved at placere sektionen i 0,3% H2O2 i PBS i 10 min. Bloksektioner med 400 μL blokbuffer (PBS indeholder 3 % kvægserumalbumin og 0,3 % af ikke-ionisk vaskemiddel) i 1 time ved stuetemperatur i et befugtet kammer.
- Vask sektionerne i PBS i 5 min. Derefter tilsættes 100-400 μL fortyndet anti-CD31 antistof (1:250) nok til at dække sektionen. Herefter inkuberes sektioner natten over ved 4 °C i et befugtet kammer.
BEMÆRK: Sørg for, at sektionen er helt dækket af antistofopløsningen. - Fjern det primære antistof, og vask sektionerne tre gange i PBS i en varighed på 5 min hver.
- Tilbered blandingen 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) ved at tilsætte 1 dråbe DAB-koncentrat til 1 mL af DAB-fortyndingsenten, og bland godt. Derefter tilsættes 100-400 μL DAB-blandingen til sektionerne og overvåges nøje med øjet i 2 min, indtil der observeres en acceptabel farvningsintensitet.
BEMÆRK: Sørg for, at sektionen er helt dækket af DAB-blandingen. - Derefter skylles under rindende vand fra hanen i 5 min. Hæmatoxylinfarvning som beskrevet i trin 4.4.3-4.4.5.
- Udfør eosin-Y farvning beskrevet i trin 4.4.6. Udfør dehydreringstrin, der er beskrevet i trin 4.4.7.
- Monteret sektionerne med coverlips ved hjælp af montering medium. Brug ImageJ til at estimere procentdelen af CD31-positivt område (%) i 5 tilfældigt udvalgte felter (40x), der kan betragtes som mikrovaskulær densitet som tidligere beskrevet21.
- Gentag deparaffinerings- og rehydreringstrin 4.4.1-4.4.2. Derefter nedsænkes sektionerne i en beholder med 10 mM natriumcitratbuffer, pH 6, og kog prøven i en mikrobølgeovn.
5. Statistisk analyse
- Brug statistisk analysesoftware til at udtrykke resultaterne som middel ± standardafvigelse og til at udføre umalet t-testpå sammenligningerne. Betragt P < 0,05 for at være statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakteristika for ApoE-/- mus
DLFA-operationer blev udført med succes på 10 mus for at etablere HLI-modellen, og ingen af musene døde efter proceduren. For at følge ændringer i kropsvægten blev mus vejet før DLFA-proceduren (Pre-DLFA) og 7 dage efter DLFA-operationen (Post-DLFA). Pre-DLFA vægte varierede fra 29,6 til 38,0 g (gennemsnit 34,74 ± 2,47 g), og post-DLFA vægte varierede fra 26,5 til 34,1 g (gennemsnit 30,77 ± 2,15 g), som var betydeligt lavere end pre-DLFA vægte (P < 0,05, Figur 3A). Tiden for operationen varierede fra 15 til 47 min (gennemsnit 34,2 ± 8,82 min, ikke inklusive anæstesi tid). Snitstørrelsen i 10 mus varierede fra 3 til 5 mm (gennemsnit 4,2 ± 0,63 mm).
MR-scanning og funktionel gendannelse
MR-scanningerne viste meget klart, at de proksimale og distale regioner i højre fa ikke udviste nogen perfusion (figur 3C), hvilket indikerer, at denne metode er vellykket. En dag efter operationen blev Tarlov Scale-resultaterne signifikant reduceret (P < 0,05). Selv om resultaterne langsomt steg i løbet af de følgende dage, var de stadig lavere end basislinjen indtil dag 7 (P < 0,05, figur 3B). Disse tendenser er i overensstemmelse med tidligere rapporter20. Ingen nekrose eller gangrenous væv udvikling blev observeret i de bilaterale sider af bagbenene af nogen mus. Poterne på de iskæmiske bagben i 7 mus var imidlertid ude af stand til at strække sig naturligt i forhold til den kontralaterale side. Derudover udviste poter i de iskæmiske bagben i 4 mus let misfarvning sammenlignet med den kontralaterale side (Figur 3D).
Histologisk analyse
I HE farvning af den rigtige Gm muskel, myofibers udstillet uregelmæssig iskæmisk nekrose. Spredte satellitceller havde erstattet de nekrotiske myofibre og blev fordelt i en masse og/ eller med uregelmæssig spredning. Myofibers udstillet inflammatorisk infiltration af multinukleated makrofager. Myofibers i de inflammatoriske regioner havde mistet deres normale morfologiske egenskaber, og der var få regenererede myofibre. Tværgående dele af disse regenererede myofibre var runde, cytoplasmaet var farvet rødt, og en lille kerne eller flere kerner var placeret i midten. I modsætning hertil blev denne form for inflammatorisk mønster ikke observeret i venstre Gm (Figur 4). CD31 antistoffarvning blev udført for at identificere endotelceller af fartøjet i Gm prøver, og ImageJ blev brugt til at evaluere CD31-positive område - en surrogat for mikrovaskulær tæthed-i hver af fem synsfelt (40x) for hver prøve. Iskæmiske bagben udviste betydeligt mere mikrovaskulær densitet end den ikke-iskæmiske side (P < 0,05, figur 5).
Figur 1: Udstyr og værktøj, der kræves til forsøget. (A) Dissekeremikroskop og varmepude, der kræves til operationen. (B) Kirurgisk værktøj: 1. 7-0 og 6-0 absorberelige suturer, 2. nåleholder, 3. tandløse pincet, 4. fjedersaks, 5. fine spidse pincet, 6. spidse pincet og 7. kirurgisk saks. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Skematisk illustration af proceduren. (A og D) Der foretages et lille snit på lyskeområdet for at afsløre den proksimale femmoral A, som er ligated. (B og E) En 6-0 sutur bruges til at trække snittet til knæet regionen for at udsætte den distale Femoral A, som er ligated. (C, Fog G) Syninger af snittet. Forkortelser: Lårben A = lårpulsåren; Lårben N = lårbensnerven; Lårben V = lårbensvene. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Pad-musemodellens egenskaber. (A) Sammenligning af kropsvægten før og 7 dage efter DLFA. (B) Funktionel genopretning evalueret af Tarlovskalaen. (C) Magnetisk resonans angiografi angiver den proksimale og distale FA i venstre bagben (hvid pil), og på højre side forsvinder den proksimale og dystre FA. (D) Ændringer i udseendet af mus nr. 2 og nr. 4, 1 og 7 dage efter DLFA. De viste værdier er gennemsnitlige ± standardafvigelse. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; umalet t-test. Forkortelser: PAD = perifer arteriesygdom; DLFA = dobbelt ligation af lårpulsåren; FA = lårpulsåre; L = til venstre; R = højre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: HE farvning af gastrocnemius muskel. (A) Lav forstørrelse billede, der viser HE farvning af højre Gm 7 dage efter DLFA procedure. Inflammation blev observeret i højre Gm. (B) I højre Gm udstillede nekrotiske myofibre inflammatorisk infiltration af makrofager (hvid pil). Muskelfibrene mister deres normale morfologiske egenskaber. Der var meget få regenererede myofibers (sort pil). (C)HE farvning af normale myofibre af højre Gm. (D) Den kontralaterale / venstre Gm (nonischemic) muskel viser en normal histologisk mønster. Skalastænger: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Forkortelser: HE = hæmatoxylin-eosin; DLFA = dobbelt ligation af lårpulsåren; Gm = gastrocnemius; L = til venstre; R= højre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Sammenligning af den mikrovaskulære tæthed af bilaterale gastrocnemiusmuskel. (A) CD31-IHC farvning af højre Gm-sektion (sorte pile). (B) CD31-IHC farvning af venstre Gm sektion (sorte pile). (C) Kvantificering af den mikrovaskulære tæthed i højre side, som var meget mindre end på venstre side. De viste værdier er gennemsnitlige ± standardafvigelse. P < 0,00001; umalet t-test. Skalastænger: A, B = 20 μm. Forkortelser: CD31 = klynge af differentiering 31; IHC = immunohistokemisk; Gm = gastrocnemius. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tarlov-score | 0 | Ingen bevægelse |
| 1 | Knap mærkbar bevægelse, ikke-vægtbærende | |
| 2 | Hyppig bevægelse, ikke-vægtbærende | |
| 3 | Understøtter vægt, delvis vægtbærende | |
| 4 | Gåture med mildt underskud | |
| 5 | Normal men langsom gåtur | |
| 6 | Fuld og hurtig gåtur |
Tabel 1: Funktionel scoring.
Supplerende tabel S1: Resumé af 25 artikler fra den aktuelle litteratur om oprettelsen af PAD-modellen. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse rapporterer en modificeret, forenklet og kirurgisk effektiv tilgang til at etablere en HLI-model i ApoE-/- mus ved hjælp af dobbelt ligation i de proksimale og distale områder i FA gennem et 3-4 mm snit uden nødvendige laboratorieopgraderinger. Hovedkarakteristika for denne metode er indsnitmets mindre størrelse sammenlignet med tidligere rapporterede undersøgelser , der beskriver mus HLI-modellerne8,9,10,11,12,15,20,22,23,24 .
Historisk set er der lavet et snit fra knæet til medierne stramt, lyskeligt eller endda maven for bedre eksponering, der spænder fra 0,5 til 2 cm eller mere9,11,15,19,22,25,26 (opsummeret i supplerende tabel S1). Dette papir beskriver en kirurgisk teknik til at opnå DLFA og som følge heraf HLI, hos mus med et snit < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). FA blev ligated, før det grene i popliteal arterie og saphenous arterie, forårsager iskæmi i flere muskelgrupper i bagben og resulterer i moderat stress hos mus. Selv om mus genvundet funktionelt ved 7th dag efter operationen (Tarlov score dagen før operation 6 ± 0,1. dag efter operationen 3,9 ± 0,99 vs 7th dag efter operationen 5,2 ± 0,92), iskæmiske skader blev observeret i Gm på histologisk niveau. For det første gm i den iskæmiske ben myofibers udstillet uregelmæssig iskæmisk nekrose og blev infiltreret af multinukleated makrofager, svarende til hvad der er blevet rapporteret i PAD patienter27,28. På trods af myofiberatrofi blev der også observeret et par regenererede myofibre, hvilket er i overensstemmelse med en tidligere rapport29. For det andet var den mikrovaskulære tæthed i den iskæmiske Gm den7. dag efter ligationen højere end i det ikke-iskæmiske ben, som også er blevet rapporteret af Ministro et al.30. Det nylige fokus i PAD-terapi er ikke kun begrænset til at øge den mikrovaskulære tæthed sammenlignet med den ikke-iskæmiske side, men også på restaurering af iskæmi-induceret tab af levedygtigt muskelvæv, som understøtter ny fartøjsdannelse ved at give en matrix af vækstfaktorer og biomekanisk støtte31. Således giver denne model også et bredt vindue til at teste effektiviteten af nye behandlinger med disse foci. Desuden passer opnåelsen af HLI med mindre snit med 3R-begrebet dyreforsøg som en raffinement af den kirurgiske procedure, dvs. den lille huds snitstørrelse reducerer traumet og postoperativ smerte.
En ideel dyremodel giver også et relativt langt terapeutisk vindue. Forskellige kirurgiske procedurer for etablering af iskæmi hos mus er blevet rapporteret og anvendt, og de udøver forskellige virkninger på blodgennemstrømning restaurering21. Til induktion af HLI fokuserer kirurgiske metoder normalt på iliaca arterie12,19,23,32, lårpulsåren24,33,34og deres grene11,35, nogle herunder lårbenet vene samt36,37. Da niveauet af vaskulær ligation ikke har nogen effekt på blodgennemstrømningen restaurering, den afgørende faktor er omfanget af skade i vaskulære træ21. For en enkelt ligation af lårpulsåren eller iliaca arterien, et lille snit er lavet i lyske- eller abdominalområdet, mens de andre greninteraktioner stadig opretholdes, og perfusionsgendannelsen i musens bagben genoprettes helt inden for 7 dage21,38. Således er en enkelt ligation ikke tilstrækkelig med hensyn til at give et passende terapeutisk vindue til at teste virkningerne af forskellige behandlinger. Hvis grene fra FA også skal ligated, skal hudsnittet gøres endnu større, hvilket forlænger den kirurgiske tid. Derfor tilbyder HLI by DLFA i mus et passende terapeutisk vindue, hvor forbedringer forårsaget af terapi effektivt kan overvåges9,21,22,25.
Etablering af en klinisk relevant HLI-dyremodel er vigtig for at teste effektiviteten af nye terapeutiske tilgange,dvs. Der er udviklet flere PAD-modeller i mus15,21, rotter39og kaniner40,41. Del Giudice og kolleger etableret en kanin hindlimb iskæmi model skabt af perkutan, transauricular, distal femoral arterie embolisering med kalibrerede partikler, der kan overvinde nogle af begrænsningerne i eksisterende dyremodeller40. Liddell et al.41 skabte også en kanin PAD model ved at spole den overfladiske FA gennem en endovaskulær tilgang, hvilket resulterer i reduceret bagben reperfusion. Selvom større dyr, såsom kaniner, kan give mere overbevisende resultater40,41, tager behandlingerne et skridt tættere på klinisk anvendelse, men de kræver øgede omkostninger og tid til at opnå resultater.
På trods af den heterogene risikoprofil hos de fleste patienter med PAD, herunder arvelige og adfærdsmæssige faktorer42, ApoE- / - udviser mus unormal fedtstofskifte og hyperlipidæmi symptomer, såsom totalt kolesterol, triglycerider, lipoprotein med meget lav densitet og mellemtæthed lipoprotein, der replikerer nogle af de vigtigste egenskaber, der observeres hos patienter med PAD. Desuden øges disse indikatorer betydeligt med den fedtholdige kost. Lo Sasso et al. rapporterede, at i disse mus forekommer arteriel fedtakkumulering ved 3 måneder43år , og at en stigning i AS-læsioner sker med fremskreden alder43. Således er ApoE-/- mus særligt velegnede til den akutte-på-kroniske iskæmi-PAD-model, fordi de generobrer den hypercholesterolemi, der almindeligvis er til stede hos patienter med PAD og giver en passende platform til at evaluere forskellige behandlinger rettet mod at fremme neovascularization af iskæmiske lemmer. Desuden er forholdet mellem pris og ydelse for at teste nye behandlinger med ApoE-/- mus uovervindelig.
På trods af de fordele, der er nævnt i ovenstående afsnit, er der to begrænsninger for denne model. For det første kræver mastering af denne metode, at eksperimentatoren har tilstrækkelig mikrokirurgisk erfaring og kendskab til musens bagbens anatomi. For det andet øger den begrænsede kirurgiske eksponering og mængden af subkutant fedtvæv i bagekstremiteten af ApoE- / - mus de kirurgiske vanskeligheder. Derfor er der behov for en relateret praksis for en vellykket implementering af denne teknik. Afslutningsvis rapporterer denne undersøgelse en modificeret og let at implementere, kirurgisk effektiv tilgang til etablering af en HLI-model i ApoE-/- mus ved hjælp af et lille snit. Det lille snit reducerer traumer for dyret betydeligt og kan anvendes af de fleste forskningsgrupper uden laboratorieopgraderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at artiklen indhold blev komponeret i mangel af nogen kommercielle eller finansielle relationer, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne takker Viktoria Skude, Alexander Schlund og Felix Hörner for den fremragende tekniske support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
