Summary
Bu makale, küçük bir kesi ile farelerde akut iskemi kurmak için etkili bir cerrahi yaklaşım göstermektedir. Bu yaklaşım, laboratuvar yükseltmesi yapılmadan çoğu araştırma grubu tarafından uygulanabilir.
Abstract
Bu çalışmanın amacı, çoğu hayvan laboratuvarında uygulanabilen farelerde akut iskemiyi teşvik etmek için modifiye edilmiş bir cerrahi yaklaşım tanıtmak ve değerlendirmektir. Femoral arterin (DLFA) çift ligasyonu için konvansiyonel yaklaşımın aksine, DLFA yapmak için proksimal femoral arteri (FA) ortaya çıkarmak için sağ kasık bölgesinde daha küçük bir kesi yapıldı. Daha sonra 7-0'lık bir dikiş kullanılarak kesi diz bölgesine sürüklenerek distal FA'yı ortaya çıkardı. Ameliyattan 0, 1, 3, 5 ve 7 gün sonra, arka uzuvların fonksiyonel iyileşmesi tarlov ölçeği kullanılarak görsel olarak değerlendirildi ve derecelendirildi. Histolojik değerlendirme, DLFA'dan 7 gün sonra hayvanlara ötenazi yapıldıktan sonra yapıldı. İşlemler on ApoE-/- farede sağ bacakta başarıyla gerçekleştirildi ve sonraki gözlem sırasında hiçbir fare ölmedi. 10 farenin tamamında kesi boyutları 5 mm'den (4,2 ± 0,63 mm) azdı. MR sonuçları iskemik taraftaki SK kan akışının açıkça tıkandığını gösterdi. Tarlov ölçeği sonuçları, işlemden sonra arka eks uzuv fonksiyonlarının önemli ölçüde azaldığını ve takip eden 7 gün boyunca yavaşça iyileştiğini göstermiştir. Histolojik değerlendirmede iskemik tarafta anlamlı bir inflamatuar yanıt ve iskemik arka ektremitede mikrovasküler yoğunlukta azalma saptadı. Sonuç olarak, bu çalışma DLFA kullanarak arka ekstrepsiyon iskemisini (HLI) gerçekleştirmek için minyatür bir kesi kullanarak değiştirilmiş bir teknik tanıtmaktadır.
Introduction
Periferik arter hastalığı (PAD) gibi damar hastalıklarında araştırma için klinik öncesi hayvan modellerinin karşılanmamış bir ihtiyacı vardır. Tanı ve tedavideki ileri gelişmelere rağmen, 2018'de 200 milyondan fazla PAD hastası vardı1ve sayıları sürekli artmaktadır. Çeşitli yeni terapötik yaklaşımlar2,3,4,5,6,7 tanımlanmış olsada,bu terapötik yöntemlerin klinik uygulamaya başarılı bir şekilde çevrilmeleri göz korkutucu bir görev olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, pad6,7tedavi etmek için bu yeni terapötik yaklaşımların potansiyel mekanizmasını ve verimliliğini araştırmak için insan hastalığı durumunu simüle eden güvenilir ve ilgili in vivo deneysel modeller gereklidir.
Hiperlipidemi ve ateroskleroz (AS) PAD gelişimi için başlıca risk faktörleridir. ApoE-/- fareler (yüksek yağlı bir diyette) anormal yağ metabolizması ve hiperlipidemi gösterir ve daha sonra klinik olarak ilgili PAD'i simüle etmek için en iyi seçim olarak ApoE-/- fareleri işleyen aterosklerotik plaklar geliştirir. Preklinik HLI hayvan modelleri, tüm dünyadaki laboratuvarlarda en yaygın kullanılan yaklaşım olan femoral arterin (DLFA) çift ligasyonu yoluyla üretilir8, 9,10,11,12,13,14,15 akut-kronik iskemiyi simüle etmek için. Bununla birlikte, bu yaklaşım genellikle nispeten büyük ve invaziv bir kesi gerektirir. Ayrıca, kaçınılmaz olarak hayvanlara (özellikle farelere) artan ağrı yaralanması ve iltihaplanmadan muzdariptir, bu da sonraki deneysel sonuçları etkiler 5,6,16,17. Bu makalede, APOE-/- farelerde akut-kronik HLI modeli çok küçük bir kesi kullanılarak açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Tüm deneysel prosedürler EC 2010/63/EU kılavuzuna göre gerçeklenmiş ve yerel Alman mevzuatı tarafından onaylanmıştır (35-9185.81/G[1]239/18). C57BL/6J arka planı 29.6-38.0 g ağırlığındaki on erkek ApoE-/- fare, 12 saat açık / karanlık bir döngüde barındırıldı ve 8 haftalıktan itibaren 12 hafta boyunca batı diyeti (% 1.25 kolesterol ve% 21 yağ) ve su reklam libitum ile beslendi. HLI, aşağıda açıklandığı gibi 20 haftalık fareler üzerinde gerçekleştirildi.
1. ApoE'de HLI İndüksiyonu-/- fareler
- Ameliyat için gerekli ekipman ve aletleri hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1). Kullanmadan önce cerrahi aletleri otoklavlama ile sterilize edin ve operasyon sırasında cam Boncuk Sterilizatörü kullanın.
- Fareyi tüm cerrahi işlemlerden önce midazolam (5 mg/kg), metetomidin (0,05 mg/ml/kg) ve fentanil (0,5 mg/kg) karışımından deri altı enjeksiyonu (S.C.) ile uyuşturun.
- Anestezinin başlangıcından sonra, kuruluğu önlemek için gözlerdeki veteriner merhemini kullanın ve ön ayak ve arka uzuvda pedal çekme refleksinin yokluğunu onaylayın.
- Daha sonra, çekirdek vücut sıcaklığını yaklaşık 37 ° C'de tutmak için fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin. Pamuklu çubuklar ve epilasyon kremi kullanarak, sağ taraftaki arka uzuv derisinden saçları dikkatlice çıkarın.
NOT: Epilasyon kremi, başta kesi yapılacak kasık bölgesi olmak üzere arka kırığı örtecek miktarda kullanılmalıdır. Epilasyon kremi 3 dakikadan kısa bir süre kullanılmalı ve daha sonra 2 ila 3 kez nemlendirilmiş pamuklu çubuklarla çıkarılmalıdır. - Fareyi, bir diseksiyon mikroskobu altında ısıtma yastığı üzerindeki supine konumuna yerleştirin. Farenin cildini dezenfekte etmek için bir cilt antiseptiği kullanın (Malzeme Tablosunabakın). Daha sonra kasık bölgesinin ortasında yaklaşık 3-4 mm'lik bir kesi yapmak için sivri uçlu ve cerrahi makas kullanın. Yordamın şeması için Şekil 2'ye bakın.
- Proksimal femoral nörovasküler demetini ortaya çıkarmak için ince sivri tokmaklar yardımıyla deri altı yağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Femoral kılıfın zarını delmek için ince sivri tokmakları dikkatlice kullanın. Femoral arteri (FA) femoral sinir (FN) ve femoral damardan (FV) dikkatlice uzaklaştırmak için salin ile nemlendirilmiş bir pamuklu çubuk kullanın.
- Proksimal SK'dan iki adet 7-0 emilebilir dikiş geçirin ve iki bağ arasında FA'yı transekte etmek için yay makası kullanarak çift düğüm yapın.
- Distal FA'yı ortaya çıkarmak için, kesiğin alt kenarından 7-0 emilebilir bir dikiş geçirin ve kesiği yavaşça arka uzvun dizininin sağ tarafının bölgesine sürükleyin.
- Nörovasküler demeti açığa çıkarmak için deri altı dokusunu dikkatlice bir kenara hareket ettinin. Femoral kılıfın zarını delmek için ince sivri kanatlar kullanın ve FA'yı FV ve FN'den parçalara alın.
- Distal FA'dan iki adet 7-0 emilebilir dikiş geçirin ve çift düğüm yapın. İki bağ arasındaki SK'yı geçirmek için yay makası kullanın.
NOT: Sol uzuvda her farede kontrol görevi gören ligasyon yapılmadı. - Daha sonra, kesiği dikmek için 6-0 emilebilir dikiş kullanın. Fareyi temiz bir kafeste bir ısıtma yastığına yerleştirin ve iyileşene kadar hayati parametrelerini izlemeye devam edin. Ameliyat sonrası analjezikler sağlayın: Buprenorfin s.c. (48 saat boyunca her 8 saatte bir 0,1 mg/kg vücut ağırlığı). Operasyondan 48 saat sonra, içme suyunda metamizol sürün (24 mg/5mL su günlük 4 kez 200 mg/kg'lık bir doza karşılık gelir).
2. Manyetik rezonans görüntüleme
NOT: DLFA'dan bir gün sonra, fareler FA tıkanıklıkını değerlendirmek için MRI taramalarından geçmelidir.
- Fareyi şeffaf bir indüksiyon odasına yerleştirin ve sağ refleks kaybına kadar fareyi ortam havasında% 1,5-2 izofluran ile uyuşturun.
- Fareyi bir ısırık tutucu ile donatılmış ve lazer kontrollü bir sistemle mıknatısa doğru yerleştirilmiş ısıtmalı bir hayvan yatağına yerleştirin. Vücut sıcaklığını 37±1 °C'de koruyun.
- Görüntü alımı sırasında, ortam havasında% 1,5-2 izofluran ile anesteziyi koruyun ve bir basınç probu kullanarak solunumu izleyin.
- Parametre yankı süresi (TE)/tekrarlama süresi (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13° ile üç boyutlu (3D) uçuş süresi (TOF) anjiyografi dizisi kullanarak enine dilim oryantasyonunda görüntüler elde edin, dört ortalama, 178 x 144'lük bir alım matrisi 256 x 192 ve 121 dilime yeniden inşa edildi ve 0,15 mm3izotropik çözünürlük elde edildi. Damarlardan gelen sinyali bastırmak için, arka uzuvlara distal olarak bir doygunluk dilimi yerleştirin.
3. Klinik değerlendirme ve takip
- Fonksiyonel puanlama Tarlov ölçeği 18 ,19(Tablo1)kullanarak ameliyattan sonraki1 st, 3rd,5. ve7.
4. Histolojik değerlendirme
- Ameliyattan yedi gün sonra, fareleri ötenazi yapmak için pentobarbital enjeksiyon (115 mg / kg) uygulayın.
- Sol kardiyak ventrikülden (fare başına 100 mL) %1 paraformaldehit (PFA) içeren fosfat tamponlu salin (PBS) kullanın. Farelerin bilateral gastrocnemius'unu (Gm) 4 °C'de bir gecede% 4 PFA'da sabitle.
- Örneği daha önce açıklanan protokol20'yegöre parafin içine gömün.
- Parafin gömülü doku bloğunun 4-5 μm kalınlığındaki bölümlerini bir mikrotom üzerinde kesin. Yuvarlak bir boya fırçası yardımıyla, kesilen doku bölümlerini 42°C'de tutulan su banyosuna yerleştirin.
- Mikroskop kaydıramasını 45° açıyla suya yerleştirin ve toplanacak bölüm grubunun altına dikkatlice yerleştirin.
- Kaydırağı sudan dikkatlice kaldırın ve bölümlerin kaydırağa takılmasını ve tezgah üstü inkübatörde 37 °C'de bir gecede kurumasını bekleyin.
- Parafin bölümlerinin hematoksilin/eozin (HE) lekesini gerçekleştirin.
- Bölümleri içeren slaytları slayt tutucularına yerleştirin. 3 kap taze ksilen hazırlayın ve bölümlerin ayrıştırıcısı için slaytları her kaba 5 dakika yerleştirin.
- Dilimleri art arda% 96,% 80,% 70, % 50, % 30 etanol ve her biri 5 dakika boyunca deiyonize suya batırarak bölümleri yeniden sulandırın.
- Hematoksilin çözeltisinde 10 dakika leke.
- Dilimleri bir deiyonize su kabına aktarın ve 5 dakika boyunca akan musluk suyunun altına yerleştirerek durulayın.
- Mikroskop kullanarak hematoksilin lekelemenin yoğunluğunu kontrol edin. Lekeleme hücre çekirdeğinin net bir şekilde tanımlanmasını sağlıyorsa, bir sonraki adıma geçin. Lekeleme yoğunluğu hücre çekirdeklerinin tanımlanmasını kolaylaştırmazsa veya lekeleme yoğunluğu zayıfsa, kaydırağı hematoksilin çözeltisine 1 dakika yerleştirin, yıkamayı suyla tekrarlayın (adım 4.4.4) ve sonra tekrar kontrol edin.
- 5 dakika boyunca eosin-Y çözeltisinde karşı çekim.
- Dilimleri ardışık olarak deiyonize su ve% 30, % 50, % 70, % 80 ve% 96 etanol içeren kaplara her biri 10 s süre boyunca art arda daldırarak bölümleri susuzlaştırın. Ardından, bölümleri her biri 10 s için üç taze ksilen kabına sırayla yerleştirin.
- Slaytları yatay olarak mikroskobik slayt depolama haritalarına, bölümleri yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Slayda yeterli montaj ortamı ekleyin ve slaytları kapak örtüleriyle monte edin.
- Parafin bölümlerinin immünohistokimyasal (IHC) lekelerini gerçekleştirin.
- Deparaffinizasyon ve rehidrasyon adımlarını 4.4.1-4.4.2 tekrarlayın. Ardından, bölümleri 10 mM sodyum sitrat tamponu, pH 6 olan bir kaba daldırın ve numuneyi mikrodalga fırında kaynatın.
NOT: Numunelerin aşırı veya az ısıtılması tutarsız lekelere neden olabileceğinden, sıcaklığı kaynama noktasının hemen altında 10 dakika boyunca koruyun. - Ardından, bir tezgah tepesindeki bölümleri 30 dakika soğutun. Daha sonra, bölümleri PBS'de 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Numunenin etrafındaki alanı dikkatlice kurulayın ve hidrofobik bir kalem kullanarak numunenin etrafına büyük bir daire çizin. .
NOT: Örneğe asla dokunmayın. Hidrofobik bir kalemle işaretleme, daha küçük hacimli bir antikor çözeltisinin kullanımını kolaylaştıran hidrofobik bir sınır oluşturur. - Bölümü PBS'de %0,3 H 2 O2'ye10 dk yerleştirerek endojen peroksidaz aktivitesini söndürün. Nemlendirilmiş bir odada oda sıcaklığında 1 saat boyunca 400 μL blok tamponlu blok bölümleri (PBS% 3 sığır serum albümini ve% 0.3 iyonik olmayan deterjan içerir).
- PBS'deki bölümleri 5 dakika yıkayın. Ardından, bölümü kapsayacak kadar 100-400 μL seyreltilmiş anti-CD31 antikor (1:250) ekleyin. Bunu takiben, bölümleri nemlendirilmiş bir odada 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
NOT: Bölümün tamamen antikor çözeltisi ile kaplasağından emin olun. - Birincil antikoru çıkarın ve bölümleri PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- DAB seyrelticinin 1 mL'sine 1 damla DAB konsantresi ekleyerek 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) karışımını hazırlayın ve iyice karıştırın. Daha sonra, bölümlere 100-400 μL DAB karışımı ekleyin ve kabul edilebilir bir lekelenme yoğunluğu gözlenene kadar 2 dakika boyunca yakından izleyin.
NOT: Bölümün tamamen DAB karışımı ile kaplı olduğundan emin olun. - Daha sonra, akan musluk suyunun altında 5 dakika durulayın. 4.4.3-4.4.5 adımlarında açıklandığı gibi hematoksilin lekeleme gerçekleştirin.
- Adım 4.4.6'da açıklanan eosin-Y boyamayı gerçekleştirin. 4.4.7 adımında açıklanan dehidrasyon adımlarını gerçekleştirin.
- Montaj ortamı kullanılarak bölümleri kapak örtüleri ile monte etti. Daha önce açıklandığı gibi mikrovasküler yoğunluk olarak kabul edilebilen rastgele seçilmiş 5 alanda (40x) CD31 pozitif alanının yüzdesini (%) tahmin etmek için ImageJ'yikullanın.
- Deparaffinizasyon ve rehidrasyon adımlarını 4.4.1-4.4.2 tekrarlayın. Ardından, bölümleri 10 mM sodyum sitrat tamponu, pH 6 olan bir kaba daldırın ve numuneyi mikrodalga fırında kaynatın.
5. İstatistiksel analiz
- Sonuçları standart sapmanın ortalaması olarak ifade etmek ± karşılaştırmalar üzerinde eşleşmemiş t-test gerçekleştirmek için istatistiksel analiz yazılımını kullanın. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olduğunu düşünün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ApoE-/- farelerin özellikleri
DLFA ameliyatları HLI modelini oluşturmak için 10 fare üzerinde başarıyla yapıldı ve işlemden sonra farelerin hiçbiri ölmedi. Vücut ağırlığındaki değişiklikleri takip etmek için, fareler DLFA prosedüründen önce (Pre-DLFA) ve DLFA ameliyatından 7 gün sonra (Post-DLFA) tartıldı. DLFA öncesi ağırlıklar 29,6 ila 38,0 g (ortalama 34,74 ± 2,47 g) ve DLFA sonrası ağırlıklar 26 g arasında değişmektedir. DLFA öncesi ağırlıklardan önemli ölçüde daha düşük olan 5 ila 34,1 g (ortalama 30,77 ± 2,15 g),(P < 0,05, Şekil 3A). Ameliyat süresi 15 ila 47 dk arasında değişmektedir (anestezi süresi dahil değil, 34,2 ± 8,82 dk). 10 faredeki kesi boyutu 3 ila 5 mm (ortalama 4,2 ± 0,63 mm) arasında değişmektedir.
MRI taraması ve fonksiyonel kurtarma
MRI taramaları çok açık bir şekilde sağ SK'nın proksimal ve distal bölgelerinde perfüzyon olmadığını göstermiştir (Şekil 3C), bu yöntemin başarısını göstermektedir. Ameliyattan bir gün sonra Tarlov Ölçeği sonuçları önemli ölçüde azaldı(P < 0.05). Sonuçlar sonraki günlerde yavaşça artsa da, 7. güne kadar taban çizgisine göre hala daha düşüktü(P < 0.05, Şekil 3B). Bu eğilimler önceki raporlarla tutarlı20. Herhangi bir farenin arka uzuvlarının bilateral taraflarında nekroz veya kangrenöz doku gelişimi gözlenmedi. Bununla birlikte, 7 faredeki iskemik arka uzuvların pençeleri, kontralteral tarafa kıyasla doğal olarak esneyemedi. Ek olarak, 4 faredeki iskemik arka uzuvların pençeleri kontralateral tarafa kıyasla hafif renk değişikliği gösterdi (Şekil 3D).
Histolojik analiz
Sağ Gm kasının HE lekelemesinde, miyofiberler düzensiz iskemik nekroz gösterdi. Çoğalma uydu hücreleri nekrotik miyoberlerin yerini almıştı ve bir kütle içinde ve/veya düzensiz dağılımla dağılmıştı. Myofibers çok fonksiyonlu makrofajlarla enflamatuar infiltrasyon sergiledi. enflamatuar bölgelerdeki miyofiberler normal morfolojik özelliklerini kaybetmişti ve çok az sayıda yenilenmiş miyofiber vardı. Bu yenilenen miyofiberlerin enine bölümleri yuvarlak, sitoplazma kırmızıya boyanmış ve merkezde küçük bir çekirdek veya birden fazla çekirdek bulunuyordu. Buna karşılık, sol Gm'de bu tür enflamatuar desen gözlenmedi (Şekil 4). GM örneklerinde damarın endotel hücrelerini tanımlamak için CD31 antikor lekelemesi yapıldı ve ImageJ, her örnek için beş görüş alanının (40x) her birinde mikrovasküler yoğunluk için bir taşıyıcı olan CD31 pozitif alanı değerlendirmek için kullanıldı. İskemik arka uzuvlar iskemik olmayan tarafa göre önemli ölçüde daha fazla mikrovasküler yoğunluk sergiler(P < 0.05, Şekil 5).
Şekil 1: Deney için gerekli ekipman ve aletler. (A) Ameliyat için gerekli mikroskop ve ısıtma yastığının diseksiyon. (B) Cerrahi aletler: 1. 7-0 ve 6-0 emilebilir dikişler, 2. iğne tutucu, 3. dişsiz kürsüler, 4. yay makası, 5. ince sivrips, 6. sivrips ve 7. cerrahi makas. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Prosedürün şematik illüstrasyonu. (A ve D) Kasık bölgesine, lige edilmiş proksimal femoral A'yı ortaya çıkarmak için küçük bir kesi yapılır. (B ve E) 6-0'lık bir dikiş, kesiği diz bölgesine sürüklemek için kullanılır ve lige giren distal Femoral A'yı ortaya çıkarır. (C, Fve G) Kesiğin dikişi. Kısaltmalar: Femoral A = femoral arter; Femoral N = femoral sinir; Femoral V = femoral damar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PAD fare modelinin özellikleri. (A) DLFA'dan önce ve 7 gün sonra vücut ağırlığının karşılaştırılması. (B) Tarlov Ölçeği ile değerlendirilen fonksiyonel iyileşme. (C) Manyetik rezonans anjiyografisi sol arka ekstremitedeki proksimal ve distal FA'yı (beyaz ok) gösterir ve sağ tarafta proksimal ve distal FA kaybolur. (D) DLFA'dan 2 ve No.4, 1 ve 7 gün sonra farelerin bilateral arka uzvu görünümünde değişiklikler. Gösterilen değerler standart sapma ± ortalamadır. *P < 0.05, ** P < 0.001, *** P < 0.0001, **** P < 0.00001; eşleşmeyen t-test. Kısaltmalar: PAD = periferik arter hastalığı; DLFA = femoral arterin çift ligasyonu; FA = femoral arter; L = sol; R = sağ. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Gastroknemius kasının boyanması. (A) DLFA işleminden 7 gün sonra sağ Gm'nin HE lekelenmesini gösteren düşük büyütme görüntüsü. Sağdaki gm. (B) Sağ Gm'de inflamasyon gözlendi, nekrotik miyoberler makrofajlar (beyaz ok) ile enflamatuar infiltrasyon gösterdi. Kas lifleri normal morfolojik özelliklerini kaybeder. Çok az sayıda yenilenmiş miyofiber (siyah ok) vardı. (C) Sağ Gm'nin normal miyofiberlerinin lekelenişi(D) Kontraseteral/sol Gm (noniskemik) kas normal bir histolojik patik gösterir. Ölçek çubukları: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Kısaltmalar: HE = hematoksilin-eosin; DLFA = femoral arterin çift ligasyonu; Gm = gastrocnemius; L = sol; R= doğru. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: bilateral gastrocnemius kasının mikrovasküler yoğunluğunun karşılaştırılması. (A) SAĞ GM bölümünün CD31-IHC boyanma (siyah oklar). (B) SOL GM bölümünün CD31-IHC boyanma (siyah oklar). (C) Sol taraftakinden çok daha az olan sağ tarafın mikrovasküler yoğunluğunun ölçülmesi. Gösterilen değerler standart sapma ± ortalamadır. P < 0.00001; eşleşmeyen t-test. Ölçek çubukları: A, B = 20 μm. Kısaltmalar: CD31 = farklılaşma kümesi 31; IHC = immünohistokimyasal; Gm = gastrocnemius. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Tarlov Skoru | 0 | Hareket yok |
| 1 | Zar zor algılanabilir hareket, ağırlıksız taşıma | |
| 2 | Sık hareket, ağırlıksız yatak | |
| 3 | Ağırlık, kısmi ağırlık rulmanı destekler | |
| 4 | Hafif açık ile yürüyüşler | |
| 5 | Normal ama yavaş yürüme | |
| 6 | Tam ve hızlı yürüyüş |
Tablo 1: İşlevsel Puanlama.
Ek Tablo S1: PAD modelinin kurulmasına ilişkin güncel literatürden 25 makalenin özeti. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, gerekli laboratuvar yükseltmeleri yapılmadan 3-4 mm'lik bir kesi yoluyla SK'nın proksimal ve distal bölgelerinde çift ligasyon kullanarak ApoE-/- farelerde HLI modeli oluşturmak için modifiye edilmiş, basitleştirilmiş ve cerrahi olarak verimli bir yaklaşım bildirmektedir. Bu yöntemin temel özelliği, fare HLI modellerini açıklayan daha önce bildirilen çalışmalara kıyasla kesiğin daha küçük boyutudur 8 ,9,10,11,12,15,20,22,23,24 .
Tarihsel olarak, daha iyi pozlama için dizden medyaya sıkı, kasık ve hatta karın için 0,5 ila 2 cm veya daha fazla 9 , 11 ,15 ,19,22,25,26 (Ek Tablo S1'deözetlenmiştir) arasında bir kesi yapılmıştır. Bu makalede, DLFA ve sonuç olarak HLI, 5 mm (4,2 ± 0,63 mm) kesi olan farelerde < cerrahi bir teknik açıklanmaktadır. FA, popliteal artere ve saphenöz artere daldan önce lige edildi, arka uzuvdaki birkaç kas grubunda iskemiye neden oldu ve farelerde orta strese neden oldu. Fareler operasyon sonrası7. gün fonksiyonel olarak iyileşmiş olsa da (Tarlov skoru operasyondan 6 ± 0, operasyondan 1gün sonra 3.9 ± 0.99 ile 7. gün operasyondan 5.2 ± 0.92) sonraGm'de histolojik düzeyde iskemik hasar gözlendi. İlk olarak, iskemik bacak myofibers gm düzensiz iskemik nekroz sergiledi ve PAD hastalarında bildirilene benzer şekilde çok yönlü makrofajlar tarafından sızıldı27,28. Miyober atrofisine rağmen, önceki bir rapora uygun olan birkaç rejenere miyober de gözlendi29. İkincisi, ligasyondan sonraki 7. günde iskemikGm'deki mikrovasküler yoğunluk, Ministro ve ark.30tarafından da bildirilen iskemik olmayan bacaktan daha yüksekti. PAD tedavisindeki son odak noktası sadece iskemik olmayan tarafa kıyasla mikrovasküler yoğunluğu artırmakla sınırlı değildir, aynı zamanda büyüme faktörleri ve biyomekanik destek matrisi sağlayarak yeni damar oluşumunu destekleyen iskemi kaynaklı canlı kas dokusu kaybının restorasyonu üzerinedir31. Böylece, bu model aynı zamanda bu odaklarla yeni tedavilerin etkinliğini test etmek için geniş bir pencere sağlar. Ayrıca, daha küçük kesi ile HLI'ya ulaşmak, cerrahi prosedürün bir inceliği olarak 3R hayvan deneyi kavramına uyar, yani küçük cilt kesi büyüklüğü travmayı ve ameliyat sonrası ağrıyı azaltır.
İdeal bir hayvan modeli de nispeten uzun bir terapötik pencere sağlar. Farelerde iskemi kurmak için çeşitli cerrahi prosedürler rapor edilmiş ve uygulanmıştır ve kan akışı restorasyonu üzerinde farklı etkiler uygularlar21. HLI indüksiyonu için cerrahi yöntemler normalde iliak arter12,19,23,32, femoral arter24,33,34ve dalları11,35, bazıları femoral damar da dahil olmak üzere 36,37. Vasküler ligasyon seviyesinin kan akışı restorasyonu üzerinde hiçbir etkisi olmadığından, karar veren faktör vasküler ağaçtaki yaralanmanın boyutudur21. Femoral veya iliak arterin tek bir ligasyonu için, kasık veya karın bölgesinde küçük bir kesi yapılırken, diğer dal etkileşimleri hala korunur ve fare arka uzvundaki perfüzyon restorasyonu 7 gün içinde tamamen iyileşir21,38. Bu nedenle, farklı tedavilerin etkilerini test etmek için uygun bir terapötik pencere sağlamak açısından tek bir ligasyon yeterli değildir. FA'dan dalların da bağlanması gerekiyorsa, cilt kesisi daha da büyük hale getirilmelidir, bu da cerrahi süreyi uzatır. Bu nedenle, farede DLFA tarafından HLI, tedavinin neden olduğu iyileştirmelerin verimli bir şekilde izlenebileceği uygun bir terapötik pencere sunar9,21,22,25.
Klinik olarak ilgili bir HLI hayvan modeli oluşturmak, PAD2,3,4 için hücre, kök hücre veya gen tedavisi gibi yeni terapötik yaklaşımların verimliliğini test etmek içinönemlidir. Farelerde çeşitli PAD modelleri geliştirilmiştir15,21, sıçanlar39ve tavşanlar40,41. Del Giudice ve meslektaşları, mevcut hayvan modellerinin bazı sınırlamalarının üstesinden gelebilecek kalibre edilmiş parçacıklarla perkütan, transauriküler, distal femoral arter embolizasyonu tarafından oluşturulan bir tavşan hindlimb iskemi modelikurdular 40. Liddell ve ark.41 ayrıca yüzeysel FA'yı endovasküler bir yaklaşımla sarmalayarak bir tavşan PEDİ modeli oluşturdu ve bu da arka eksüs reperfüzyonunu azalttı. Tavşanlar gibi daha büyük hayvanlar daha ikna edici sonuçlar verse de40,41Tedavileri klinik uygulamaya bir adım daha yaklaştırarak, ancak sonuç almak için daha fazla maliyet ve zaman gerektirirler.
Kalıtsal ve davranışsal faktörlerdedahil olmak üzere PAD'li çoğu hastanın heterojen risk profiline rağmen, ApoE-/- fareler, PAD'li hastalarda gözlenen bazı ana özellikleri çoğaltan total kolesterol, trigliseritler, çok düşük yoğunluklu lipoprotein ve orta yoğunluklu lipoprotein gibi anormal yağ metabolizması ve hiperlipidemi semptomları gösterir. Ayrıca, yüksek yağlı diyet ile bu göstergeler önemli ölçüde artar. Lo Sasso ve ark. bu farelerde arteriyel yağ birikiminin 3 aylık43yaşında meydana geldiğini ve ilerleyen yaş43ile as lezyonlarında bir artış meydana geldiğini bildirdi. Bu nedenle, ApoE-/- fareler özellikle akut-kronik iskemi-PAD modeli için uygundur, çünkü PAD'li hastalarda yaygın olarak bulunan hiperkolesterolemiyi yeniden kapsüllerler ve iskemik uzuvların neovaskülerizasyonunu teşvik etmeyi amaçlayan çeşitli tedavileri değerlendirmek için uygun bir platform sağlarlar. Ayrıca, ApoE-/- farelerle yeni tedavilerin test edilerek fiyat-performans oranı rakipsizdir.
Yukarıdaki paragraflarda belirtilen avantajlara rağmen, bu modelde iki sınırlama vardır. İlk olarak, bu yöntemde ustalaşmak, deneycinin yeterli mikrocerrahi deneyime ve fare arka uzvun anatomisine aşina olmasını gerektirir. İkincisi, ApoE-/- farelerin arka ekstremiteslerindeki sınırlı cerrahi maruziyet ve deri altı yağ dokusu miktarı cerrahi zorluğu arttırır. Bu nedenle, bu tekniğin başarılı bir şekilde uygulanması için ilgili bazı uygulamalar gereklidir. Sonuç olarak, bu çalışma küçük bir kesi kullanarak ApoE-/- farelerde bir HLI modeli oluşturmak için modifiye edilmiş ve uygulanması kolay, cerrahi olarak verimli bir yaklaşım bildirmektedir. Küçük kesi, hayvandaki travmayı önemli ölçüde azaltır ve çoğu araştırma grubu tarafından herhangi bir laboratuvar yükseltmesi olmadan uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, makale içeriğinin potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda oluştuğunu beyan eder.
Acknowledgments
Yazarlar Viktoria Skude, Alexander Schlund ve Felix Hörner'e mükemmel teknik destek için teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
