Summary
Denne artikkelen demonstrerer en effektiv kirurgisk tilnærming for å etablere akutt iskemi hos mus med et lite snitt. Denne tilnærmingen kan brukes av de fleste forskningsgrupper uten laboratorieoppgraderinger.
Abstract
Hensikten med denne studien er å introdusere og evaluere en modifisert kirurgisk tilnærming for å indusere akutt iskemi hos mus som kan implementeres i de fleste dyrelaboratorier. I motsetning til den konvensjonelle tilnærmingen for dobbel ligasjon av lårarterien (DLFA), ble det gjort et mindre snitt på høyre inguinal region for å utsette den proksimale lårarterien (FA) for å utføre DLFA. Deretter, ved hjelp av en 7-0 sutur, ble snittet dratt til kneområdet for å avsløre den distale FA. Magnetisk resonansavbildning (MR) på bilaterale bakre lemmer ble brukt til å oppdage FA-okklusjon etter operasjonen. Ved 0, 1, 3, 5 og 7 dager etter operasjonen ble funksjonell gjenoppretting av bakre lemmer visuelt vurdert og gradert ved hjelp av Tarlov-skalaen. Histologisk evaluering ble utført etter euthanizing dyrene 7 dager etter DLFA. Prosedyrene ble utført på høyre ben i ti ApoE-/- mus, og ingen mus døde under etterfølgende observasjon. Snittstørrelsene i alle de 10 musene var mindre enn 5 mm( 4,2 ± 0,63 mm). MR-resultater viste at FA-blodstrømmen i den iskemiske siden var tydelig blokkert. Tarlov-skalaresultatene viste at bakre lemfunksjon ble betydelig redusert etter prosedyren og sakte gjenopprettet i løpet av de neste 7 dagene. Histolog evaluering viste en betydelig inflammatorisk respons på den iskemiske siden og redusert mikrovaskulær tetthet i den iskemiske bakre lemmen. Til slutt introduserer denne studien en modifisert teknikk ved hjelp av et miniatyr snitt for å utføre bakre lem iskemi (HLI) ved hjelp av DLFA.
Introduction
Det er et udekket behov for prekliniske dyremodeller for forskning på vaskulære sykdommer som perifer arteriesykdom (PAD). Til tross for den avanserte utviklingen i diagnose og behandling, var det mer enn 200 millioner pasienter med PAD i 20181, og antallet øker stadig. Selv om flere nye terapeutiske tilnærminger2,3,4,5,6,7 har blitt beskrevet, er vellykket oversettelse av disse terapeutiske modalitetene til klinisk anvendelse fortsatt en skremmende oppgave. Derfor er pålitelige og relevante in vivo eksperimentelle modeller som simulerer den menneskelige sykdomstilstanden nødvendig for å undersøke den potensielle mekanismen og effektiviteten til disse nye terapeutiske tilnærmingene for å behandle PAD6,7.
Hyperlipidemi og aterosklerose (AS) er de viktigste risikofaktorene for utvikling av PAD. ApoE-/- mus (på et fettrikt kosthold) viser unormal fettmetabolisme og hyperlipidemi og utvikler deretter aterosklerotiske plakk som gjør ApoE-/- mus som det beste valget for å simulere den klinisk relevante PAD. Prekliniske HLI dyremodeller genereres gjennom dobbel ligasjon av lårarterien (DLFA), som er den mest brukte tilnærmingen i laboratorier over hele verden8,9,10,11,12,13,14,15 for å simulere akutt-på-kronisk iskemi. Imidlertid krever denne tilnærmingen vanligvis et relativt stort og invasivt snitt. Videre fører det uunngåelig til at dyrene (spesielt musene) lider av økt smerteskade og betennelse, noe som også påvirker de påfølgende eksperimentelle resultatene5,6,16,17. Dette dokumentet beskriver en akutt-på-kronisk HLI-modell i APOE-/- mus ved hjelp av et svært lite snitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til EF-retningslinjen EF 2010/63/EU og er godkjent av den lokale tyske lovgivningen (35-9185.81/G[1]239/18). Ti mannlige ApoE-/- mus med C57BL /6J bakgrunn, veier 29,6-38,0 g, ble plassert på en 12 timers lys / mørk syklus og matet et vestlig kosthold (1,25% kolesterol og 21% fett) og vann ad libitum i 12 uker fra en alder av 8 uker. HLI ble utført på 20 uker gamle mus som beskrevet nedenfor.
1. Induksjon av HLI i ApoE-/- mus
- Klargjør nødvendig utstyr og verktøy for kirurgi (se materialtabellen og figur 1). Steriliser de kirurgiske instrumentene ved autoklavering før bruk og bruk en glassperlesterilisator under bruk.
- Bedøv musen med en subkutan injeksjon (S.C.) av en blanding av midazolam (5 mg/kg), medetomidin (0,05 mg/ml/kg) og fentanyl (0,5 mg/kg) før alle kirurgiske prosedyrer.
- Etter anestesi, bruk veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet, og bekreft fraværet av pedaluttaksrefleksen i forbenet og bakre lem.
- Deretter plasserer du musen på en varmepute for å holde kroppstemperaturen på ca. 37 °C. Bruk bomullspinne og hårfjerningskrem, fjern forsiktig håret fra bakre lemhud på høyre side.
MERK: Hårfjerningskremen bør brukes i tilstrekkelig mengde til å dekke bakbenet, spesielt inngangsregionen der snittet skal gjøres. Hårfjerningskremen skal brukes i en varighet på mindre enn 3 minutter og bør deretter fjernes med fuktede bomullspinne 2 til 3 ganger. - Legg musen i liggende stilling på varmeputen under et dissekeringsmikroskop. Bruk et antiseptisk hud (se materialtabellen) for å desinfisere musens hud. Etterpå bruker du spisse tang og kirurgisk saks for å lage et ca. 3-4 mm snitt midt i inngangsregionen. Se figur 2 hvis du vil ha et skjema for prosedyren.
- Fjern det subkutane fettvevet nøye ved hjelp av fine spisse tang for å eksponere den proksimale lårbens nevrovaskulære bunten. Bruk forsiktig de fine spisse tangene til å gjennombore membranen på lårhylsen. Bruk en bomullspinne fuktet med saltvann for å flytte lårarterien (FA) forsiktig bort fra lårnerven (FN) og lårbenet (FV).
- Pass to 7-0 absorberbare suturer gjennom den proksimale FA, og lag doble knuter ved hjelp av vårsaks for å transektere FA mellom de to båndene.
- For å eksponere den distale FA, send en 7-0 absorberbar sutur gjennom den nedre kanten av snittet og dra forsiktig snittet til regionen på høyre side av kneet på bakre lem.
- Flytt det subkutane vevet forsiktig til side for å eksponere nevrovaskulær bunt. Bruk fine spisse tang for å gjennombore membranen på lårhylsen, og disseker FA fra FV og FN.
- Pass to 7-0 absorberbare suturer gjennom den distale FA, og lag doble knuter. Bruk vårsaks for å transektere FA mellom de to båndene.
MERK: Ingen ligation ble utført på venstre lem, som fungerte som en kontroll i hver mus. - Etterpå bruker du 6-0 absorberbare suturer for å sy snittet. Plasser musen på en varmepute i et rent bur og fortsett å overvåke vitale parametere til gjenoppretting. Gi postoperative smertestillende midler: Buprenorfin s.c. (0,1 mg/kg kroppsvekt hver 8. time i 48 timer). 48 timer etter operasjonen, administrer metamizol i drikkevann (24 mg / 5 ml vann tilsvarer en dose på 200 mg / kg 4 ganger daglig).
2. Magnetisk resonansavbildning
MERK: En dag etter DLFA må musene gjennomgå MR-skanninger for å vurdere FA-blokkering.
- Plasser musen i et gjennomsiktig induksjonskammer, og bedøv musen med 1,5-2% isofluran i omgivelsesluft til tap av høyre refleks.
- Plasser musen på en oppvarmet dyreseng utstyrt med en biteholder og plassert mot magneten med et laserkontrollert system. Opprettholde kroppstemperaturen ved 37±1 °C.
- Under bildeoppkjøp opprettholder anestesi med 1,5-2% isofluran i omgivelsesluft, og overvåker respirasjonen ved hjelp av en trykksonde.
- Hent bilder i tverrsnittsretningen ved hjelp av en tredimensjonal (3D) flytidslinje (TOF) angiografisekvens med parameterekkotid (TE)/repetisjonstid (TR)/flip-vinkel (FA) = 2 ms/12 ms/13°, fire gjennomsnitt, en oppkjøpsmatrise på 178 x 144 rekonstruert til 256 x 192 og 121 skiver, noe som resulterer i en isotropisk oppløsning på 0,15 mm3. For å undertrykke signalet fra venene, plasser en metningsskive distalt til bakre lemmer.
3. Klinisk evaluering og oppfølging
- Beregn funksjonell restitusjon i 1m, 3rd, 5thog 7th dager etter operasjonen ved hjelp av funksjonell scoring Tarlov skala18,19 (Tabell 1).
4. Histolog evaluering
- Syv dager etter operasjonen, bruk pentobarbital injeksjon (115 mg / kg) for å avlive musene.
- Perfuse fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 1% paraformaldehyd (PFA) gjennom venstre hjerte ventrikel (100 ml per mus). Fest musenes bilaterale gastrocnemius (Gm) i 4% PFA over natten ved 4 °C.
- Bygg inn prøven i parafin i henhold til den tidligere beskrevne protokollen20.
- Klipp 4-5 μm tykke deler av den parafin-innebygde vevsblokken på en mikrotom. Ved hjelp av en rund pensel, plasser de kuttede vevsdelene i vannbadet opprettholdt ved 42 °C.
- Sett mikroskopet i vannet i en 45° vinkel, og plasser det forsiktig under gruppen av seksjoner som skal samles.
- Løft forsiktig sklien fra vannet, og la seksjonene festes til sklien og tørke over natten i benkstoppinkubatoren ved 37 °C.
- Utfør hematoksylin/eosin (HE) farging av parafindelene.
- Plasser lysbildene som inneholder delene, i skyveholderne. Forbered 3 beholdere med frisk xylen, og legg lysbildene i hver beholder i 5 minutter for å deparaffinere seksjonene.
- Rehydrer seksjonene ved å dyppe skivene suksessivt i 96%, 80%, 70%, 50%, 30% etanol og deionisert vann i 5 min hver.
- Flekk i hematoksylinoppløsning i 10 min.
- Overfør skivene til en beholder med deionisert vann og skyll ved å plassere under rennende vann fra springen i 5 minutter.
- Bruk et mikroskop, kontroller intensiteten av hematoksylinfarging. Hvis fargingen gjør det mulig å identifisere cellekjernene tydelig, fortsetter du til neste trinn. Hvis fargingsintensiteten ikke letter identifiseringen av cellekjerner, eller hvis intensiteten av farging er svak, plasser lysbildet i hematoksylinoppløsningen i 1 min, gjenta vasken med vann (trinn 4.4.4), og kontroller deretter igjen.
- Tellere i eosin-Y-oppløsning i 5 min.
- Dehydrer seksjonene ved å dyppe skivene suksessivt i beholdere som inneholder deionisert vann og 30%, 50%, 70%, 80% og 96% etanol suksessivt i en varighet 10 s hver. Deretter plasserer du seksjonene sekvensielt i tre beholdere med frisk xylen i 10 s hver.
- Plasser lysbildene vannrett på mikroskopiske lysbildelagringskart med inndelingene vendt oppover. Legg til nok monteringsmedium på lysbildet, og monter lysbildene med deksler.
- Utfør immunhiistokjemisk (IHC) farging av parafindelene.
- Gjenta deparaffiniserings- og rehydreringstrinnene 4.4.1-4.4.2. Senk deretter seksjonene i en beholder med 10 mM natriumsitratbuffer, pH 6, og kok opp prøven i en mikrobølgeovn.
MERK: Siden over- eller underoppvarming av prøver kan forårsake inkonsekvent farging, må temperaturen opprettholdes like under kokepunktet i 10 minutter. - Deretter avkjøler du seksjonene på en benkeplate i 30 minutter. Vask deretter seksjonene i PBS tre ganger i 5 min. Tørk forsiktig området rundt prøven, og tegn en stor sirkel rundt prøven ved hjelp av en hydrofob penn. .
MERK: Berør aldri prøven. Merking med en hydrofob penn skaper en hydrofob grense, noe som letter bruken av et mindre volum antistoffoppløsning. - Slukke endogen peroksidaseaktivitet ved å plassere pkt. i 0,3% H2O2 i PBS i 10 min. Blokkseksjoner med 400 μL blokkbuffer (PBS inneholder 3% bovint serumalbumin og 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel) i 1 time ved romtemperatur i et fuktet kammer.
- Vask seksjonene i PBS i 5 min. Deretter tilsettes 100-400 μL fortynnet anti-CD31 antistoff (1:250) nok til å dekke delen. Etter dette, inkubere seksjoner over natten ved 4 °C i et fuktet kammer.
MERK: Sørg for at seksjonen er helt dekket med antistoffløsningen. - Fjern det primære antistoffet, og vask seksjonene tre ganger i PBS i en varighet på 5 min hver.
- Forbered blandingen 3, 3'-diaminobenzidin (DAB) ved å tilsette 1 dråpe DAB-konsentrat til 1 ml DAB-fortynningsmiddel og bland godt. Deretter tilsetter du 100-400 μL DAB-blanding i seksjonene, og overvåker nøye for øye i 2 minutter til en akseptabel fargingsintensitet overholdes.
MERK: Påse at seksjonen er helt dekket med DAB-blandingen. - Skyll deretter under rennende vann fra springen i 5 min. Utfør hematoksylinfarging som beskrevet i trinn 4.4.3-4.4.5.
- Utfør eosin-Y-farging som er beskrevet i trinn 4.4.6. Utfør dehydreringstrinn som er beskrevet i trinn 4.4.7.
- Montert seksjonene med deksler ved hjelp av monteringsmedium. Bruk ImageJ til å beregne prosentandelen av CD31 positivt område (%) i 5 tilfeldig utvalgte felt (40x) som kan betraktes som mikrovaskulær tetthet som tidligere beskrevet21.
- Gjenta deparaffiniserings- og rehydreringstrinnene 4.4.1-4.4.2. Senk deretter seksjonene i en beholder med 10 mM natriumsitratbuffer, pH 6, og kok opp prøven i en mikrobølgeovn.
5. Statistisk analyse
- Bruk statistisk analyseprogramvare for å uttrykke resultatene som gjennomsnittlig ± standardavvik og for å utføre uparret t-test på sammenligningene. Se P < 0,05 for å være statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kjennetegn på ApoE-/- mus
DLFA-operasjoner ble utført på 10 mus for å etablere HLI-modellen, og ingen av musene døde etter prosedyren. For å følge endringer i kroppsvekt ble mus veid før DLFA-prosedyren (Pre-DLFA) og 7 dager etter DLFA-operasjonen (Post-DLFA). Pre-DLFA-vekter varierte fra 29,6 til 38,0 g (gjennomsnittlig 34,74 ± 2,47 g), og post-DLFA-vekter varierte fra 2 6,5 til 34,1 g (gjennomsnittlig 30,77 ± 2,15 g), som var signifikant lavere enn pre-DLFA-vektene (P < 0,05, Figur 3A). Tiden for operasjonen varierte fra 15 til 47 min (gjennomsnittlig 34,2 ± 8,82 min, ikke inkludert anestesitiden). Snittstørrelsen i 10 mus varierte fra 3 til 5 mm (gjennomsnittlig 4,2 ± 0,63 mm).
MR-skanning og funksjonell gjenoppretting
MR-skanningene indikerte veldig tydelig at de proksimale og distale områdene i høyre FA ikke viste noen perfusjon (figur 3C), noe som indikerer suksessen til denne metoden. En dag etter operasjonen ble Tarlov Scale-resultatene betydelig redusert (P < 0,05). Selv om resultatene sakte økte i løpet av de påfølgende dagene, var de fortsatt lavere enn baseline til dag 7 (P < 0,05, figur 3B). Disse trendene samsvarer med tidligere rapporter20. Ingen nekrose eller gangrenøs vevsutvikling ble observert i de bilaterale sidene av bakre lemmer av noen mus. Potene til de iskemiske bakre lemmer i 7 mus klarte imidlertid ikke å strekke seg naturlig sammenlignet med den kontralaterale siden. I tillegg viste poter av de iskemiske bakre lemmer i 4 mus liten misfarging sammenlignet med den kontralaterale siden (Figur 3D).
Histologisk analyse
I HE farging av riktig Gm muskel, myofibers utvist uregelmessig iskemisk nekrose. Proliferating satellittceller hadde erstattet nekrotiske myofibers og ble distribuert i en masse og / eller med uregelmessig dispersjon. Myofibers utviste inflammatorisk infiltrasjon ved flernukleerte makrofager. Myofibers i de inflammatoriske regionene hadde mistet sine normale morfologiske egenskaper, og det var få regenererte myofibers. Tverrgående deler av disse regenererte myofibers var runde, cytoplasma var farget rødt, og en liten kjerne eller flere kjerner var plassert i sentrum. I motsetning ble denne typen inflammatorisk mønster ikke observert i venstre Gm (Figur 4). CD31 antistofffarging ble utført for å identifisere endotelceller av fartøyet i Gm-prøvene, og ImageJ ble brukt til å evaluere CD31-positivt område - et surrogat for mikrovaskulær tetthet i hvert av fem synsfelt (40x) for hver prøve. Iskemiske bakre lemmer viste betydelig mer mikrovaskulær tetthet enn den ikke-iskemiske siden (P < 0,05, figur 5).
Figur 1: Utstyr og verktøy som kreves for eksperimentet. (A) Dissekering av mikroskop og varmepute som kreves for operasjonen. (B) Kirurgiske verktøy: 1. 7-0 og 6-0 absorberbare suturer, 2. nåleholder, 3. tannløse tang, 4. vårsaks, 5. fine spisse tang, 6. spisse tang og 7. kirurgisk saks. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av prosedyren. (A og D) Et lite snitt er laget på inngangsområdet for å eksponere den proksimale lårbenet A, som er ligated. (B og E) En 6-0 sutur brukes til å dra snittet til kneområdet for å eksponere den distale Femoral A, som er ligated. (C, Fog G) Søm av snittet. Forkortelser: Femoral A = lårarterie; Femoral N = lårbensnerv; Femoral V = lårbenet vene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kjennetegn på PAD-musemodellen. (A) Sammenligning av kroppsvekten før og 7 dager etter DLFA. (B) Funksjonell gjenoppretting evaluert av Tarlov-skalaen. (C) Magnetisk resonansangiografi indikerer at den proksimale og distale FA i venstre bakre lem (hvit pil), og på høyre side forsvinner den proksimale og distale FA. (D) Endringer i utseendet på den bilaterale bakre lemmen av mus Nr. 2 og Nr. 4, 1 og 7 dager etter DLFA. Viste verdier er gjennomsnittlige ± standardavvik. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; ubetalt t-test. Forkortelser: PAD = perifer arteriesykdom; DLFA = dobbel ligasjon av lårarterien; FA = lårarterie; L = venstre; R = høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: He farging av gastrocnemius muskelen. (A) Bilde av lav forstørrelse som viser HE farging av høyre Gm 7 dager etter DLFA prosedyren. Betennelse ble observert i høyre Gm. (B) I høyre Gm viste nekrotiske myofibers inflammatorisk infiltrasjon av makrofager (hvit pil). Muskelfibrene mister sine normale morfologiske egenskaper. Det var svært få regenererte myofibers (svart pil). (C) HE farging av normale myofibers av høyre Gm. (D) Den kontralaterale / venstre Gm (nonischemic) muskelen viser et normalt histopologisk mønster. Skalastenger: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Forkortelser: HE = hematoksylin-eosin; DLFA = dobbel ligasjon av lårarterien; Gm = gastrocnemius; L = venstre; R = høyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sammenligning av mikrovaskulær tetthet av bilateral gastrocnemius muskel. (A) CD31-IHC farging av høyre Gm-seksjon (svarte piler). (B) CD31-IHC farging av venstre Gm-seksjon (svarte piler). (C) Kvantifisering av den mikrovaskulære tettheten på høyre side, som var mye mindre enn den på venstre side. Viste verdier er gjennomsnittlige ± standardavvik. P < 0,00001; ubetalt t-test. Skalastenger: A, B = 20 μm. Forkortelser: CD31 = differensieringsklynge 31; IHC = immunhiistokjemisk; Gm = gastrocnemius. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tarlov-poengsum | 0 | Ingen bevegelse |
| 1 | Knapt merkbar bevegelse, ikke-vektbærende | |
| 2 | Hyppig bevegelse, ikke-vektbærende | |
| 3 | Støtter vekt, delvis vektlager | |
| 4 | Turer med mildt underskudd | |
| 5 | Normal, men langsom gange | |
| 6 | Full og rask gange |
Tabell 1: Funksjonell poengregning.
Supplerende tabell S1: Sammendrag av 25 artikler fra dagens litteratur om etablering av PAD-modellen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien rapporterer en modifisert, forenklet og kirurgisk effektiv tilnærming for å etablere en HLI-modell i ApoE-/- mus ved hjelp av dobbel ligation i de proksimale og distale områdene i FA gjennom et 3-4 mm snitt uten nødvendige laboratorieoppgraderinger. Hovedkarakteristikken for denne metoden er den mindre størrelsen på snittet sammenlignet med tidligere rapporterte studier som beskriver mus HLI-modeller8,9,10,11,12,15,20,22,23,24 .
Historisk har et snitt blitt gjort fra kneet til media tett, inguinal, eller til og med magen for bedre eksponering, alt fra 0,5 til 2 cm eller mer9,11,15,19,22,25,26 (oppsummert i Supplemental Table S1). Dette dokumentet beskriver en kirurgisk teknikk for å oppnå DLFA og som et resultat HLI, hos mus med et snitt < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). FA ble ligated før den forgrener seg inn i popliteal arterie og saphenous arterie, forårsaker iskemi i flere muskelgrupper i bakre lem og resulterer i moderat stress hos mus. Selv om mus gjenvunnet funksjonelt ved7-dagers etteroperasjon (Tarlov score dag før operasjon 6 ± 0, 1st dag etter operasjonen 3,9 ± 0,99 vs 7dagen etter operasjonen 5,2 ± 0,92), ble det observert iskemisk skade i Gm på histologisk nivå. For det første viste Gm i det iskemiske benet myofibers uregelmessig iskemisk nekrose og ble infiltrert av multinukleerte makrofager, lik det som er rapportert hos PAD-pasienter27,28. Til tross for myofiber atrofi, ble det også observert noen regenererte myofibers, som er i tråd med en tidligere rapport29. For det andre var den mikrovaskulære tettheten i den iskemiske Gm den7. Det nylige fokuset i PAD-terapi er ikke bare begrenset til å øke mikrovaskulær tetthet sammenlignet med den ikke-iskemiske siden, men også på restaurering av iskemiindusert tap av levedyktig muskelvev, som støtter ny kardannelse ved å gi en matrise av vekstfaktorer og biomekanisk støtte31. Dermed gir denne modellen også et bredt vindu for å teste effektiviteten av nye terapier med disse fociene. Videre passer det å oppnå HLI med mindre snitt med 3R-konseptet med dyreforsøk som en raffinement av den kirurgiske prosedyren, det vil si at den lille hudinnsnittsstørrelsen reduserer traumer og postoperativ smerte.
En ideell dyremodell gir også et relativt langt terapeutisk vindu. Ulike kirurgiske prosedyrer for etablering av iskemi hos mus har blitt rapportert og brukt, og de utøver forskjellige effekter på blodstrømsrestaurering21. For induksjon av HLI fokuserer kirurgiske metoder normalt på iliacarterien 12,19,23,32, lårarterien24,33,34, og deres grener11,35, noen inkludert lårbenet samt36,37. Siden nivået av vaskulær ligasjon ikke har noen effekt på blodstrømsrestaurering, er den avgjørende faktoren omfanget av skade i det vaskulære treet21. For en enkelt ligasjon av lår- eller iliacarterien gjøres et lite snitt i inngangs- eller bukregionen, mens de andre greninteraksjonene fortsatt opprettholdes, og perfusjonsrestaurering i musens bakre lem gjenoppretter helt innen 7 dager21,38. Dermed er en enkelt ligation ikke tilstrekkelig når det gjelder å gi et passende terapeutisk vindu for å teste effekten av forskjellige behandlinger. Hvis grener fra FA også må ligateres, må hudinnsnittet gjøres enda større, noe som forlenger den kirurgiske tiden. Derfor tilbyr HLI av DLFA i mus et passende terapeutisk vindu der forbedringene indusert av terapi effektivt kan overvåkes9,21,22,25.
Etablering av en klinisk relevant HLI-dyremodell er viktig for å teste effektiviteten av nye terapeutiske tilnærminger, det vil si celle-, stamcelle- eller genterapi for PAD2,3,4. Flere PAD-modeller er utviklet i mus15,21, rotter39og kaniner40,41. Del Giudice og kolleger etablerte en kanin hindlimb iskemimodell opprettet av perkutan, transauricular, distal femoral arterie embolisering med kalibrerte partikler som kan overvinne noen av begrensningene til eksisterende dyremodeller40. Liddell et al.41 skapte også en kanin PAD-modell ved å spole den overfladiske FA gjennom en endovaskulær tilnærming, noe som resulterte i redusert bakre lemavstøtning. Selv om større dyr, som kaniner, kan gi mer overbevisende resultater40,41, tar terapiene et skritt nærmere klinisk anvendelse, men de krever økt kostnad og tid for å oppnå resultater.
Til tross for den heterogene risikoprofilen til de fleste pasienter med PAD, inkludert arvelige og atferdsmessige faktorer42, viser ApoE-/- mus unormal fettmetabolisme og hyperlipidemi symptomer, for eksempel totalt kolesterol, triglyserider, lipoprotein med svært lav tetthet og lipoprotein med middels tetthet, som gjenskaper noen av de viktigste egenskapene som observeres hos pasienter med PAD. Videre, med fettfattig diett, øker disse indikatorene betydelig. Lo Sasso et al. rapporterte at hos disse musene forekommer arteriell fettakkumulering ved 3 måneder43, og at en økning i AS-lesjoner oppstår med fremadgående alder43. Dermed er ApoE-/- mus spesielt godt egnet for den akutt-på-kroniske iskemi-PAD-modellen fordi de rekapitulerer hyperkolesterolemien som vanligvis er tilstede hos pasienter med PAD og gir en passende plattform for å evaluere ulike terapier rettet mot å fremme neovascularisering av iskemiske lemmer. Videre er pris-ytelsesforholdet for å teste nye terapier med ApoE-/- mus uslåelig.
Til tross for fordelene som er nevnt i de ovennevnte avsnittene, er det to begrensninger for denne modellen. For det første krever mestring av denne metoden at eksperimentet har tilstrekkelig mikrokirurgisk erfaring og kjennskap til anatomien til musens bakre lem. For det andre øker den begrensede kirurgiske eksponeringen og mengden subkutant fettvev i bakre lem av ApoE- / - mus den kirurgiske vanskeligheten. Derfor er det nødvendig med noen relatert praksis for vellykket implementering av denne teknikken. Til slutt rapporterer denne studien en modifisert og lett å implementere, kirurgisk effektiv tilnærming for å etablere en HLI-modell i ApoE-/- mus ved hjelp av et lite snitt. Det lille snittet reduserer traumer til dyret betydelig og kan brukes av de fleste forskningsgrupper uten laboratorieoppgraderinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at artikkelinnholdet ble komponert i fravær av kommersielle eller økonomiske forhold som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfattere takker Viktoria Skude, Alexander Schlund og Felix Hörner for utmerket teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
