Summary
Questo articolo dimostra un approccio chirurgico efficiente per stabilire l'ischemia acuta nei topi con una piccola incisione. Questo approccio può essere applicato dalla maggior parte dei gruppi di ricerca senza aggiornamenti di laboratorio.
Abstract
Lo scopo di questo studio è quello di introdurre e valutare un approccio chirurgico modificato per indurre ischemia acuta nei topi che può essere implementato nella maggior parte dei laboratori animali. Contrariamente all'approccio convenzionale per la doppia legatura dell'arteria femorale (DLFA), è stata praticata un'incisione più piccola sulla regione inguinale destra per esporre l'arteria femorale prossimale (FA) per eseguire DLFA. Quindi, utilizzando una sutura 7-0, l'incisione è stata trascinata nella regione del ginocchio per esporre la FA distale. La risonanza magnetica (MRI) sugli arti posteriori bilaterali è stata utilizzata per rilevare l'occlusione FA dopo l'intervento chirurgico. A 0, 1, 3, 5 e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico, il recupero funzionale degli arti posteriori è stato valutato visivamente e classificato utilizzando la scala di Tarlov. La valutazione istologica è stata eseguita dopo l'eutanasia degli animali 7 giorni dopo il DLFA. Le procedure sono state eseguite con successo sulla gamba destra in dieci topi ApoE-/- e nessun topo è morto durante la successiva osservazione. Le dimensioni dell'incisione in tutti e 10 i topi erano inferiori a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). I risultati della risonanza magnetica hanno mostrato che il flusso sanguigno FA nel lato ischemico era chiaramente bloccato. I risultati della scala di Tarlov hanno dimostrato che la funzione dell'arto posteriore è diminuita significativamente dopo la procedura e lentamente recuperata nei successivi 7 giorni. La valutazione istologica ha mostrato una significativa risposta infiammatoria sul lato ischemico e una ridotta densità microvascolare nell'arto posteriore ischemico. In conclusione, questo studio introduce una tecnica modificata che utilizza un'incisione in miniatura per eseguire l'ischemia degli arti posteriori (HLI) utilizzando DLFA.
Introduction
C'è un bisogno insoddisfatto di modelli animali preclinici per la ricerca nelle malattie vascolari come la malattia delle arterie periferiche (PAD). Nonostante gli sviluppi avanzati nella diagnosi e nel trattamento, ci sono stati più di 200 milioni di pazienti con PAD nel 20181e il loro numero è in costante aumento. Sebbene siano stati descritti diversi nuovi approcci terapeutici2,3,4,5,6,7, la traduzione di successo di queste modalità terapeutiche in applicazione clinica rimane un compito scoraggiante. Pertanto, sono necessari modelli sperimentali in vivo affidabili e pertinenti che simulino la condizione della malattia umana per studiare il potenziale meccanismo e l'efficienza di questi nuovi approcci terapeutici per il trattamento della PAD6,7.
L'iperlipidemia e l'aterosclerosi (AS) sono i principali fattori di rischio per lo sviluppo della PAD. I topi ApoE-/- (con una dieta ricca di grassi) mostrano un metabolismo anormale dei grassi e iperlipidemia e successivamente sviluppano placche aterosclerotiche che rendono i topi ApoE-/- la scelta migliore per simulare la PAD clinicamente rilevante. I modelli animali HLI preclinici sono generati attraverso la doppia legatura dell'arteria femorale (DLFA), che è l'approccio più utilizzato nei laboratori di tutto il mondo8,9,10,11,12,13,14,15 per simulare l'ischemia acuta su cronica. Tuttavia, questo approccio di solito richiede un'incisione relativamente grande e invasiva. Inoltre, porta inevitabilmente agli animali (soprattutto topi) che soffrono di aumento delle lesioni da dolore e dell'infiammazione, che influenza anche i successivi risultati sperimentali5,6,16,17. Questo articolo descrive un modello HLI acuto su cronico nei topi APOE-/- utilizzando un'incisione molto piccola.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite secondo la linea guida CE CE 2010/63/UE e sono state approvate dalla legislazione locale tedesca (35-9185.81/G[1]239/18). Dieci topi ApoEmaschi -/- con fondo C57BL / 6J, del peso di 29,6-38,0 g, sono stati alloggiati su un ciclo di luce / buio di 12 ore e alimentati con una dieta occidentale (1,25% di colesterolo e 21% di grassi) e acqua ad libitum per 12 settimane dall'età di 8 settimane. HLI è stato eseguito su topi di 20 settimane come descritto di seguito.
1. Induzione di HLI in topi ApoE-/-
- Preparare le attrezzature e gli strumenti necessari per la chirurgia (vedere la Tabella dei materiali e la Figura 1). Sterilizzare gli strumenti chirurgici tramite autoclave prima dell'uso e utilizzare uno sterilizzatore per perline di vetro durante l'operazione.
- Anestetizzare il topo con un'iniezione sottocutanea (S.C.) di una miscela di midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,05 mg/ml/kg) e fentanil (0,5 mg/kg) prima di tutte le procedure chirurgiche.
- Dopo l'inizio dell'anestesia, utilizzare l'unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza e confermare l'assenza del riflesso di astinenza del pedale nell'arto anteriore e posteriore.
- Successivamente posizionare il mouse su una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea interna a circa 37 °C. Utilizzando tamponi di cotone e crema per la depilazione, rimuovere con cura i peli dalla pelle degli arti posteriori sul lato destro.
NOTA: La crema depilatoria deve essere utilizzata in quantità sufficiente a coprire l'arto posteriore, in particolare la regione inguinale in cui verrà praticata l'incisione. La crema depilazione deve essere utilizzata per una durata inferiore a 3 minuti e deve essere successivamente rimossa con tamponi di cotone inumiditi da 2 a 3 volte. - Posare il mouse in posizione supina sulla piastra riscaldante sotto un microscopio di dissezione. Utilizzare un antisettico cutaneo (vedi tabella dei materiali)per disinfettare la pelle del topo. Successivamente, utilizzare pinze appuntite e forbici chirurgiche per praticare un'incisione di circa 3-4 mm nel mezzo della regione inguinale. Vedere la Figura 2 per uno schema della procedura.
- Rimuovere accuratamente il tessuto adiposo sottocutaneo con l'aiuto di pinze appuntite per esporre il fascio neurovascolare femorale prossimale. Utilizzare con attenzione la pinza a punta fine per perforare la membrana della guaina femorale. Utilizzare un batuffolo di cotone inumidito con soluzione salina per spostare l'arteria femorale (FA) con attenzione lontano dal nervo femorale (FN) e dalla vena femorale (FV).
- Passa due suture assorbibili 7-0 attraverso la FA prossimale e fai doppi nodi usando le forbici a molla per transettare la FA tra i due legami.
- Per esporre la FA distale, passare una sutura assorbibile 7-0 attraverso il bordo inferiore dell'incisione e trascinare delicatamente l'incisione nella regione del lato destro del ginocchio dell'arto posteriore.
- Spostare il tessuto sottocutaneo da parte con attenzione per esporre il fascio neurovascolare. Utilizzare pinze a punta fine per perforare la membrana della guaina femorale e sezionare la FA da FV e FN.
- Passa due suture assorbibili 7-0 attraverso la FA distale e fai doppi nodi. Usa le forbici a molla per transettare la FA tra le due cravatte.
NOTA: nessuna legatura è stata eseguita sull'arto sinistro, che fungeva da controllo in ciascun mouse. - Successivamente, utilizzare 6-0 suture riassorbibili per cucire l'incisione. Posizionare il mouse su una piastra riscaldante in una gabbia pulita e continuare a monitorare i suoi parametri vitali fino al recupero. Fornire analgesici postoperatori: Buprenorfina s.c. (0,1 mg/kg di peso corporeo ogni 8 ore per 48 ore). 48 ore dopo l'operazione, somministrare metamizolo in acqua potabile (24 mg/5mL di acqua corrispondono a una dose di 200 mg/kg 4 volte al giorno).
2. Risonanza magnetica
NOTA: Un giorno dopo DLFA, i topi devono sottoporsi a scansioni MRI per valutare il blocco FA.
- Posizionare il mouse in una camera di induzione trasparente e anestetizzare il mouse con l'1,5-2% di isoflurano nell'aria ambiente fino alla perdita del riflesso di raddrizzamento.
- Posizionare il mouse su un letto per animali riscaldato dotato di un porta morso e posizionato verso il magnete con un sistema controllato dal laser. Mantenere la temperatura corporea a 37±1 °C.
- Durante l'acquisizione delle immagini, mantenere l'anestesia con l'1,5-2% di isoflurano nell'aria ambiente e monitorare la respirazione utilizzando una sonda di pressione.
- Acquisire immagini nell'orientamento trasversale della fetta utilizzando una sequenza angiografica tridimensionale (3D) time of flight (TOF) con parametro echo time (TE)/tempo di ripetizione (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, quattro medie, una matrice di acquisizione di 178 x 144 ricostruita a 256 x 192 e 121 fette, con conseguente risoluzione isotropa di 0,15 mm3. Per sopprimere il segnale dalle vene, posizionare una fetta di saturazione distalmente agli arti posteriori.
3. Valutazione clinica e follow-up
- Stimare il recupero funzionale nel1°,3°,5°e7° giorno dopo l'intervento chirurgico utilizzando il punteggio funzionale della scala di Tarlov18,19 (Tabella 1).
4. Valutazione istologica
- Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, applicare l'iniezione di pentobarbital (115 mg / kg) per eutanasizzare i topi.
- Perfondere la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente l'1% di paraformaldeide (PFA) attraverso il ventricolo cardiaco sinistro (100 ml per topo). Fissare il gastrocnemio bilaterale (Gm) dei topi in PFA al 4% durante la notte a 4 °C.
- Incorporare il campione in paraffina secondo il protocollo20precedentemente descritto.
- Tagliare sezioni spesse 4-5 μm del blocco di tessuto incorporato nella paraffina su un microtomo. Con l'aiuto di un pennello rotondo, posizionare le sezioni di tessuto tagliate nel bagno d'acqua mantenute a 42 ° C.
- Inserire il vetrino del microscopio nell'acqua con un angolo di 45° e posizionarlo con attenzione sotto il gruppo di sezioni da raccogliere.
- Sollevare con attenzione lo scivolo dall'acqua e lasciare che le sezioni si attacchino allo scivolo e asciugare durante la notte nell'incubatrice da banco a 37 °C.
- Eseguire la colorazione ematossilina/eosina (HE) delle sezioni di paraffina.
- Posizionare le diapositive contenenti le sezioni nei porta diapositive. Preparare 3 contenitori di xilene fresco e posizionare i vetrini in ogni contenitore per 5 minuti per deparaffinizzare le sezioni.
- Reidratare le sezioni immergendo le fette successivamente in 96%, 80%, 70%, 50%, 30% di etanolo e acqua deionizzata per 5 minuti ciascuna.
- Macchiare in soluzione di ematossilina per 10 minuti.
- Trasferire le fette in un contenitore di acqua deionizzata e risciacquare mettendo sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti.
- Utilizzando un microscopio, controllare l'intensità della colorazione ematossilina. Se la colorazione consente di identificare chiaramente i nuclei cellulari, continuare con il passaggio successivo. Se l'intensità della colorazione non facilita l'identificazione dei nuclei cellulari o se l'intensità della colorazione è debole, posizionare il vetrino nella soluzione di ematossilina per 1 minuto, ripetere il lavaggio con acqua (passaggio 4.4.4) e quindi controllare di nuovo.
- Contromacchia in soluzione di eosina-Y per 5 min.
- Disidratare le sezioni immergendo successivamente le fette in contenitori contenenti acqua deionizzata e etanolo al 30%, 50%, 70%, 80% e 96% successivamente per una durata di 10 s ciascuno. Quindi, posizionare le sezioni in sequenza in tre contenitori di xilene fresco per 10 s ciascuno.
- Posizionare le diapositive orizzontalmente su microscopiche mappe di memorizzazione delle diapositive con le sezioni rivolte verso l'alto. Aggiungere abbastanza supporto di montaggio sulla diapositiva e montare le diapositive con i coverslip.
- Eseguire la colorazione immunoistochimica (IHC) delle sezioni di paraffina.
- Ripetere le fasi di deparaffinazione e reidratazione 4.4.1-4.4.2. Quindi, immergere le sezioni in un contenitore con tampone di citrato di sodio da 10 mM, pH 6 e portare il campione a ebollizione in un forno a microonde.
NOTA: poiché il surriscaldamento o il surriscaldamento dei campioni può causare macchie incoerenti, mantenere la temperatura appena al di sotto del punto di ebollizione per 10 minuti. - Quindi, raffreddare le sezioni su un banco per 30 minuti. Successivamente, lavare le sezioni in PBS tre volte per 5 minuti. Asciugare accuratamente l'area intorno al campione e disegnare un grande cerchio attorno al campione usando una penna idrofoba. .
NOTA: non toccare mai il campione. La marcatura con una penna idrofobica crea un confine idrofobo, che facilita l'uso di un volume minore di soluzione anticorpale. - Spegnere l'attività della perossidasi endogena ponendo la sezione nello 0,3% H2O2 in PBS per 10 min. Sezioni di blocco con 400 μL di tampone di blocco (PBS contiene il 3% di albumina sierica bovina e lo 0,3% di detergente non ionico) per 1 ora a temperatura ambiente in una camera umidificata.
- Lavare le sezioni in PBS per 5 min. Quindi, aggiungere 100-400 μL di anticorpo anti-CD31 diluito (1:250) sufficiente per coprire la sezione. Successivamente, incubare le sezioni durante la notte a 4 °C in una camera umidificata.
NOTA: Assicurarsi che la sezione sia completamente coperta con la soluzione anticorpale. - Rimuovere l'anticorpo primario e lavare le sezioni tre volte in PBS per una durata di 5 minuti ciascuna.
- Preparare la miscela di 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) aggiungendo 1 goccia del concentrato DAB a 1 mL di diluente DAB e mescolare bene. Successivamente, aggiungere 100-400 μL di miscela DAB alle sezioni e monitorare attentamente a occhio per 2 minuti fino a quando non si osserva un'intensità di colorazione accettabile.
NOTA: assicurarsi che la sezione sia completamente coperta con la miscela DAB. - Successivamente, risciacquare sotto l'acqua corrente del rubinetto per 5 minuti. Eseguire la colorazione dell'ematossilina come descritto nei passaggi 4.4.3-4.4.5.
- Eseguire la colorazione eosina-Y descritta al punto 4.4.6. Eseguire le fasi di disidratazione descritte nel passaggio 4.4.7.
- Montato le sezioni con coverslips utilizzando il mezzo di montaggio. Usa ImageJ per stimare la percentuale di area positiva CD31 (%) in 5 campi selezionati casualmente (40x) che possono essere considerati come densità microvascolare come descritto in precedenza21.
- Ripetere le fasi di deparaffinazione e reidratazione 4.4.1-4.4.2. Quindi, immergere le sezioni in un contenitore con tampone di citrato di sodio da 10 mM, pH 6 e portare il campione a ebollizione in un forno a microonde.
5. Analisi statistica
- Utilizzare un software di analisi statistica per esprimere i risultati come media ± deviazione standard ed eseguire t -test spaiatisui confronti. Considera P < 0,05 statisticamente significativo.
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Representative Results
Caratteristiche dei mouse ApoE-/-
Gli interventi chirurgici DLFA sono stati eseguiti con successo su 10 topi per stabilire il modello HLI e nessuno dei topi è morto dopo la procedura. Per seguire i cambiamenti nel peso corporeo, i topi sono stati pesati prima della procedura DLFA (Pre-DLFA) e 7 giorni dopo l'intervento chirurgico DLFA (Post-DLFA). I pesi pre-DLFA variavano da 29,6 a 38,0 g (media 34,74 ± 2,47 g) e i pesi post-DLFA variavano da 26,5 a 34,1 g (media 30,77 ± 2,15 g), che erano significativamente inferiori ai pesi pre-DLFA (P < 0,05, Figura 3A). Il tempo per l'intervento variava da 15 a 47 minuti (media 34,2 ± 8,82 minuti, escluso il tempo di anestesia). La dimensione dell'incisione in 10 topi variava da 3 a 5 mm (media 4,2 ± 0,63 mm).
Risonanza magnetica e recupero funzionale
Le scansioni MRI hanno indicato molto chiaramente che le regioni prossimali e distali della FA destra non hanno mostrato alcuna perfusione (Figura 3C), indicando il successo di questo metodo. Un giorno dopo l'intervento chirurgico, i risultati della scala di Tarlov sono stati significativamente ridotti(P < 0,05). Sebbene i risultati siano aumentati lentamente nei giorni successivi, erano ancora inferiori al basale fino al giorno 7 (P < 0,05, Figura 3B). Queste tendenze sono coerenti con le relazioni precedenti20. Non è stata osservata necrosi o sviluppo di tessuto gangrenoso nei lati bilaterali degli arti posteriori di nessun topo. Tuttavia, le zampe degli arti posteriori ischemici in 7 topi non erano in grado di allungarsi naturalmente rispetto al lato controlaterale. Inoltre, le zampe degli arti posteriori ischemici in 4 topi hanno mostrato un leggero scolorimento rispetto al lato controlaterale (Figura 3D).
Analisi istologica
Nella colorazione HE del muscolo Gm destro, le miofibre hanno mostrato necrosi ischemica irregolare. Le cellule satelliti proliferanti avevano sostituito le miofibre necrotiche e sono state distribuite in massa e/o con dispersione irregolare. Le miofibre hanno mostrato infiltrazioni infiammatorie da macrofagi multinucleati. Le miofibre nelle regioni infiammatorie avevano perso le loro normali caratteristiche morfologiche e c'erano poche miofibre rigenerate. Le sezioni trasversali di queste miofibre rigenerate erano rotonde, il citoplasma era macchiato di rosso e un piccolo nucleo o più nuclei si trovavano al centro. Al contrario, questo tipo di pattern infiammatorio non è stato osservato nel Gm sinistro (Figura 4). La colorazione degli anticorpi CD31 è stata eseguita per identificare le cellule endoteliali del vaso nei campioni Gm e ImageJ è stata utilizzata per valutare l'area CD31-positiva - un surrogato per la densità microvascolare - in ciascuno dei cinque campi visivi (40x) per ciascun campione. Gli arti posteriori ischemici hanno mostrato una densità microvascolare significativamente maggiore rispetto al lato non ischemico (P < 0,05, Figura 5).
Figura 1: Attrezzature e strumenti necessari per l'esperimento. (A) Microscopio di dissezione e piastra riscaldante necessari per l'intervento chirurgico. (B) Strumenti chirurgici: 1. 7-0 e 6-0 suture riassorbibili, 2. portaago, 3. pinze senza denti, 4. forbici a molla, 5. pinze a punta fine, 6. pinze appuntite e 7. forbici chirurgiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Illustrazione schematica della procedura. (A e D) Viene praticata una piccola incisione sulla regione inguinale per esporre il femore prossimale A, che è legato. (B ed E) Una sutura 6-0 viene utilizzata per trascinare l'incisione nella regione del ginocchio per esporre il femore distale A, che è legato. (C, Fe G) Cucitura dell'incisione. Abbreviazioni: Femoral A = arteria femorale; N femorale = nervo femorale; Femorale V = vena femorale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Caratteristiche del modello murino PAD. (A) Confronto del peso corporeo prima e 7 giorni dopo dlFA. (B) Recupero funzionale valutato dalla Scala di Tarlov. (C) L'angiografia a risonanza magnetica indica la FA prossimale e distale nell'arto posteriore sinistro (freccia bianca), e sul lato destro, la FA prossimale e distale scompaiono. (D) Cambiamenti nell'aspetto dell'arto posteriore bilaterale dei topi n. 2 e n. 4, 1 e 7 giorni dopo dlFA. I valori mostrati sono la media ± deviazione standard. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; t-test spaiato. Abbreviazioni: PAD = malattia delle arterie periferiche; DLFA = doppia legatura dell'arteria femorale; FA = arteria femorale; L = sinistra; R = destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Colorazione HE del muscolo gastrocnemio. (A) Immagine a basso ingrandimento che mostra la colorazione HE del Gm destro 7 giorni dopo la procedura DLFA. L'infiammazione è stata osservata nel Gm destro. (B) Nel Gm destro, le miofibre necrotiche hanno mostrato infiltrazione infiammatoria da parte dei macrofagi (freccia bianca). Le fibre muscolari perdono le loro normali caratteristiche morfologiche. C'erano pochissime miofibre rigenerate (freccia nera). (C) Colorazione HE di miofibre normali del Gm destro. (D) Il muscolo monolaterale / sinistro Gm (non ischemico) mostra un normale schema istologico. Barre di scala: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Abbreviazioni: HE = ematossilina-eosina; DLFA = doppia legatura dell'arteria femorale; Gm = gastrocnemio; L = sinistra; R= destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Confronto della densità microvascolare del muscolo gastrocnemio bilaterale. (A) Colorazione CD31-IHC della sezione Gm destra (frecce nere). (B) Colorazione CD31-IHC della sezione Gm sinistra (frecce nere). (C) Quantificazione della densità microvascolare del lato destro, che era molto inferiore a quella del lato sinistro. I valori mostrati sono la media ± deviazione standard. P < 0,00001; t-test spaiato. Barre di scala: A, B = 20 μm. Abbreviazioni: CD31 = cluster di differenziazione 31; IHC = immunoistochimico; Gm = gastrocnemio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Tarlov Punteggio | 0 | Nessun movimento |
| 1 | Movimento appena percettibile, senza peso | |
| 2 | Movimenti frequenti, senza peso | |
| 3 | Supporta il peso, cuscinetto parziale | |
| 4 | Passeggiate con deficit lieve | |
| 5 | Camminata normale ma lenta | |
| 6 | Camminata completa e veloce |
Tabella 1: Punteggio funzionale.
Tabella supplementare S1: Sintesi di 25 articoli della letteratura attuale sulla creazione del modello PAD. Fare clic qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Questo studio riporta un approccio modificato, semplificato e chirurgicamente efficiente per stabilire un modello HLI nei topi ApoE-/- utilizzando la doppia legatura nelle regioni prossimale e distale della FA attraverso un'incisione di 3-4 mm senza alcun aggiornamento di laboratorio richiesto. La caratteristica principale di questo metodo è la dimensione minore dell'incisione rispetto agli studi precedentemente riportati che descrivono i modelli HLI murini8,9,10,11, 12,15,20,22,23,24.
Storicamente, un'incisione è stata fatta dal ginocchio al mezzo stretto, inguinale, o anche l'addome per una migliore esposizione, che va da 0,5 a 2 cm o più9,11,15,19,22,25,26 (riassunto nella Tabella supplementare S1). Questo documento descrive una tecnica chirurgica per ottenere DLFA e, di conseguenza, HLI, in topi con un'incisione < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). La FA è stata legata prima che si ramificasse nell'arteria poplitea e nell'arteria safena, causando ischemia in diversi gruppi muscolari nell'arto posteriore e causando uno stress moderato nei topi. Sebbene i topi si siano ripresi funzionalmente entroil 7 ° giorno dopo l'operazione (punteggio Tarlov il giorno prima dell'operazione 6 ± 0, 1° giorno dopo l'operazione 3,9 ± 0,99 vs7 ° giorno dopo l'operazione 5,2 ± 0,92), il danno ischemico è stato osservato in Gm a livello istologico. In primo luogo, gm nelle miofibre ischemiche delle gambe hanno mostrato necrosi ischemica irregolare e sono stati infiltrati da macrofagi multinucleati, simile a quanto riportato nei pazienti con PAD27,28. Nonostante l'atrofia miofibra, sono state osservate anche alcune miofibre rigenerate, che è in linea con un precedente rapporto29. In secondo luogo, la densità microvascolare nel Gm ischemico il 7° giorno dopo la legatura era superiore a quella della gamba non ischemica, che è stata riportata anche da Ministro et al.30. La recente attenzione nella terapia PAD non si limita solo ad aumentare la densità microvascolare rispetto al lato non ischemico, ma anche al ripristino della perdita indotta da ischemia del tessuto muscolare vitale, che supporta la formazione di nuovi vasi fornendo una matrice di fattori di crescita e supporto biomeccanico31. Pertanto, questo modello offre anche un'ampia finestra per testare l'efficacia di nuove terapie con questi focolai. Inoltre, raggiungere hLI con incisioni più piccole si adatta al concetto 3R di sperimentazione animale come perfezionamento della procedura chirurgica, cioè le piccole dimensioni incisionali della pelle diminuiscono il trauma e il dolore postoperatorio.
Un modello animale ideale fornisce anche una finestra terapeutica relativamente lunga. Varie procedure chirurgiche per stabilire l'ischemia nei topi sono state segnalate e applicate ed esercitano effetti diversi sul ripristino del flusso sanguigno21. Per l'induzione di HLI, i metodi chirurgici normalmente si concentrano sull'arteria iliaca12,19,23,32,sull'arteria femorale24,33, 34e sui loro rami11,35,alcuni tra cui la vena femorale e36,37. Poiché il livello di legatura vascolare non ha alcun effetto sul ripristino del flusso sanguigno, il fattore decisivo è l'entità della lesione nell'alberovascolare 21. Per una singola legatura dell'arteria femorale o iliaca, viene praticata una piccola incisione nella regione inguinale o addominale, mentre le altre interazioni di ramo sono ancora mantenute e il ripristino della perfusione nell'arto posteriore del topo si riprende completamente entro 7 giorni21,38. Pertanto, una singola legatura non è sufficiente in termini di fornitura di una finestra terapeutica adeguata per testare gli effetti di diversi trattamenti. Se anche i rami della FA devono essere legati, l'incisione cutanea deve essere resa ancora più grande, il che allunga il tempo chirurgico. Pertanto, HLI di DLFA nel topo offre una finestra terapeutica adeguata in cui i miglioramenti indotti dalla terapia possono essere monitorati in modo efficiente9,21,22,25.
Stabilire un modello animale HLI clinicamente rilevante è importante per testare l'efficacia di nuovi approcci terapeutici, ad esempio cellule, cellule staminali o terapia genica per PAD2,3,4. Diversi modelli PAD sono stati sviluppati nei topi15,21,ratti39e conigli40,41. Del Giudice e colleghi hanno stabilito un modello di ischemia posteriore del coniglio creato dall'embolizzazione dell'arteria femorale percutanea, transauricolare, distale con particelle calibrate che possono superare alcune delle limitazioni dei modelli animali esistenti40. Liddell et al.41 hanno anche creato un modello PAD di coniglio avvolgendo la FA superficiale attraverso un approccio endovascolare, con conseguente riduzione della riperfusione degli arti posteriori. Sebbene gli animali più grandi, come i conigli, possano produrre risultati più convincenti40,41,portando le terapie un passo più vicino all'applicazione clinica, tuttavia richiedono maggiori costi e tempi per ottenere risultati.
Nonostante il profilo di rischio eterogeneo della maggior parte dei pazienti con PAD, compresi i fattori ereditari e comportamentali42,i topi ApoE-/- mostrano un metabolismo anormale dei grassi e sintomi di iperlipidemia, come colesterolo totale, trigliceridi, lipoproteine a densità molto bassa e lipoproteine a densità intermedia, replicando alcune delle principali caratteristiche osservate nei pazienti con PAD. Inoltre, con la dieta ricca di grassi, questi indicatori aumentano significativamente. Lo Sasso et al. hanno riferito che in questi topi, l'accumulo di grasso arterioso si verifica a 3 mesi di età43e che un aumento delle lesioni AS si verifica con l'avanzare dell'etàdi 43anni. Pertanto, i topi ApoE-/- sono particolarmente adatti per il modello di ischemia-PAD acuta su cronica perché ricapitolano l'ipercolesterolemia comunemente presente nei pazienti con PAD e forniscono una piattaforma adeguata per valutare varie terapie mirate a promuovere la neovascolarizzazione degli arti ischemici. Inoltre, il rapporto qualità-prezzo dei test di nuove terapie con topi ApoE-/- è imbattibile.
Nonostante i vantaggi menzionati nei paragrafi precedenti, ci sono due limitazioni a questo modello. In primo luogo, padroneggiare questo metodo richiede che lo sperimentatore abbia sufficiente esperienza microchirurgica e familiarità con l'anatomia dell'arto posteriore del topo. In secondo luogo, la limitata esposizione chirurgica e la quantità di tessuto adiposo sottocutaneo nell'arto posteriore dei topi ApoE-/- aumentano la difficoltà chirurgica. Pertanto, è necessaria una pratica correlata per un'implementazione di successo di questa tecnica. In conclusione, questo studio riporta un approccio modificato e facile da implementare, chirurgicamente efficiente per stabilire un modello HLI in topi ApoE-/- utilizzando una piccola incisione. La piccola incisione riduce significativamente il trauma all'animale e può essere applicata dalla maggior parte dei gruppi di ricerca senza alcun aggiornamento di laboratorio.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che il contenuto dell'articolo è stato composto in assenza di relazioni commerciali o finanziarie che potrebbero essere interpretate come un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Viktoria Skude, Alexander Schlund e Felix Hörner per l'eccellente supporto tecnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
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