Summary
В данной статье демонстрируется эффективный хирургический подход к установлению острой ишемии у мышей с небольшим разрезом. Этот подход может применяться большинством исследовательских групп без каких-либо лабораторных обновлений.
Abstract
Целью данного исследования является внедрение и оценка модифицированного хирургического подхода к индуцированию острой ишемии у мышей, который может быть реализован в большинстве лабораторий на животных. В отличие от традиционного подхода к двойному перевязке бедренной артерии (DLFA), был сделан меньший разрез на правой паховой области, чтобы обнажить проксимальную бедренную артерию (FA) для выполнения DLFA. Затем, используя шов 7-0, разрез был перетащен в область колена, чтобы обнажить дистальную ФА. Магнитно-резонансная томография (МРТ) на двусторонних задних конечностях использовалась для обнаружения окклюзии ФА после операции. Через 0, 1, 3, 5 и 7 дней после операции функциональное восстановление задних конечностей было визуально оценено и оценено по шкале Тарлова. Гистологическая оценка проводилась после эвтаназии животных через 7 дней после DLFA. Процедуры были успешно выполнены на правой ноге у десяти мышей ApoE-/-, и ни одна мышь не умерла во время последующего наблюдения. Размеры разреза у всех 10 мышей были менее 5 мм (4,2 ± 0,63 мм). Результаты МРТ показали, что кровоток ФА в ишемической стороне был явно заблокирован. Результаты по шкале Тарлова показали, что функция задних конечностей значительно снизилась после процедуры и медленно восстанавливалась в течение следующих 7 дней. Гистологическая оценка показала значительную воспалительную реакцию на ишемической стороне и снижение плотности микрососудистости в ишемической задней конечности. В заключение, это исследование вводит модифицированную технику с использованием миниатюрного разреза для выполнения ишемии задних конечностей (HLI) с использованием DLFA.
Introduction
Существует неудовлетворенная потребность в доклинических животных моделях для исследований сосудистых заболеваний, таких как заболевания периферических артерий (PAD). Несмотря на передовые разработки в области диагностики и лечения, в 2018 году было зарегистрировано более 200 миллионов пациентов сPAD1,и их число постоянно увеличивается. Хотя было описано несколько новых терапевтическихподходов2,3,4,5,6,7, успешный перевод этих терапевтических модальностей в клиническое применение остается сложной задачей. Поэтому для исследования потенциального механизма и эффективности этих новых терапевтических подходов к лечению PAD6,7требуются надежные и актуальные экспериментальные модели in vivo, моделирующие состояние заболевания человека.
Гиперлипидемия и атеросклероз (АС) являются основными факторами риска развития PAD. ApoE-/- мыши (на диете с высоким содержанием жиров) демонстрируют аномальный метаболизм жиров и гиперлипидемию и впоследствии развивают атеросклеротические бляшки, что делает мышей ApoE-/- лучшим выбором для моделирования клинически значимого PAD. Доклинические модели HLI на животных генерируются путем двойного перевязки бедренной артерии (DLFA), что является наиболее широко используемым подходом в лабораториях по всему миру8,9,10,11,12,13, 14,15 для моделирования острой хронической ишемии. Однако такой подход обычно требует относительно большого и инвазивного разреза. Кроме того, это неизбежно приводит к тому, что животные (особенно мыши) страдают от повышенной болевой травмы и воспаления, что также влияет на последующие экспериментальные результаты5,6,16,17. В этой статье описывается модель HLI с острым и хроническим HLI у мышей APOE-/- с использованием очень маленького разреза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами ЕС EC 2010/63/EU и были одобрены местным законодательством Германии (35-9185.81/G[1]239/18). Десять самцов мышей ApoE-/- с фоном C57BL/6J, весом 29,6-38,0 г, содержались в 12-часовом светло-темном цикле и питались западной диетой (1,25% холестерина и 21% жира) и водой ad libitum в течение 12 недель с 8-недельного возраста. HLI проводили на 20-недельных мышах, как описано ниже.
1. Индукция HLI у мышей ApoE-/-
- Подготовьте необходимое оборудование и инструменты для операции (см. Таблицу материалов и рисунок 1). Стерилизуйте хирургические инструменты с помощью автоклавирования перед использованием и используйте стеклянный стерилизатор для бисера во время операции.
- Обезболить мышь подкожной инъекцией (S.C.) смеси мидазолама (5 мг/кг), медетомидина (0,05 мг/мл/кг) и фентанила (0,5 мг/кг) перед всеми хирургическими процедурами.
- После начала анестезии используйте ветеринарную мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость, и подтвердить отсутствие рефлекса снятия педали в передней и задней конечности.
- После этого поместите мышь на грелку, чтобы поддерживать температуру тела на уровне примерно 37 °C. Используя ватные тампоны и крем для удаления волос, аккуратно удалите волосы с кожи задних конечностей с правой стороны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крем для удаления волос следует использовать в достаточном количестве, чтобы покрыть заднюю конечность, особенно паховую область, где будет сделан разрез. Крем для удаления волос следует использовать в течение менее 3 минут и впоследствии удалить смоченными ватными тампонами 2-3 раза. - Уложите мышь в лежачем положении на грелку под рассекающим микроскопом. Используйте антисептик для кожи (см. Таблицу материалов)для дезинфекции кожи мыши. После этого используйте заостренные щипцы и хирургические ножницы, чтобы сделать разрез примерно 3-4 мм в середине паховой области. Схема процедуры приведена на рисунке 2.
- Удалите подкожно-жировую клетчатку осторожно с помощью тонкоконечных щипцов, чтобы обнажить проксимальный нервно-сосудистый пучок бедренной кости. Осторожно используйте тонкие заостренные щипцы, чтобы проткнуть мембрану бедренной оболочки. Используйте ватный тампон, смоченный физиологическим раствором, чтобы осторожно переместить бедренную артерию (FA) от бедренного нерва (FN) и бедренной вены (FV).
- Пропустите два рассасывающихся шва 7-0 через проксимальную ФА и сделайте двойные узлы с помощью пружинных ножниц для трансекции ФА между двумя стяжками.
- Чтобы обнажить дистальную ФА, пропустите рассасывающийся шов 7-0 через нижний край разреза и аккуратно перетащите разрез в область правой стороны колена задней конечности.
- Осторожно отодвиньте подкожную клетчатку в сторону, чтобы обнажить нервно-сосудистый пучок. Используйте тонкоконечные щипцы, чтобы проткнуть мембрану бедренной оболочки и рассечение ФА от FV и FN.
- Пропустите два рассасывающихся шва 7-0 через дистальную ФА и сделайте двойные узлы. Используйте пружинные ножницы для перерезания ФА между двумя связями.
ПРИМЕЧАНИЕ: На левой конечности не проводилось перевязки, которая служила контролем у каждой мыши. - После этого используйте 6-0 рассасывающихся швов, чтобы сшить разрез. Поместите мышь на грелку в чистую клетку и продолжайте следить за ее жизненно важными параметрами до выздоровления. Обеспечивают послеоперационные анальгетики: Бупренорфин с.c. (0,1 мг/кг массы тела каждые 8 ч в течение 48 ч). Через 48 ч после операции вводят метамизол в питьевую воду (24 мг/5мл воды соответствует дозе 200 мг/кг 4 раза в сутки).
2. Магнитно-резонансная томография
ПРИМЕЧАНИЕ: На следующий день после DLFA мыши должны пройти МРТ-сканирование для оценки закупорки ФА.
- Поместите мышь в прозрачную индукционную камеру и обезболите мышь 1,5-2% изофлурана в окружающем воздухе до потери корректирующего рефлекса.
- Поместите мышь на подогреваемую кровать для животных, оснащенную держателем для укусов и расположенную по направлению к магниту с помощью системы с лазерным управлением. Поддерживать температуру тела на уровне 37±1 °C.
- Во время получения изображения поддерживайте анестезию с 1,5-2% изофлурана в окружающем воздухе и контролируйте дыхание с помощью датчика давления.
- Получение изображений в поперечной ориентации среза с использованием трехмерной (3D) ангиографической последовательности времени полета (TOF) с параметром времени эха (TE)/времени повторения (TR)/угла флипа (FA) = 2 мс/12 мс/13°, четырех средних значений, матрицы сбора 178 x 144, реконструированной до 256 x 192 и 121 срезов, в результате чего изотропное разрешение составляет 0,15мм3. Чтобы подавить сигнал от вен, поместите срез насыщения дистально к задним конечностям.
3. Клиническая оценка и последующее наблюдение
- Оценить функциональное восстановление на1-м,3-м,5-м и7-мднях после операции можно с помощью функциональной балльной шкалы Тарлова18,19 (табл. 1).
4. Гистологическая оценка
- Через семь дней после операции нанесите инъекцию пентобарбитала (115 мг / кг) для эвтаназии мышей.
- Перфузирует фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), содержащий 1% параформальдегида (PFA), через левый сердечный желудочек (100 мл на мышь). Зафиксируйте двустороннюю икроножную мышцу (Gm) мышей в 4% PFA на ночь при 4 °C.
- Встроить образец в парафин в соответствии с ранее описаннымпротоколом 20.
- Вырежьте на микротоме участки парафинового тканевого блока толщиной 4-5 мкм. С помощью круглой кисти поместите разрезанные участки ткани на водяную баню при температуре 42°C.
- Вставьте слайд микроскопа в воду под углом 45° и аккуратно расположите его под группой собираемых секций.
- Осторожно поднимите горку из воды и дайте секциям прикрепиться к горке и высохнуть в течение ночи в настольном инкубаторе при 37 °C.
- Выполняют окрашивание гематоксилином/эозином (HE) парафиновых срезов.
- Поместите слайды, содержащие разделы, в держатели слайдов. Подготовьте 3 контейнера свежего ксилола и поместите слайды в каждый контейнер на 5 минут, чтобы депарафинизировать секции.
- Регидратируйте срезы, последовательно погружая ломтики в 96%, 80%, 70%, 50%, 30% этанол и деионизированную воду в течение 5 мин каждый.
- Окрашивание в раствор гематоксилина в течение 10 мин.
- Переложите ломтики в емкость с деионизированной водой и промойте, поместив под проточную водопроводную воду на 5 минут.
- С помощью микроскопа проверьте интенсивность окрашивания гематоксилином. Если окрашивание позволяет четко идентифицировать ядра клеток, переходите к следующему шагу. Если интенсивность окрашивания не облегчает идентификацию клеточных ядер или если интенсивность окрашивания слабая, поместите слайд в раствор гематоксилина на 1 мин, повторите промывку водой (шаг 4.4.4), а затем снова проверьте.
- Противоувлажнение в растворе эозина-Y в течение 5 мин.
- Обезвоживайте срезы, последовательно погружая ломтики в контейнеры, содержащие деионизированную воду и 30%, 50%, 70%, 80% и 96% этанола последовательно в течение 10 с каждый. Далее поместите секции последовательно в три контейнера со свежим ксилолом по 10 с каждый.
- Разместите слайды горизонтально на микроскопических картах хранения слайдов с секциями, обращенными вверх. Добавьте достаточное количество монтажного носителя на слайд и смонтируйте слайды с помощью чехлов.
- Выполните иммуногистохимическое (IHC) окрашивание парафиновых срезов.
- Повторите этапы депарафинизации и регидратации 4.4.1-4.4.2. Затем погрузите секции в контейнер с буфером цитрата натрия 10 мМ, рН 6, и доведите образец до кипения в микроволновой печи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку чрезмерный или недостаточный нагрев образцов может привести к непоследовательному окрашиванию, поддерживайте температуру чуть ниже температуры кипения в течение 10 минут. - Далее охладите секции на столешнице в течение 30 минут. После этого промыть секции в PBS три раза в течение 5 минут. Тщательно высушите область вокруг образца и нарисуйте большой круг вокруг образца с помощью гидрофобной ручки. .
ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не прикасайтесь к образцу. Маркировка гидрофобной ручкой создает гидрофобную границу, что облегчает использование меньшего объема раствора антител. - Гасит эндогенную пероксидазную активность путем помещения среза в 0,3%H2O2 в PBS в течение 10 мин. Блочные секции с 400 мкл блочного буфера (PBS содержат 3% бычьего сывороточного альбумина и 0,3% неионного моющего средства) в течение 1 ч при комнатной температуре в увлажненной камере.
- Промывайте секции в PBS в течение 5 мин. Затем добавьте 100-400 мкл разбавленного анти-CD31 антитела (1:250) достаточно, чтобы покрыть участок. После этого инкубируют секции в течение ночи при 4 °C в увлажненной камере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что секция полностью покрыта раствором антител. - Удалите первичное антитело и трижды промывайте срезы в PBS в течение 5 мин каждый.
- Приготовьте смесь 3,3'-диаминобензидина (DAB), добавив 1 каплю концентрата DAB к 1 мл разбавителя DAB, и хорошо перемешайте. После этого добавьте 100-400 мкл смеси DAB в срезы и внимательно следите за этим в течение 2 мин, пока не будет наблюдаться приемлемая интенсивность окрашивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что секция полностью покрыта смесью DAB. - После этого промойте под проточной водопроводной водой в течение 5 минут. Выполните окрашивание гематоксилином, как описано в шагах 4.4.3-4.4.5.
- Выполните окрашивание эозином-Y, описанное в шаге 4.4.6. Выполните этапы обезвоживания, описанные в шаге 4.4.7.
- Монтировали секции с помощью обшивки с помощью монтажного носителя. Используйте ImageJ для оценки процента положительной площади CD31 (%) в 5 случайно выбранных полях (40x), которые можно рассматривать как микрососудистую плотность, какописано ранее 21.
- Повторите этапы депарафинизации и регидратации 4.4.1-4.4.2. Затем погрузите секции в контейнер с буфером цитрата натрия 10 мМ, рН 6, и доведите образец до кипения в микроволновой печи.
5. Статистический анализ
- Используйте программное обеспечение для статистического анализа для выражения результатов в виде среднего ± стандартного отклонения и для выполнения непарного t-тестана сравнениях. Рассмотрим P < 0,05 статистически значимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Характеристики мышей ApoE-/-
Операции DLFA были успешно выполнены на 10 мышах для создания модели HLI, и ни одна из мышей не умерла после процедуры. Чтобы проследить за изменениями массы тела, мышей взвешивали перед процедурой DLFA (Pre-DLFA) и через 7 дней после операции DLFA (Post-DLFA). Вес до DLFA варьировался от 29,6 до 38,0 г (в среднем 34,74 ± 2,47 г), а вес после DLFA варьировался от 26,5 до 34,1 г (в среднем 30,77 ± 2,15 г), которые были значительно ниже весов до DLFA(P < 0,05, рисунок 3A). Время операции варьировалось от 15 до 47 мин (в среднем 34,2 ± 8,82 мин, не считая времени анестезии). Размер разреза у 10 мышей варьировался от 3 до 5 мм (в среднем 4,2 ± 0,63 мм).
МРТ-сканирование и функциональное восстановление
МРТ-сканирование очень четко показало, что проксимальные и дистальные области правой ФА не показали перфузии(рисунок 3C),что указывает на успех этого метода. Через сутки после операции результаты по шкале Тарлова были значительно снижены(P < 0,05). Хотя результаты медленно увеличивались в течение следующих дней, они все еще были ниже базового уровня до 7-го дня(P < 0,05, рисунок 3B). Эти тенденции согласуются с предыдущими докладами20. Некроза или развития гангренозной ткани не наблюдалось в двусторонних сторонах задних конечностей у любых мышей. Однако лапы ишемизированных задних конечностей у 7 мышей не смогли растянуться естественным образом по сравнению с контралатеральной стороной. Кроме того, лапы ишемизированных задних конечностей у 4 мышей демонстрировали незначительное обесцвечивание по сравнению с контралатеральной стороной(рисунок 3D).
Гистологический анализ
При окрашивании ПРАВОЙ ГМ-мышцы миофибры проявляли нерегулярный ишемический некроз. Пролиферирующие сателлитные клетки заменили некротические миофибры и были распределены в массе и/или с нерегулярной дисперсией. Миофибры проявляли воспалительную инфильтрацию многоядерными макрофагами. Миофибры в воспалительных областях утратили свои нормальные морфологические характеристики, и регенерированных миофиберов было немного. Поперечные участки этих регенерированных миофиберов были круглыми, цитоплазма окрашивалась в красный цвет, а в центре располагалось одно небольшое ядро или несколько ядер. Напротив, такого рода воспалительная картина не наблюдалась в левом Gm(рисунок 4). Окрашивание антителом CD31 проводили для идентификации эндотелиальных клеток сосуда в образцах Gm, а ImageJ использовали для оценки CD31-положительной области - суррогата микрососудистой плотности - в каждом из пяти полей зрения (40x) для каждого образца. Ишемические задние конечности демонстрировали значительно большую плотность микрососудистости, чем неишемическая сторона(P < 0,05, рисунок 5).
Рисунок 1:Оборудование и инструменты, необходимые для эксперимента. (A) Рассекающий микроскоп и грелка, необходимые для операции. (B) Хирургические инструменты: 1. 7-0 и 6-0 рассасывающихся швов, 2. держатель иглы, 3. беззубые щипцы, 4. пружинные ножницы, 5. мелкоконечные щипцы, 6. заостренные щипцы и 7. хирургические ножницы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Схематическая иллюстрация процедуры. (A и D) Небольшой разрез делается на паховой области для обнажения проксимального отдела бедренной кости А, который перевязывается. (B и E) Шов 6-0 используется для перетаскивания разреза в область колена, чтобы обнажить дистальную бедренную железу A, которая перевязывается. (C, Fи G) Сшивание разреза. Сокращения: Бедренная А = бедренная артерия; Бедренный N = бедренный нерв; Бедренная V = бедренная вена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Характеристики модели мыши PAD. (A) Сравнение массы тела до и через 7 дней после DLFA. (B)Функциональное восстановление, оцениваемое по шкале Тарлова. Магнитно-резонансная ангиография указывает на проксимальную и дистальную ФА в левой задней конечности (белая стрелка), а с правой стороны проксимальные и дистальные ФА исчезают. (D)Изменения во внешнем виде двусторонней задней конечности мышей No 2 и No 4, через 1 и 7 дней после DLFA. Показанные значения являются средними ± стандартным отклонением. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; непарный t-тест. Сокращения: PAD = заболевание периферических артерий; DLFA = двойная перевязка бедренной артерии; ФА = бедренная артерия; L = слева; R = справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Окрашивание икроножной мышцы. (A) Изображение с низким увеличением, показывающее окрашивание HE правого Gm через 7 дней после процедуры DLFA. Воспаление наблюдалось в правом Gm.(B)В правом Gm некротические миофибры проявляли воспалительную инфильтрацию макрофагами (белая стрелка). Мышечные волокна теряют свои нормальные морфологические характеристики. Регенерированных миофиберов (черная стрела) было очень мало. (C) Окрашивание нормальных миофибр правого Gm. (D) Контралатеральная / левая Gm (неишемическая) мышца показывает нормальную гистологическую картину. Шкала стержней: A = 200 мкм, B-D = 50 мкм. Сокращения: HE = гематоксилин-эозин; DLFA = двойная перевязка бедренной артерии; Gm = икроножная мышца; L = слева; R= справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Сравнение микрососудистой плотности двусторонней икроножной мышцы. (А)CD31-IHC окрашивание правого Гм-участка (черные стрелки). (B) Окрашивание CD31-IHC левого гм-сечения (черные стрелки). (C)Количественная оценка микрососудистой плотности правой стороны, которая была намного меньше, чем на левой стороне. Показанные значения являются средними ± стандартным отклонением. P < 0,00001; непарный t-тест. Шкала стержней: A, B = 20 мкм. Сокращения: CD31 = кластер дифференциации 31; IHC = иммуногистохимический; Gm = икроножная мышца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Тарлов Оценка | 0 | Нет движения |
| 1 | Едва ощутимое движение, не несущее вес | |
| 2 | Частое движение, несущий вес | |
| 3 | Вес опор, частичный грузоподъемность | |
| 4 | Прогулки с умеренным дефицитом | |
| 5 | Нормальная, но медленная ходьба | |
| 6 | Полная и быстрая ходьба |
Таблица 1: Функциональное озвучивание.
Дополнительная таблица S1: Резюме 25 документов из текущей литературы по созданию модели PAD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом исследовании сообщается о модифицированном, упрощенном и хирургически эффективном подходе к созданию модели HLI у мышей ApoE-/- с использованием двойного лигирования в проксимальных и дистальных областях ФА через разрез 3-4 мм без каких-либо необходимых лабораторных обновлений. Основной характеристикой этого метода является меньший размер разреза по сравнению сранеесообщенными исследованиями, описывающими мышиные модели HLI8,9,10,11,12,15,20,22,23,24.
Исторически сложилось так, что разрез был сделан от колена до среды плотной, паховой или даже брюшной полости для лучшего воздействия, в диапазоне от 0,5 до 2 см или более9,11,15,19,22,25,26 (обобщено в дополнительной таблице S1). В этой статье описывается хирургическая техника для достижения DLFA и, как следствие, HLI, у мышей с разрезом < 5 мм (4,2 ± 0,63 мм). ФА была перевязана до того, как она разветвилась в подколенную артерию и подкожную артерию, вызывая ишемию в нескольких группах мышц в задней конечности и приводя к умеренному стрессу у мышей. Хотя мыши функционально восстановились к7-му дню после операции (тарловский балл за сутки до операции 6 ± 0,1-й день после операции 3,9 ± 0,99 против 7-го дня после операции 5,2 ± 0,92), ишемическое поражение ГМ наблюдалось на гистологическом уровне. Во-первых, Gm в ишемизированных миофибрах ног проявлял нерегулярный ишемический некроз и был инфильтрирован многоядерными макрофагами, аналогично тому, что было зарегистрировано у пациентов с PAD27,28. Несмотря на атрофию миофибры, также наблюдалось несколько регенерированных миофибер, что соответствует предыдущему отчету29. Во-вторых, плотность микрососудистости в ишемическом Gm на7-й день после перевязки была выше, чем в неишемической ноге, о чем также сообщалось в Ministro et al.30. В последнее время основное внимание в терапии PAD уделяется не только увеличению плотности микрососудистости по сравнению с неишемической стороной, но и восстановлению вызванной ишемией потери жизнеспособной мышечной ткани, которая поддерживает образование новых сосудов, обеспечивая матрицу факторов роста и биомеханическую поддержку31. Таким образом, эта модель также дает широкое окно для проверки эффективности новых методов лечения с этими очагами. Кроме того, достижение HLI с меньшим разрезом соответствует концепции 3R экспериментов на животных как уточнение хирургической процедуры, то есть небольшой размер разреза кожи уменьшает травму и послеоперационную боль.
Идеальная животная модель также обеспечивает относительно длинное терапевтическое окно. Сообщалось и применялись различные хирургические процедуры для установления ишемии у мышей, и они оказывают различное влияние на восстановление кровотока21. Для индукции HLI хирургические методы обычно фокусируются на подвздошной артерии12,19,23,32,бедренной артерии24,33,34и их ветвях11,35,некоторые, включая бедренную вену, а также36,37. Поскольку уровень перевязки сосудов не влияет на восстановление кровотока, решающим фактором является степень повреждения в сосудистом дереве21. Для однократного перевязки бедренной или подвздошной артерии делается небольшой разрез в паховой или брюшной области, при этом взаимодействия других ветвей все еще сохраняются, а перфузионное восстановление в задней конечности мыши полностью восстанавливается в течение 7дней 21,38. Таким образом, одной перевязки недостаточно с точки зрения обеспечения подходящего терапевтического окна для проверки эффектов различных методов лечения. Если ветви от ФА также необходимо перевязать, разрез кожи должен быть сделан еще больше, что удлиняет время операции. Таким образом, HLI от DLFA у мышей предлагает подходящее терапевтическое окно, в котором улучшения, вызванныетерапией,могут эффективно контролироваться9,21,22,25.
Создание клинически значимой модели HLI на животных важно для проверки эффективности новых терапевтических подходов, то есть клеточной, стволовой или генной терапии для PAD2,3,4. Несколько моделей PAD были разработаны на мышах15,21,крысах39и кроликах40,41. Дель Джудиче и его коллеги создали модель ишемии задних конечностей кролика, созданную путем чрескожной, трансаурикулярной, дистальной эмболизации бедренной артерии калиброванными частицами, которые могут преодолеть некоторые ограничения существующих моделейживотных 40. Liddell et al.41 также создали модель PAD кролика, обмотав поверхностную FA с помощью эндоваскулярного подхода, что привело к снижению реперфузии задних конечностей. Хотя более крупные животные, такие как кролики, могут дать более убедительные результаты40,41,принимая методы лечения на шаг ближе к клиническому применению, однако они требуют повышенных затрат и времени для получения результатов.
Несмотря на гетерогенный профиль риска большинства пациентов с PAD, включая наследственные и поведенческие факторы42,мыши демонстрируют аномальный метаболизм жиров и симптомы гиперлипидемии, такие как общий холестерин, триглицериды, липопротеины очень низкой плотности и липопротеины средней плотности, воспроизводя некоторые из основных характеристик, наблюдаемых у пациентов с PAD. Кроме того, при диете с высоким содержанием жиров эти показатели значительно увеличиваются. Lo Sasso et al. сообщили, что у этих мышей накопление артериального жира происходит в возрасте 3 месяцев в возрасте43лет, и что увеличение поражений АС происходит с возрастом43 года. Таким образом, мыши ApoE-/- особенно хорошо подходят для модели острой и хронической ишемии-PAD, поскольку они рекапитулируют гиперхолестеринемию, обычно присутствующую у пациентов с PAD, и обеспечивают подходящую платформу для оценки различных методов лечения, направленных на содействие неоваскуляризации ишемизированных конечностей. Кроме того, соотношение цены и качества тестирования новых методов лечения на мышах ApoE-/- непревзойденно.
Несмотря на преимущества, упомянутые в предыдущих пунктах, у этой модели есть два ограничения. Во-первых, освоение этого метода требует от экспериментатора достаточного микрохирургического опыта и знакомства с анатомией задней конечности мыши. Во-вторых, ограниченное хирургическое воздействие и количество подкожно-жировой клетчатки в задней конечности мышей ApoE-/- увеличивают хирургическую трудность. Поэтому для успешной реализации данной методики требуется некоторая смежная практика. В заключение, это исследование сообщает о модифицированном и простом в реализации, хирургически эффективном подходе к созданию модели HLI у мышей ApoE-/- с использованием небольшого разреза. Небольшой разрез значительно снижает травму животного и может применяться большинством исследовательских групп без каких-либо лабораторных обновлений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что содержание статьи было составлено в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Викторию Скуде, Александра Шлунда и Феликса Хёрнера за отличную техническую поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
