Summary
Cet article démontre une approche chirurgicale efficace pour établir une ischémie aiguë chez la souris avec une petite incision. Cette approche peut être appliquée par la plupart des groupes de recherche sans aucune mise à niveau du laboratoire.
Abstract
Le but de cette étude est d’introduire et d’évaluer une approche chirurgicale modifiée pour induire une ischémie aiguë chez la souris qui peut être mise en œuvre dans la plupart des laboratoires animaliers. Contrairement à l’approche conventionnelle pour la double ligature de l’artère fémorale (DLFA), une incision plus petite sur la région inguinale droite a été faite pour exposer l’artère fémorale proximale (AF) à effectuer DLFA. Ensuite, à l’aide d’une suture 7-0, l’incision a été traînée vers la région du genou pour exposer l’AF distale. L’imagerie par résonance magnétique (IRM) sur les membres postérieurs bilatéraux a été utilisée pour détecter l’occlusion de l’AF après la chirurgie. À 0, 1, 3, 5 et 7 jours après la chirurgie, la récupération fonctionnelle des membres postérieurs a été évaluée visuellement et notée à l’aide de l’échelle de Tarlov. L’évaluation histologique a été réalisée après euthanasie des animaux 7 jours après le DLFA. Les procédures ont été effectuées avec succès sur la jambe droite chez dix souris ApoE- / - et aucune souris n’est morte lors d’une observation ultérieure. Les tailles d’incision chez les 10 souris étaient inférieures à 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Les résultats de l’IRM ont montré que le flux sanguin d’AF du côté ischémique était clairement bloqué. Les résultats de l’échelle de Tarlov ont démontré que la fonction des membres postérieurs a considérablement diminué après la procédure et s’est lentement rétablie au cours des 7 jours suivants. L’évaluation histologique a montré une réponse inflammatoire significative du côté ischémique et une densité microvasculaire réduite dans le membre postérieur ischémique. En conclusion, cette étude introduit une technique modifiée utilisant une incision miniature pour effectuer une ischémie des membres postérieurs (HLI) en utilisant DLFA.
Introduction
Il existe un besoin non satisfait de modèles animaux précliniques pour la recherche sur les maladies vasculaires telles que la maladie artérielle périphérique (MAP). Malgré les développements avancés dans le diagnostic et le traitement, il y avait plus de 200 millions de patients atteints d’AOMI en2018 1, et leur nombre est en constante augmentation. Bien que plusieurs nouvelles approches thérapeutiques2,3,4,5,6,7 aient été décrites, la traduction réussie de ces modalités thérapeutiques en application clinique reste une tâche ardue. Par conséquent, des modèles expérimentaux in vivo fiables et pertinents simulant l’état de la maladie humaine sont nécessaires pour étudier le mécanisme potentiel et l’efficacité de ces nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’AOMI6,7.
L’hyperlipidémie et l’athérosclérose (SA) sont les principaux facteurs de risque de développement de l’AOMI. Les souris ApoE-/- (avec un régime riche en graisses) présentent un métabolisme anormal des graisses et une hyperlipidémie et développent par la suite des plaques d’athérosclérose, ce qui fait des souris ApoE-/- le meilleur choix pour simuler l’AOMI cliniquement pertinente. Les modèles animaux HLI précliniques sont générés par double ligature de l’artère fémorale (DLFA), qui est l’approche la plus largement utilisée dans les laboratoires du monde entier8,9,10,11,12,13,14,15 pour simuler l’ischémie aiguë sur chronique. Cependant, cette approche nécessite généralement une incision relativement grande et invasive. En outre, cela conduit inévitablement les animaux (en particulier les souris) à souffrir d’une douleur accrue et d’une inflammation, ce qui influence également les résultats expérimentaux ultérieurs5,6,16,17. Cet article décrit un modèle HLI aigu sur chronique chez des souris APOE-/- en utilisant une très petite incision.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées conformément à la directive CE 2010/63/UE et ont été approuvées par la législation allemande locale (35-9185.81/G[1]239/18). Dix souris mâles ApoE-/- avec le fond C57BL / 6J, pesant 29,6-38,0 g, ont été logées sur un cycle clair / sombre de 12 h et nourries avec un régime occidental (1,25% de cholestérol et 21% de matières grasses) et de l’eau ad libitum pendant 12 semaines à partir de l’âge de 8 semaines. HLI a été effectué sur des souris âgées de 20 semaines comme décrit ci-dessous.
1. Induction de HLI chez les souris ApoE-/-
- Préparer l’équipement et les outils nécessaires pour la chirurgie (voir le tableau des matériaux et la figure 1). Stérilisez les instruments chirurgicaux par autoclavage avant utilisation et utilisez un stérilisateur à billes de verre pendant l’opération.
- Anesthésier la souris avec une injection sous-cutanée (S.C.) d’un mélange de midazolam (5 mg/kg), de médétomidine (0,05 mg/ml/kg) et de fentanyl (0,5 mg/kg) avant toutes les interventions chirurgicales.
- Après le début de l’anesthésie, utilisez la pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse et confirmez l’absence du réflexe de retrait de la pédale dans le membre antérieur et le membre postérieur.
- Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant pour maintenir la température corporelle centrale à environ 37 ° C. À l’aide de cotons-tiges et de crème dépilatoire, retirez soigneusement les poils de la peau des membres postérieurs du côté droit.
REMARQUE: La crème dépilatoire doit être utilisée en quantité suffisante pour couvrir les membres postérieurs, en particulier la région inguinale où l’incision sera faite. La crème dépilatoire doit être utilisée pendant une durée inférieure à 3 minutes et doit ensuite être retirée avec des cotons-tiges humidifiés 2 à 3 fois. - Posez la souris en position couchée sur le coussin chauffant sous un microscope à dissection. Utilisez un antiseptique cutané (voir le Tableau des matériaux)pour désinfecter la peau de la souris. Ensuite, utilisez des pinces pointues et des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision d’environ 3-4 mm au milieu de la région inguinale. Voir la figure 2 pour un schéma de la procédure.
- Retirez soigneusement le tissu adipeux sous-cutané à l’aide d’une pince pointue fine pour exposer le faisceau neurovasculaire fémoral proximal. Utilisez soigneusement les pinces pointues fines pour percer la membrane de la gaine fémorale. Utilisez un coton-tige humidifié avec une solution saline pour éloigner soigneusement l’artère fémorale (AF) du nerf fémoral (FN) et de la veine fémorale (FV).
- Passez deux sutures résorbables 7-0 à travers le FA proximal et faites des nœuds doubles à l’aide de ciseaux à ressort pour transecter le FA entre les deux attaches.
- Pour exposer l’AF distale, passez une suture résorbable 7-0 à travers le bord inférieur de l’incision et faites glisser doucement l’incision vers la région du côté droit du genou du membre postérieur.
- Déplacez soigneusement le tissu sous-cutané pour exposer le faisceau neurovasculaire. Utilisez de fines pinces pointues pour percer la membrane de la gaine fémorale et disséquer l’AF du FV et du FN.
- Passez deux sutures résorbables 7-0 à travers le FA distal et faites des nœuds doubles. Utilisez des ciseaux à ressort pour transecter le FA entre les deux traverses.
REMARQUE: Aucune ligature n’a été effectuée sur le membre gauche, qui a servi de contrôle chez chaque souris. - Ensuite, utilisez 6-0 sutures résorbables pour coudre l’incision. Placez la souris sur un coussin chauffant dans une cage propre et continuez à surveiller ses paramètres vitaux jusqu’à la récupération. Fournir des analgésiques postopératoires : Buprénorphine s.c. (0,1 mg/kg de poids corporel toutes les 8 heures pendant 48 h). 48 h après l’opération, administrer du métamizole dans l’eau potable (24 mg/5 mL d’eau correspond à une dose de 200 mg/kg 4 fois par jour).
2. Imagerie par résonance magnétique
REMARQUE: Un jour après DLFA, les souris doivent subir une IRM pour évaluer le blocage de l’AF.
- Placez la souris dans une chambre d’induction transparente et anesthésiez la souris avec 1,5 à 2% d’isoflurane dans l’air ambiant jusqu’à perte du réflexe de redressement.
- Placez la souris sur un lit d’animal chauffé équipé d’un porte-morsure et positionné vers l’aimant avec un système contrôlé par laser. Maintenir la température corporelle à 37±1 °C.
- Lors de l’acquisition d’images, maintenez l’anesthésie avec 1,5 à 2% d’isoflurane dans l’air ambiant et surveillez la respiration à l’aide d’une sonde de pression.
- Acquérir des images dans l’orientation transversale de la tranche en utilisant une séquence d’angiographie tridimensionnelle (3D) en temps de vol (TOF) avec paramètre temps d’écho (TE)/temps de répétition (TR)/angle de retournement (FA) = 2 ms/12 ms/13°, quatre moyennes, une matrice d’acquisition de 178 x 144 reconstruite en 256 x 192 et 121 tranches, résultant en une résolution isotrope de 0,15 mm3. Pour supprimer le signal des veines, placez une tranche de saturation distalement sur les membres postérieurs.
3. Évaluation clinique et suivi
- Estimer la récupération fonctionnelle dans les1er,3e,5eet 7e jours après la chirurgie en utilisant l’échelle de Tarlov de notation fonctionnelle18,19 (Tableau 1).
4. Évaluation histologique
- Sept jours après la chirurgie, appliquer une injection de pentobarbital (115 mg / kg) pour euthanasier les souris.
- Perfuser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 1 % de paraformaldéhyde (PFA) à travers le ventricule cardiaque gauche (100 mL par souris). Fixer le gastrocnémien bilatéral (Gm) des souris dans 4% de PFA pendant la nuit à 4 ° C.
- Incorporer l’échantillon dans de la paraffine selon le protocole20décrit précédemment.
- Couper des sections de 4 à 5 μm d’épaisseur du bloc de tissu incorporé à la paraffine sur un microtome. À l’aide d’un pinceau rond, placez les sections de tissu coupé dans le bain-marie maintenu à 42 ° C.
- Insérez la lame du microscope dans l’eau à un angle de 45° et positionnez-la soigneusement sous le groupe de sections à collecter.
- Soulevez délicatement la glissière de l’eau et laissez les sections s’attacher à la glissière et sécher pendant la nuit dans l’incubateur de paillasse à 37 ° C.
- Effectuer une coloration à l’hématoxyline/éosine (HE) des sections de paraffine.
- Placez les diapositives contenant les sections dans des supports de diapositives. Préparez 3 récipients de xylène frais et placez les lames dans chaque récipient pendant 5 minutes pour déparaffiniser les sections.
- Réhydrater les sections en trempant successivement les tranches dans de l’éthanol à 96%, 80%, 70%, 50%, 30% et de l’eau désionisée pendant 5 min chacune.
- Tache dans la solution d’hématoxyline pendant 10 min.
- Transférer les tranches dans un récipient d’eau désionisée et rincer en les plaçant sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
- À l’aide d’un microscope, vérifiez l’intensité de la coloration à l’hématoxyline. Si la coloration permet d’identifier clairement les noyaux cellulaires, passez à l’étape suivante. Si l’intensité de coloration ne facilite pas l’identification des noyaux cellulaires ou si l’intensité de la coloration est faible, placez la lame dans la solution d’hématoxyline pendant 1 min, répétez le lavage à l’eau (étape 4.4.4), puis vérifiez à nouveau.
- Contre-tache dans une solution d’éosine-Y pendant 5 min.
- Déshydrater les sections en trempant successivement les tranches dans des récipients contenant de l’eau désionisée et de l’éthanol 30%, 50%, 70%, 80% et 96% successivement pendant une durée de 10 s chacun. Ensuite, placez les sections séquentiellement dans trois récipients de xylène frais pendant 10 s chacun.
- Placez les diapositives horizontalement sur des cartes de stockage de diapositives microscopiques avec les sections orientées vers le haut. Ajoutez suffisamment de support de montage sur la diapositive et montez les diapositives avec des couvercles.
- Effectuer la coloration immunohistochimique (IHC) des sections de paraffine.
- Répétez les étapes de déparaffinisation et de réhydratation 4.4.1 à 4.4.2. Ensuite, immergez les sections dans un récipient avec un tampon de citrate de sodium de 10 mM, pH 6, et portez l’échantillon à ébullition au micro-ondes.
REMARQUE: Comme le surchauffage ou le sous-échauffement des échantillons peut provoquer des taches incohérentes, maintenez la température juste en dessous du point d’ébullition pendant 10 minutes. - Ensuite, refroidissez les sections sur une paillasse pendant 30 minutes. Par la suite, lavez les sections dans PBS trois fois pendant 5 min. Séchez soigneusement la zone autour de l’échantillon et dessinez un grand cercle autour de l’échantillon à l’aide d’un stylo hydrophobe. .
REMARQUE: Ne touchez jamais l’échantillon. Le marquage avec un stylo hydrophobe crée une limite hydrophobe, ce qui facilite l’utilisation d’un plus petit volume de solution d’anticorps. - Étancher l’activité endogène de la peroxydase en plaçant la section dans 0,3% H2O2 dans PBS pendant 10 min. Sections de bloc avec 400 μL de tampon bloc (PBS contient 3% d’albumine sérique bovine et 0,3% de détergent non ionique) pendant 1 h à température ambiante dans une chambre humidifiée.
- Lavez les sections dans PBS pendant 5 min. Ensuite, ajoutez 100-400 μL d’anticorps anti-CD31 dilués (1:250) assez pour couvrir la section. Ensuite, incuber des sections pendant la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée.
REMARQUE: Assurez-vous que la section est complètement recouverte de la solution d’anticorps. - Retirez l’anticorps primaire et lavez les sections trois fois dans du PBS pendant une durée de 5 minutes chacune.
- Préparer le mélange de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en ajoutant 1 goutte du concentré DAB à 1 mL du diluant DAB, et bien mélanger. Ensuite, ajoutez 100 à 400 μL de mélange DAB aux sections et surveillez attentivement à l’œil nu pendant 2 minutes jusqu’à ce qu’une intensité de coloration acceptable soit observée.
REMARQUE: Assurez-vous que la section est complètement recouverte du mélange DAB. - Ensuite, rincez à l’eau courante du robinet pendant 5 min. Effectuer la coloration à l’hématoxyline comme décrit aux étapes 4.4.3-4.4.5.
- Effectuer la coloration à l’éosine-Y décrite à l’étape 4.4.6. Effectuer les étapes de déshydratation décrites à l’étape 4.4.7.
- Montez les sections avec des couvercles à l’aide d’un support de montage - effectué. Utilisez ImageJ pour estimer le pourcentage de la surface CD31 positive (%) dans 5 champs sélectionnés au hasard (40x) qui peuvent être considérés comme une densité microvasculaire comme décrit précédemment21.
- Répétez les étapes de déparaffinisation et de réhydratation 4.4.1 à 4.4.2. Ensuite, immergez les sections dans un récipient avec un tampon de citrate de sodium de 10 mM, pH 6, et portez l’échantillon à ébullition au micro-ondes.
5. Analyse statistique
- Utilisez un logiciel d’analyse statistique pour exprimer les résultats sous forme de moyenne ±'écart-type et pour effectuer un test tnon apparié sur les comparaisons. Considérez P < 0,05 comme étant statistiquement significatif.
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Representative Results
Caractéristiques des souris ApoE-/-
Les chirurgies DLFA ont été effectuées avec succès sur 10 souris pour établir le modèle HLI, et aucune des souris n’est morte après la procédure. Pour suivre les changements de poids corporel, les souris ont été pesées avant la procédure DLFA (pré-DLFA) et 7 jours après la chirurgie DLFA (post-DLFA). Les poids pré-DLFA variaient de 29,6 à 38,0 g (moyenne de 34,74 ± 2,47 g), et les poids post-DLFA variaient de 26,5 à 34,1 g (moyenne de 30,77 ± 2,15 g), ce qui était significativement inférieur aux poids pré-DLFA(P < 0,05, Figure 3A). Le temps de la chirurgie variait de 15 à 47 min (moyenne de 34,2 ± 8,82 min, sans compter le temps d’anesthésie). La taille de l’incision chez 10 souris variait de 3 à 5 mm (moyenne de 4,2 ± 0,63 mm).
IRM et récupération fonctionnelle
Les IRM ont très clairement indiqué que les régions proximales et distales de l’AF droite ne présentaient aucune perfusion(Figure 3C),indiquant le succès de cette méthode. Un jour après la chirurgie, les résultats de l’échelle de Tarlov ont été significativement diminués(P < 0,05). Bien que les résultats aient lentement augmenté au cours des jours suivants, ils étaient toujours inférieurs à la valeur de référence jusqu’au jour 7(P < 0,05, figure 3B). Ces tendances sont conformes aux rapports précédents20. Aucune nécrose ou développement de tissu gangreneux n’a été observé dans les côtés bilatéraux des membres postérieurs des souris. Cependant, les pattes des membres postérieurs ischémiques chez 7 souris étaient incapables de s’étirer naturellement par rapport au côté controlatéral. De plus, les pattes des membres postérieurs ischémiques chez 4 souris présentaient une légère décoloration par rapport à la face controlatérale (Figure 3D).
Analyse histologique
Dans la coloration HE du muscle Gm droit, les myofibres présentaient une nécrose ischémique irrégulière. Les cellules satellites proliférantes avaient remplacé les myofibres nécrotiques et étaient distribuées en masse et/ou avec une dispersion irrégulière. Les myofibres présentaient une infiltration inflammatoire par des macrophages multinucléés. Les myofibers dans les régions inflammatoires avaient perdu leurs caractéristiques morphologiques normales et il y avait peu de myofibres régénérés. Les sections transversales de ces myofibres régénérés étaient rondes, le cytoplasme était coloré en rouge et un petit noyau ou plusieurs noyaux étaient situés au centre. En revanche, ce type de schéma inflammatoire n’a pas été observé dans le Gm gauche(Figure 4). La coloration des anticorps CD31 a été effectuée pour identifier les cellules endothéliales du vaisseau dans les échantillons Gm, et ImageJ a été utilisée pour évaluer la zone CD31 positive - un substitut de la densité microvasculaire - dans chacun des cinq champs de vision (40x) pour chaque échantillon. Les membres postérieurs ischémiques présentaient une densité microvasculaire significativement plus élevée que le côté non ischémique (P < 0,05, Figure 5).
Figure 1: Équipement et outils nécessaires à l’expérience. (A) Microscope à dissection et coussin chauffant requis pour la chirurgie. (B) Outils chirurgicaux: 1. sutures résorbables 7-0 et 6-0, 2. porte-aiguille, 3. pinces édentées, 4. ciseaux à ressort, 5. pinces pointues fines, 6. pinces pointues et 7. ciseaux chirurgicaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Illustration schématique de la procédure. (A et D) Une petite incision est pratiquée sur la région inguinale pour exposer l’A fémoral proximal, qui est ligaturé. (B et E) Une suture 6-0 est utilisée pour faire glisser l’incision vers la région du genou afin d’exposer le fémoral distal A, qui est ligaturé. (C, Fet G) Couture de l’incision. Abréviations : Fémoral A = artère fémorale ; N fémoral = nerf fémoral; V fémoral = veine fémorale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Caractéristiques du modèle de souris PAD. (A) Comparaison du poids corporel avant et 7 jours après DLFA. (B) Récupération fonctionnelle évaluée par l’échelle de Tarlov. (C) L’angiographie par résonance magnétique indique l’AF proximale et distale dans le membre postérieur gauche (flèche blanche), et sur le côté droit, l’AF proximale et distale disparaît. (D) Changements dans l’apparence du membre postérieur bilatéral des souris n° 2 et n° 4, 1 et 7 jours après le DLFA. Les valeurs indiquées sont la moyenne ± l’écart-type. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; t-testnon apparié. Abréviations: PAD = maladie artérielle périphérique; DLFA = double ligature de l’artère fémorale; FA = artère fémorale; L = gauche; R = droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Coloration HE du muscle gastrocnémien. (A) Image à faible grossissement montrant une coloration HE du Gm droit 7 jours après la procédure DLFA. Une inflammation a été observée dans le Gm droit. (B) Dans le Gm droit, les myofibres nécrotiques ont présenté une infiltration inflammatoire par les macrophages (flèche blanche). Les fibres musculaires perdent leurs caractéristiques morphologiques normales. Il y avait très peu de myofibres régénérés (flèche noire). (C) Coloration HE des myofibres normaux du Gm droit. (D) Le muscle Gm (non ischémique) controlatéral/gauche présente un schéma histologique normal. Barres d’échelle : A = 200 μm, B-D = 50 μm. Abréviations : HE = hématoxyline-éosine ; DLFA = double ligature de l’artère fémorale; Gm = gastrocnémien; L = gauche; R= droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5: Comparaison de la densité microvasculaire du muscle gastrocnémien bilatéral. (A) Coloration CD31-IHC de la section Gm droite (flèches noires). (B) Coloration CD31-IHC de la section Gm gauche (flèches noires). (C) Quantification de la densité microvasculaire du côté droit, qui était bien inférieure à celle du côté gauche. Les valeurs indiquées sont la moyenne ± l’écart-type. P < 0,00001; t-testnon apparié. Barres d’échelle: A, B = 20 μm. Abréviations : CD31 = groupe de différenciation 31 ; IHC = immunohistochimique; Gm = gastrocnémien. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Partition de Tarlov | 0 | Pas de mouvement |
| 1 | Mouvement à peine perceptible, non porteur de poids | |
| 2 | Mouvements fréquents, non porteurs de poids | |
| 3 | Supporte le poids, le port partiel | |
| 4 | Promenades avec un léger déficit | |
| 5 | Marche normale mais lente | |
| 6 | Marche complète et rapide |
Tableau 1 : Notation fonctionnelle.
Tableau supplémentaire S1 : Résumé de 25 articles de la littérature actuelle sur l’établissement du modèle d’AOMI. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Cette étude rapporte une approche modifiée, simplifiée et chirurgicalement efficace pour établir un modèle HLI chez des souris ApoE- / - en utilisant une double ligature dans les régions proximale et distale de l’AF à travers une incision de 3-4 mm sans aucune mise à niveau de laboratoire requise. La principale caractéristique de cette méthode est la plus petite taille de l’incision par rapport aux études précédemment rapportées décrivant les modèles HLI de souris8,9,10,11,12 , 15,20,22,23,24 .
Historiquement, une incision a été faite du genou au milieu serré, inguinal, ou même à l’abdomen pour une meilleure exposition, allant de 0,5 à 2 cm ou plus9,11,15,19,22,25,26 (résumé dans le tableau supplémentaire S1). Cet article décrit une technique chirurgicale pour obtenir le DLFA et, par conséquent, l’HLI, chez la souris avec une incision < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). L’AF a été ligaturé avant de se ramifier dans l’artère poplitée et l’artère saphène, provoquant une ischémie dans plusieurs groupes musculaires du membre postérieur et entraînant un stress modéré chez la souris. Bien que les souris se soient rétablies fonctionnellementau 7 e jour après l’opération (score de Tarlov jour avant l’opération 6 ± 0, 1er jour après l’opération 3,9 ± 0,99 vs7 e jour après l’opération 5,2 ± 0,92), des dommages ischémiques ont été observés dans Gm au niveau histologique. Tout d’abord, les Gm dans les myofibers ischémiques de la jambe présentaient une nécrose ischémique irrégulière et étaient infiltrés par des macrophages multinucléés, similaires à ce qui a été rapporté chez les patients atteints d’AOMI27,28. Malgré l’atrophie des myofibers, quelques myofibers régénérés ont également été observés, ce qui est conforme à un rapport précédent29. Deuxièmement, la densité microvasculaire dans le Gm ischémique le 7e jour après la ligature était plus élevée que dans la jambe non ischémique, ce qui a également été rapporté par Ministro et al.30. L’accent mis récemment sur la thérapie DEA ne se limite pas seulement à augmenter la densité microvasculaire par rapport au côté non ischémique, mais aussi à la restauration de la perte induite par l’ischémie de tissu musculaire viable, qui soutient la formation de nouveaux vaisseaux en fournissant une matrice de facteurs de croissance et un soutien biomécanique31. Ainsi, ce modèle donne également une large fenêtre pour tester l’efficacité de nouvelles thérapies avec ces foyers. De plus, l’obtention de l’HLI avec une incision plus petite correspond au concept 3R de l’expérimentation animale en tant que raffinement de la procédure chirurgicale, c’est-à-dire que la petite taille incisionnelle de la peau diminue le traumatisme et la douleur postopératoire.
Un modèle animal idéal offre également une fenêtre thérapeutique relativement longue. Diverses procédures chirurgicales pour établir l’ischémie chez la souris ont été rapportées et appliquées, et elles exercent des effets différents sur la restauration du flux sanguin21. Pour l’induction de l’HLI, les méthodes chirurgicales se concentrent normalement sur l’artère iliaque12,19,23,32, artère fémorale24,33,34, et leurs branches11,35, certaines incluant la veine fémoraleainsi que 36,37. Comme le niveau de ligature vasculaire n’a aucun effet sur la restauration du flux sanguin, le facteur décisif est l’étendue de la lésion dans l’arbre vasculaire21. Pour une seule ligature de l’artère fémorale ou iliaque, une petite incision est pratiquée dans la région inguinale ou abdominale, tandis que les autres interactions de branche sont toujours maintenues, et la restauration de la perfusion dans le membre postérieur de la souris récupère complètement dans les 7 jours21,38. Ainsi, une seule ligature n’est pas suffisante pour fournir une fenêtre thérapeutique appropriée pour tester les effets de différents traitements. Si les branches de l’AF doivent également être ligaturées, l’incision cutanée doit être encore plus grande, ce qui allonge le temps chirurgical. Par conséquent, HLI par DLFA chez la souris offre une fenêtre thérapeutique appropriée dans laquelle les améliorations induites par la thérapie peuvent être surveillées efficacement9,21,22,25.
L’établissement d’un modèle animal HLI cliniquement pertinent est important pour tester l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques, c’est-à-dire la thérapie cellulaire, cellulaire, cellulaire ou génique pourl’AOMI2,3,4. Plusieurs modèles d’AOMI ont été développés chez des souris15,21,des rats39et des lapins40,41. Del Giudice et ses collègues ont établi un modèle d’ischémie des membres postérieurs du lapin créé par embolisation de l’artère fémorale percutanée, transauriculaire et distale avec des particules calibrées qui peuvent surmonter certaines des limites des modèles animaux existants40. Liddell et al.41 ont également créé un modèle d’AOMI de lapin en enroulant l’AF superficielle par une approche endovasculaire, ce qui a entraîné une réduction de la reperfusion des membres postérieurs. Bien que les animaux plus gros, tels que les lapins, puissent donner des résultats plus convaincants40,41, ce qui rapproche les thérapies de l’application clinique, elles nécessitent toutefois un coût et un temps accrus pour obtenir des résultats.
Malgré le profil de risque hétérogène de la plupart des patients atteints d’AOMI, y compris les facteurs héréditaires et comportementaux42,les souris ApoE- / - présentent un métabolisme anormal des graisses et des symptômes d’hyperlipidémie, tels que le cholestérol total, les triglycérides, les lipoprotéines de très basse densité et les lipoprotéines de densité intermédiaire, reproduisant certaines des principales caractéristiques observées chez les patients atteints d’AOMI. De plus, avec le régime riche en graisses, ces indicateurs augmentent considérablement. Lo Sasso et al. ont rapporté que chez ces souris, l’accumulation de graisse artérielle se produit à l’âge de 3 mois de43ans, et qu’une augmentation des lésions AS se produit avec l’âge avancéde 43 ans. Ainsi, les souris ApoE-/- sont particulièrement bien adaptées au modèle d’ischémie-AOMI aiguë-chronique car elles récapitulent l’hypercholestérolémie couramment présente chez les patients atteints d’AOMI et fournissent une plate-forme appropriée pour évaluer diverses thérapies visant à promouvoir la néovascularisation des membres ischémiques. De plus, le rapport qualité-prix des tests de nouvelles thérapies avec des souris ApoE-/- est imbattable.
Malgré les avantages mentionnés dans les paragraphes ci-dessus, il y a deux limites à ce modèle. Tout d’abord, la maîtrise de cette méthode nécessite que l’expérimentateur ait une expérience microchirurgicale suffisante et une familiarité avec l’anatomie du membre postérieur de la souris. Deuxièmement, l’exposition chirurgicale limitée et la quantité de tissu adipeux sous-cutané dans le membre postérieur des souris ApoE-/- augmentent la difficulté chirurgicale. Par conséquent, une certaine pratique connexe est nécessaire pour une mise en œuvre réussie de cette technique. En conclusion, cette étude fait état d’une approche modifiée et facile à mettre en œuvre et chirurgicalement efficace pour établir un modèle HLI chez des souris ApoE-/- à l’aide d’une petite incision. La petite incision réduit considérablement le traumatisme de l’animal et peut être appliquée par la plupart des groupes de recherche sans aucune mise à niveau du laboratoire.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que le contenu de l’article a été composé en l’absence de relations commerciales ou financières qui pourraient être interprétées comme un conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Viktoria Skude, Alexander Schlund et Felix Hörner pour l’excellent support technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
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