Summary
Denna artikel visar en effektiv kirurgisk strategi för att upprätta akut ischemi hos möss med ett litet snitt. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas av de flesta forskargrupper utan laboratorieuppgraderingar.
Abstract
Syftet med denna studie är att införa och utvärdera ett modifierat kirurgiskt tillvägagångssätt för att inducera akut ischemi hos möss som kan implementeras i de flesta djurlaboratorier. I motsats till den konventionella metoden för dubbel ligatur av femorala gatan (DLFA), gjordes ett mindre snitt på rätt inguinallymfknutor regionen att exponera proximal femorala gatan (FA) att utföra DLFA. Sedan, med hjälp av en 7-0 suture, drogs snittet till knä regionen för att avslöja distala FA. Magnetic resonance imaging (MRI) på bilaterala bakben användes för att upptäcka FA ocklusion efter operationen. Vid 0, 1, 3, 5 och 7 dagar efter operationen bedömdes funktionell återhämtning av bakbenen visuellt och graderades med tarlovskalan. Histologic utvärdering utfördes efter avlivning av djuren 7 dagar efter DLFA. Förfarandena utfördes framgångsrikt på höger ben i tio ApoE-/- möss, och inga möss dog under efterföljande observation. Snittstorlekarna i alla 10 möss var mindre än 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). MRI resultat visade att FA blodflödet i den skandinaviska sidan var tydligt blockerad. Tarlov skala resultaten visade att hind lem funktion minskade avsevärt efter förfarandet och långsamt återhämtade sig under de följande 7 dagarna. Histologic utvärdering visade en betydande inflammatoriska svar på den skandinaviska sidan och minskad microvascular densitet i skandinaviska bakbenet. Sammanfattningsvis introducerar denna studie en modifierad teknik med hjälp av ett miniatyrsnitt för att utföra hind limb ischemi (HLI) med DLFA.
Introduction
Det finns ett ouppfyllt behov av prekliniska djurmodeller för forskning inom kärlsjukdomar som perifer artärsjukdom (PAD). Trots den avancerade utvecklingen inom diagnos och behandling fanns det mer än 200 miljoner patienter med PAD 20181, och deras antal ökar ständigt. Även om flera nya terapeutiska metoder2,3,4,5,6,7 har beskrivits, framgångsrik översättning av dessa terapeutiska modaliteter till klinisk tillämpning är fortfarande en skrämmande uppgift. Därför krävs tillförlitliga och relevanta in vivo-experimentella modeller som simulerar tillståndet för sjukdomen hos människa för att undersöka den potentiella mekanismen och effektiviteten hos dessa nya terapeutiska metoder för att behandla PAD6,7.
Hyperlipidemi och ateroskleros (AS) är de viktigaste riskfaktorerna för utvecklingen av PAD. ApoE-/- möss (på en fettrik diet) visar onormal fettmetabolism och hyperlipidemi och utvecklar därefter aterosklerotiska plack som gör ApoE-/- möss som det bästa valet för att simulera den kliniskt relevanta PAD. Prekliniska HLI djurmodeller genereras genom dubbel ligatur av lårbensartären (DLFA), som är den mest använda metoden i laboratorier över hela världen8,9,10,11,12,13,14,15 för att simulera akut-på-kronisk ischemi. Detta tillvägagångssätt kräver dock vanligtvis ett relativt stort och invasivt snitt. Dessutom leder det oundvikligen till att djuren (särskilt möss) lider av ökad smärtskada och inflammation, vilket också påverkar de efterföljande experimentella resultaten5,6,16,17. Detta dokument beskriver en akut-på-kronisk HLI modell i APOE-/- möss med hjälp av ett mycket litet snitt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla försök utfördes enligt EG:s riktlinje (EG 2010/63/EU och har godkänts genom den lokala tyska lagstiftningen (35–9185.81/G[1]239/18). Tio manliga ApoE-/- möss med C57BL/6J bakgrund, väger 29,6-38,0 g, var inhyst på en 12 h ljus / mörk cykel och matas en västerländsk diet (1,25% kolesterol och 21% fett) och vatten ad libitum i 12 veckor från 8 veckors ålder. HLI utfördes på 20 veckor gamla möss enligt beskrivningen nedan.
1. Induktion av HLI i ApoE-/- möss
- Förbered nödvändig utrustning och verktyg för kirurgi (se tabellen över material och figur 1). Sterilisera de kirurgiska instrumenten via autoklavering före användning och använd en glaspärlasteriliserare under operationen.
- Bedöva musen med en subkutan injektion (S.C.) av en blandning av midazolam (5 mg/kg), medetomidin (0,05 mg/ml/kg) och fentanyl (0,5 mg/kg) före alla kirurgiska ingrepp.
- Efter anestesins början, använd veterinärsalvan på ögonen för att förhindra torrhet och bekräfta frånvaron av pedalabstinensreflexen i förbenet och bakbenet.
- Placera därefter musen på en värmedyna för att hålla kärnkroppstemperaturen vid cirka 37 °C. Använd bomullspinne och hårborttagningskräm, ta försiktigt bort håret från bakbenets hud på höger sida.
OBS: Hårborttagningskrämen ska användas i tillräcklig mängd för att täcka baklimben, särskilt den inguinallymfknutor region där snittet kommer att göras. Hårborttagningskrämen ska användas under en period av mindre än 3 minuter och ska därefter avlägsnas med fuktade bomullspinnar 2 till 3 gånger. - Lägg musen i ryggläge på värmeplattan under ett dissekerande mikroskop. Använd ett antiseptiskt hudmedel (se tabellen över material)för att desinficera musens hud. Efteråt, använd spetsiga tångar och kirurgisk sax för att göra ett cirka 3-4 mm snitt i mitten av inguinal regionen. Se bild 2 för en schema för proceduren.
- Ta bort den subkutana fettvävnaden försiktigt med hjälp av fina spetsiga tångar för att exponera proximal femorala lårbensneurovaskulära bunten. Använd försiktigt de fina spetsiga tångarna för att genomborra lårbensslidan. Använd en bomullspinne fuktad med saltlösning för att flytta lårbensartären (FA) försiktigt bort från lårbensnerven (FN) och lårbensvenen (FV).
- Passera två 7-0 absorberbara suturer genom den proximala FA, och gör dubbla knutar med vårsax för att transect FA mellan de två banden.
- För att exponera distala FA, passera en 7-0 absorberbar sutur genom snittets nedre kant och dra försiktigt snittet till regionen på höger sida av knäet i bakbenet.
- Flytta den subkutana vävnaden åt sidan noggrant för att exponera neurovaskulära bunten. Använd fina spetsiga tångar för att genomborra lårbensslidan och dissekera FA från FV och FN.
- Passera två 7-0 absorberbara suturer genom den distala FA, och gör dubbla knutar. Använd vårsaxen för att transect FA mellan de två banden.
OBS: Ingen ligatur utfördes på vänster lem, som fungerade som en kontroll i varje mus. - Efteråt, använd 6-0 absorberbara suturer för att sy snittet. Placera musen på en värmeplatta i en ren bur och fortsätt att övervaka dess vitala parametrar tills återhämtningen. Ge postoperativa smärtstillande medel: Buprenorfin s.c. (0,1 mg/kg kroppsvikt var 8: e timme i 48 timmar). 48 h efter operationen, administrera metamizol i dricksvatten (24 mg/5mL vatten motsvarar en dos på 200 mg/kg 4 gånger dagligen).
2. Magnetisk resonanstomografi
OBS: En dag efter DLFA måste mössen genomgå MR-skanningar för att bedöma FA-blockering.
- Placera musen i en genomskinlig induktionskammare och bedöva musen med 1,5-2% isofluran i omgivande luft tills högerreflexen har förlorats.
- Placera musen på en uppvärmd djurbädd utrustad med en bithållare och placerad mot magneten med ett laserstyrt system. Håll kroppstemperaturen vid 37±1 °C.
- Under bildförvärvet, upprätthålla anestesi med 1,5-2% isofluran i omgivande luft och övervaka andningen med hjälp av en trycksond.
- Hämta bilder i den tvärgående segmentorienteringen med hjälp av en tredimensionell (3D) flygtids sekvens (TOF) angiografisekvens med parameter echo time (TE)/repetitionstid (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, fyra medelvärden, en förvärvsmatris på 178 x 144 rekonstruerad till 256 x 192 och 121 segment, vilket resulterar i en isotrop upplösning på 178 x 144 rekonstruerad till 256 x 192 och 121 segment, vilket resulterar i en isotrop upplösning på 0,1mm. För att undertrycka signalen från venerna, placera en mättnadsskiva distally till bakbenen.
3. Klinisk utvärdering och uppföljning
- Uppskatta den funktionella återhämtningen i 1st,3rd,5:eoch 7:e dagarna efter operationen genom att använda den funktionella poängsättningen Tarlov skala18,19 (tabell 1).
4. Histologic utvärdering
- Sju dagar efter operationen, applicera pentobarbital injektion (115 mg/kg) för att avliva mössen.
- Perfuse fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som innehåller 1% paraformaldehyd (PFA) genom vänster hjärt ventrikel (100 ml per mus). Fixera mössens bilaterala gastrocnemius (Gm) i 4% PFA över natten vid 4 °C.
- Bädda in provet i paraffin enligt det tidigare beskrivna protokollet20.
- Skär 4-5 μm tjocka delar av det paraffininbäddade vävnadsblocket på en mikrotom. Placera de skurna vävnadssektionerna i vattenbadet vid 42°C med hjälp av en rund pensel.
- Sätt in mikroskopet i vattnet i 45° vinkel och placera det försiktigt under den grupp av sektioner som ska samlas in.
- Lyft försiktigt upp rutschkanan från vattnet och låt sektionerna fästas på rutschkanan och torka över natten i bänkinkubatorn vid 37 °C.
- Utför hematoxylin/eosin (HE) färgning av paraffin sektionerna.
- Placera bilderna som innehåller avsnitten i bildhållarna. Förbered 3 behållare med färsk xylen och placera rutschkanorna i varje behållare i 5 minuter för att deparaffinisera sektionerna.
- Rehydrera sektionerna genom att doppa skivorna successivt i 96%, 80%, 70%, 50%, 30% etanol och avjoniserat vatten i 5 min vardera.
- Fläck i hematoxilinlösning i 10 min.
- Överför skivorna till en behållare med avjoniserat vatten och skölj genom att placera under rinnande kranvatten i 5 min.
- Med hjälp av ett mikroskop, kontrollera intensiteten av hematoxylinfärgning. Om färgningen gör det möjligt att tydligt identifiera cellkärnorna, fortsätt till nästa steg. Om färgningsintensiteten inte underlättar identifieringen av cellkärnor eller om färgningsintensiteten är svag, placera bilden i hemoxylinlösningen i 1 min, upprepa tvätten med vatten (steg 4.4.4) och kontrollera sedan igen.
- Mottain i eosin-Y lösning i 5 min.
- Dehydrera sektionerna genom att doppa skivorna successivt i behållare som innehåller avjoniserat vatten och 30%, 50%, 70%, 80% och 96% etanol successivt under en varaktighet 10 s vardera. Placera sedan sektionerna sekventiellt i tre behållare med färsk xylen i 10 s vardera.
- Placera bilderna vågrätt på mikroskopiska bildlagringskartor med sektionerna vända uppåt. Lägg till tillräckligt med monteringsmedium på bilden och montera bilderna med täckglas.
- Utför immunohistochemical (IHC) färgning av paraffin avsnitten.
- Upprepa deparaffinering och rehydrering steg 4.4.1-4.4.2. Sänk sedan ned sektionerna i en behållare med 10 mM natriumcitratbuffert, pH 6, och koka upp provet i en mikrovågsugn.
OBS: Eftersom över- eller underuppvärmning av prover kan orsaka inkonsekvent färgning, håll temperaturen på strax under kokpunkten i 10 min. - Kyl sedan sektionerna på en bänkskiva i 30 min. Tvätta därefter sektionerna i PBS tre gånger i 5 min. Torka försiktigt området runt provet och rita en stor cirkel runt provet med hjälp av en hydrofobisk penna. .
OBS: Rör aldrig provet. Märkning med en hydrofobisk penna skapar en hydrofob gräns, vilket underlättar användningen av en mindre volym antikroppslösning. - Släck endogen peroxidasaktivitet genom att placera sektionen i 0,3% H2O2 i PBS i 10 min. Blocksektioner med 400 μL blockbuffert (PBS innehåller 3 % bovint serumalbumin och 0,3 % icke-joniskt tvättmedel) i 1 h vid rumstemperatur i en fuktad kammare.
- Tvätta sektionerna i PBS i 5 min. Tillsätt sedan 100-400 μL utspädd anti-CD31-antikropp (1:250) tillräckligt för att täcka sektionen. Därefter inkuberar du sektioner över natten vid 4 °C i en fuktad kammare.
OBS: Se till att sektionen är helt täckt med antikroppslösningen. - Ta bort den primära antikroppen och tvätta sektionerna tre gånger i PBS under en period av 5 min vardera.
- Förbered 3, 3'-diaminobenzidine (DAB) blandningen genom att tillsätta 1 droppe DAB-koncentrat till 1 ml DAB-spädningsspelet och blanda väl. Tillsätt därefter 100-400 μL DAB-blandningen till sektionerna och övervaka noggrant med öga i 2 minuter tills en acceptabel färgningsintensitet observeras.
OBS: Se till att sektionen är helt täckt med DAB-blandningen. - Skölj sedan under rinnande kranvatten i 5 min. Utför hematoxylinfärgning enligt beskrivningen i steg 4.4.3-4.4.5.
- Utför eosin-Y färgning beskrivs i steg 4.4.6. Utför uttorkningssteg som beskrivs i steg 4.4.7.
- Monterade sektionerna med täckglas med monteringsmedium. Använd ImageJ för att uppskatta procenten av CD31-positivt område (%) i 5 slumpmässigt utvalda fält (40x) som kan betraktas som mikrovaskulär densitet enligt tidigare beskrivna21.
- Upprepa deparaffinering och rehydrering steg 4.4.1-4.4.2. Sänk sedan ned sektionerna i en behållare med 10 mM natriumcitratbuffert, pH 6, och koka upp provet i en mikrovågsugn.
5. Statistisk analys
- Använd programvara för statistisk analys för att uttrycka resultaten som medelvärde ± standardavvikelse och för att utföra oparat t-testpå jämförelserna. Anser att P < 0,05 är statistiskt signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Egenskaper hos ApoE-/- möss
DLFA operationer utfördes framgångsrikt på 10 möss för att fastställa HLI-modellen, och ingen av mössen dog efter förfarandet. För att följa förändringar i kroppsvikt vägdes möss före DLFA-proceduren (Pre-DLFA) och 7 dagar efter DLFA-operationen (Post-DLFA). Pre-DLFA vikter varierade från 29,6 till 38,0 g (medelvärdet 34,74 ± 2,47 g), och vikterna efter DLFA varierade från 26,5 till 34,1 g (medelvärdet 30,77 ± 2,15 g), som var betydligt lägre än pre-FA DL-vikterna (P < 0,05). Tiden för operationen varierade från 15 till 47 min (medelvärdet 34,2 ± 8,82 min, exklusive anestesitiden). Snittstorleken hos 10 möss varierade från 3 till 5 mm (medelvärdet 4,2 ± 0,63 mm).
MR-skanning och funktionell återhämtning
MRI skanningar mycket tydligt anges att proximal och distala regioner i rätt FA visade ingen perfusion (figur 3C), som anger framgången för denna metod. En dag efter operationen minskade Tarlovskalans resultat avsevärt (P < 0,05). Även om resultaten långsamt ökade under de följande dagarna var de fortfarande lägre än baslinjen fram till dag 7 (P < 0,05, figur 3B). Dessa trender överensstämmer med tidigare rapporter20. Ingen nekros eller gangrenous vävnad utveckling observerades i de bilaterala sidorna av bakbenen av några möss. Tassarna i de skandinaviska bakbenen i 7 möss kunde dock inte sträcka sig naturligt jämfört med den kontralaterala sidan. Dessutom uppvisade tassar i de ischemiska bakbenen i 4 möss liten missfärgning jämfört med den kontralaterala sidan (figur 3D).
Histologisk analys
I HE färgning av rätt Gm muskel, myofibers uppvisade oregelbundna skandinaviska nekros. Proliferating satellitceller hade ersatt necrotic myofibrers och distribuerades i en massa och/eller med oregelbundna dispersion. Myofibers uppvisade inflammatorisk infiltration av multinukleära makrofager. Myofibers i de inflammatoriska regionerna hade förlorat sina normala morfologiska egenskaper, och det fanns få regenererade myofibrer. Tvärgående delar av dessa regenererade myofibers var runda, cytoplasman färgades röd och en liten kärna eller flera kärnor var belägna i mitten. Däremot observerades inte denna typ av inflammatoriskt mönster i den vänstra Gm (figur 4). CD31 antikropp färgning utfördes för att identifiera endotel celler i fartyget i Gm prover, och ImageJ användes för att utvärdera CD31-positiva området - en surrogat för mikrovaskulära densitet-i vart och ett av fem synfält (40x) för varje prov. Ischemiska bakben uppvisade betydligt mer mikrovaskulär densitet än den icke-ischemiska sidan (P < 0,05, figur 5).
Figur 1: Utrustning och verktygsom krävsför försöket. B)Kirurgiska verktyg: 1. 7-0 och 6-0 absorberbara suturer, 2. nålhållare, 3. tandlösa tångar, 4. vårsax, 5. fina spetsiga tångar, 6. spetsiga tångar och 7. kirurgisk sax. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Schematisk illustration av förfarandet. (A och D) Ett litet snitt görs på inguinalregionen för att exponera den proximala femorala A, som är ligerad. (B och E) En 6-0 sutur används för att dra snittet till knäregionen för att exponera distala Femoral A, som är ligerad. (C, Foch G) Stygn av snittet. Förkortningar: Femorala A = lårbensartär; Femorala N = lårbensnerv; Femorala V = femorala ven. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Egenskaper hos PAD-musmodellen. (A) Jämförelse av kroppsvikten före och 7 dagar efter DLFA. (B) Funktionell återhämtning utvärderad av Tarlovskalan. (C) Magnetisk resonans angiografi indikerar proximal och distal FA i vänster bakdel (vit pil), och på höger sida försvinner proximal och distal FA. ( D) Förändringar i utseendet på den bilaterala bakbenet hos möss nr 2 och nr 4, 1 och 7 dagar efter DLFA. Värden som visas är medelvärde ± standardavvikelse. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; oavlönat t-test. Förkortningar: PAD = perifer artärsjukdom; DLFA = dubbel ligatur av lårbensartären; FA = lårbensartär; L = vänster; R = höger. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: HAN färgning av gastrocnemius muskeln . (A) Låg förstoring bild som visar HE färgning av rätt Gm 7 dagar efter DLFA förfarandet. Inflammation observerades i höger Gm. (B) I höger Gm uppvisade nekrotiska myofibrer inflammatorisk infiltration av makrofager (vit pil). Muskelfibrerna förlorar sina normala morfologiska egenskaper. Det fanns mycket få regenererade myofibers (svart pil). (C) HAN färgning av normala myofibrer av höger Gm. (D) Den kontralaterala/vänstra Gm (nonischemic) muskeln visar ett normalt histologiskt mönster. Skalstänger: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Förkortningar: HE = hematoxylin-eosin; DLFA = dubbel ligatur av lårbensartären; Gm = gastrocnemius; L = vänster; R= höger. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Jämförelse av den mikrovaskulära densiteten hos bilaterala gastrocnemiusmuskeln. (A) CD31-IHC färgning av höger Gm avsnitt (svarta pilar). (B)CD31-IHC färgning av vänster Gm-sektion (svarta pilar). C)Kvantifiering av den mikrovaskulära densiteten på höger sida, vilket var mycket mindre än den på vänster sida. Värden som visas är medelvärde ± standardavvikelse. P < 0,00001; oavlönat t-test. Skalstänger: A, B = 20 μm. Förkortningar: CD31 = kluster av differentiering 31; IHC = immunohistochemical; Gm = gastrocnemius. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Tarlov poäng | 0 | Ingen rörelse |
| 1 | Knappt märkbar rörelse, icke-viktbärande | |
| 2 | Frekvent rörelse, icke-viktbärande | |
| 3 | Stöder vikt, delviktslager | |
| 4 | Promenader med milt underskott | |
| 5 | Normal men långsam gång | |
| 6 | Full och snabb promenad |
Tabell 1: Funktionell poängsättning.
Kompletterande tabell S1: Sammanfattning av 25 artiklar från den aktuella litteraturen om upprättandet av PAD-modellen. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna studie rapporterar en modifierad, förenklad och kirurgiskt effektiv metod för att upprätta en HLI-modell i ApoE-/- möss som använder dubbel ligatur i de proximala och distala regionerna i FA genom ett 3-4 mm snitt utan några nödvändiga laboratorieuppgraderingar. Huvudegenskapen för denna metod är snittets mindre storlek jämfört med tidigare rapporterade studier som beskriver mus HLI-modeller8,9,10,11,12,15,20,22,23,24 .
Historiskt har ett snitt gjorts från knäet till media tätt, inguinalt eller till och med buken för bättre exponering, allt från 0,5 till 2 cm eller mer9,11,15,19,22,25,26 (sammanfattat i kompletterande tabell S1). Detta dokument beskriver en kirurgisk teknik för att uppnå DLFA och som ett resultat, HLI, hos möss med ett snitt < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). FA var ligated innan det grenar i popliteal gatan och saphenous gatan, orsakar ischemi i flera muskelgrupper i bakbenet och resulterar i måttlig stress hos möss. Även om möss återhämtade sig funktionellt efter7: e dagen efter operationen (Tarlov poäng dag före operation 6 ± 0, 1st dag efter operationen 3,9 ± 0,99 vs 7:e dagen efter operationen 5,2 ± 0,92), observerades skandinaviska skador hos Gm på histologisk nivå. För det första uppvisade Gm i det skandinaviska benet myofibrer oregelbunden ischemisk nekros och infiltrerades av multikärnor, liknande vad som har rapporterats hos PAD-patienter27,28. Trots myofiberatrofi observerades också några regenererade myofibrer, vilket är i linje med en tidigare rapport29. För det andra var den mikrovaskulära densiteten i den ischemiska gm den7: e dagen efter ligaturen högre än i det icke-ischemiska benet, vilket också har rapporterats av Ministro m.fl.30. Det senaste fokuset i PAD-terapi är inte bara begränsat till att öka mikrovaskulära densiteten jämfört med den icke-ischemiska sidan, men också på restaurering av ischemisk inducerad förlust av livskraftig muskelvävnad, vilket stöder ny kärlbildning genom att tillhandahålla en matris av tillväxtfaktorer och biomekaniskt stöd31. Således ger denna modell också ett brett fönster för att testa effektiviteten av nya terapier med dessa högborgar. Att uppnå HLI med mindre snitt passar dessutom med 3R-konceptet med djurförsök som en förfining av det kirurgiska ingreppet, dvs den lilla hudsnittsstorleken minskar traumat och postoperativa smärtan.
En idealisk djurmodell ger också ett relativt långt terapeutiskt fönster. Olika kirurgiska ingrepp för att upprätta ischemi hos möss har rapporterats och tillämpats, och de utövar olika effekter på blodflödesåterställning21. För induktion av HLI fokuserar kirurgiska metoder normalt på iliacaartären 12,19,23,32, femorala arteriell24,33,34och deras grenar11,35, några inklusive lårbensbenet samt36,37. Eftersom nivån av vaskulär ligatur inte har någon effekt på blodflödesåterställning, är den avgörande faktorn skadans omfattning i kärlträdet21. För en enda ligatur av lårbens- eller iliacaartären görs ett litet snitt i inguinal- eller bukregionen, medan de andra greninteraktionerna fortfarande upprätthålls och perfusionsåterställningen i musens bakben återhämtar sig helt inom 7 dagar21,38. Således är en enda ligatur inte tillräcklig för att tillhandahålla ett lämpligt terapeutiskt fönster för att testa effekterna av olika behandlingar. Om grenar från FA också behöver vara ligerade, måste hudsnittet göras ännu större, vilket förlänger den kirurgiska tiden. Därför erbjuder HLI by DLFA i musen ett lämpligt terapeutiskt fönster där de förbättringar som induceras av terapi kan övervakas effektivt9,21,22,25.
Att fastställa en kliniskt relevant HLI-djurmodell är viktigt för att testa effektiviteten hos nya terapeutiska metoder, dvs. cell-, stamcells- eller genterapi för PAD2,3,4. Flera PAD-modeller har utvecklats hos möss15,21,råttor39och kaniner40,41. Del Giudice och kollegor etablerade en kanin hindlimb ischemi modell skapad av perkutan, transauricular, distala femorala arteriell embolization med kalibrerade partiklar som kan övervinna några av begränsningarna i befintliga djurmodeller40. 41 skapade också en kanin PAD modell genom att rulla den ytliga FA genom en endovaskulär strategi, vilket resulterar i minskad bakben reperfusion. Även om större djur, såsom kaniner, kan ge mer övertygande resultat40,41, tar terapierna ett steg närmare klinisk tillämpning, men de kräver ökad kostnad och tid för att få resultat.
Trots den heterogena riskprofilen hos de flesta patienter med PAD, inklusive ärftliga och beteendemässiga faktorer42, ApoE-/- möss uppvisar onormal fettmetabolism och hyperlipidemi symtom, såsom totalt kolesterol, triglycerider, mycket låg densitet lipoprotein och mellanliggande densitet lipoprotein, replikera några av de viktigaste egenskaperna som observerats hos patienter med PAD. Dessutom, med den fettrika kosten, ökar dessa indikatorer avsevärt. rapporterade att hos dessa möss sker ackumulering av arteriellt fett vid 3 månaders ålder43, och att en ökning av AS-lesioner uppträder medstigande ålder 43. Således är ApoE-/- möss särskilt väl lämpade för den akut-på-kroniska ischemi-PAD modellen eftersom de rekapitulerar hyperkolesterolemi som vanligtvis finns hos patienter med PAD och ger en lämplig plattform för att utvärdera olika terapier som syftar till att främja neovascularization av ischemiska lemmar. Dessutom är förhållandet mellan pris och prestanda för att testa nya terapier med ApoE-/- möss oslagbart.
Trots de fördelar som nämns i ovanstående punkter finns det två begränsningar för denna modell. För det första kräver mastering av denna metod att experimenteraren har tillräcklig mikrokirurgisk erfarenhet och förtrogenhet med musens bakbens anatomi. För det andra ökar den begränsade kirurgiska exponeringen och mängden subkutan fettvävnad i bakbenet av ApoE-/- möss den kirurgiska svårigheten. Därför krävs viss relaterad praxis för framgångsrik implementering av denna teknik. Sammanfattningsvis rapporterar denna studie ett modifierat och lätt att genomföra, kirurgiskt effektivt tillvägagångssätt för att etablera en HLI-modell i ApoE-/- möss med ett litet snitt. Det lilla snittet minskar avsevärt traumat på djuret och kan appliceras av de flesta forskargrupper utan laboratorieuppgraderingar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att artikelinnehållet var sammansatt i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Viktoria Skude, Alexander Schlund och Felix Hörner för den utmärkta tekniska supporten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
