Summary
Este artigo demonstra uma abordagem cirúrgica eficiente para estabelecer isquemia aguda em camundongos com uma pequena incisão. Essa abordagem pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.
Abstract
O objetivo deste estudo é introduzir e avaliar uma abordagem cirúrgica modificada para induzir isquemia aguda em camundongos que podem ser implementados na maioria dos laboratórios animais. Ao contrário da abordagem convencional para a dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), foi feita uma incisão menor na região inguinal direita para expor a artéria femoral proximal (FA) para a realização de DLFA. Em seguida, utilizando uma sutura 7-0, a incisão foi arrastada para a região do joelho para expor a ressonância magnética distal (RM) em membros traseiros bilaterais foi usada para detectar oclusão da FA após a cirurgia. Aos 0, 1, 3, 5 e 7 dias após a cirurgia, a recuperação funcional dos membros posteriores foi avaliada visualmente e avaliada por meio da escala de Tarlov. A avaliação histológica foi realizada após eutanásia dos animais 7 dias após a DLFA. Os procedimentos foram realizados com sucesso na perna direita em dez ApoE-/- camundongos, e nenhum camundongo morreu durante observação subsequente. Os tamanhos de incisão em todos os 10 camundongos foram inferiores a 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Os resultados da ressonância mostraram que o fluxo sanguíneo da FA no lado isquêmico estava claramente bloqueado. Os resultados da escala tarlov demonstraram que a função do membro traseiro diminuiu significativamente após o procedimento e se recuperou lentamente nos 7 dias seguintes. A avaliação histólógica mostrou uma resposta inflamatória significativa no lado isquêmico e reduziu a densidade microvascular no membro traseiro isquêmico. Em conclusão, este estudo introduz uma técnica modificada usando uma incisão em miniatura para realizar isquemia de membros traseiros (HLI) utilizando DLFA.
Introduction
Há necessidade não atendida de modelos animais pré-clínicos para pesquisas em doenças vasculares, como a doença arterial periférica (PAD). Apesar dos desenvolvimentos avançados no diagnóstico e tratamento, houve mais de 200 milhões de pacientes com PAD em2018 1, e seu número está constantemente aumentando. Embora várias novas abordagens terapêuticas2,3,4,5,6,7 tenham sido descritas, a tradução bem sucedida dessas modalidades terapêuticas para a aplicação clínica continua sendo uma tarefa assustadora. Portanto, modelos experimentais in vivo confiáveis e relevantes que simulam a condição da doença humana são necessários para investigar o mecanismo potencial e a eficiência dessas novas abordagens terapêuticas para tratar o PAD6,7.
Hiperlipidemia e aterosclerose (AS) são os principais fatores de risco para o desenvolvimento do PAD. Os camundongos apoE(em uma dieta rica em gordura) apresentam metabolismo de gordura anormal e hiperlipidemia e, posteriormente, desenvolvem placas ateroscleróticas que tornam a ApoE-/- camundongos como a melhor escolha para simular o PAD clinicamente relevante. Os modelos de animais HLI pré-clínicos são gerados por meio da dupla ligadura da artéria femoral (DLFA), que é a abordagem mais utilizada em laboratórios em todo o mundo8,9,10,11,12,13,14,15 para simular isquemia aguda-on-crônica. No entanto, essa abordagem geralmente requer uma incisão relativamente grande e invasiva. Além disso, inevitavelmente leva os animais (especialmente camundongos) a sofrer de aumento da dor e inflamação, o que também influencia os resultados experimentais subsequentes5,6,16,17. Este artigo descreve um modelo HLI agudo-on-crônico em APOE-/- camundongos usando uma incisão muito pequena.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a diretriz da CE EC 2010/63/UE e foram aprovados pela legislação alemã local (35-9185.81/G[1]239/18). Dez ApoEmasculinos -/- camundongos com fundo C57BL/6J, pesando 29,6-38,0 g, foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas e alimentaram uma dieta ocidental (1,25% de colesterol e 21% de gordura) e ad libitum de água por 12 semanas a partir da idade de 8 semanas. O HLI foi realizado em camundongos de 20 semanas de idade, conforme descrito abaixo.
1. Indução de HLI em ApoE-/- camundongos
- Preparar os equipamentos e ferramentas necessários para a cirurgia (ver a Tabela de Materiais e Figura 1). Esterilize os instrumentos cirúrgicos através de autoclaving antes do uso e use um esterilizador de contas de vidro durante a operação.
- Anestesiar o camundongo com injeção subcutânea (S.C.) de uma mistura de midazolam (5 mg/kg), medetomidina (0,05 mg/ml/kg) e fentanil (0,5 mg/kg) antes de todos os procedimentos cirúrgicos.
- Após o início da anestesia, use a pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento e confirme a ausência do reflexo de retirada do pedal no membro dianteiro e traseiro.
- Em seguida, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para manter a temperatura do núcleo do corpo em aproximadamente 37 °C. Usando cotonetes de algodão e creme de depilação, remova cuidadosamente o cabelo da pele do membro traseiro do lado direito.
NOTA: O creme de depilação deve ser usado em quantidade suficiente para cobrir a cetim traseira, especialmente a região inguinal onde a incisão será feita. O creme de depilação deve ser usado por uma duração inferior a 3 minutos e deve ser posteriormente removido com cotonetes umedecidos de algodão de 2 a 3 vezes. - Coloque o mouse na posição supina na almofada de aquecimento sob um microscópio dissecando. Use um antisséptico de pele (ver a Tabela de Materiais) para desinfetar a pele do camundongo. Posteriormente, use fórceps pontiagudas e tesoura cirúrgica para fazer uma incisão de aproximadamente 3-4 mm no meio da região inguinal. Consulte a Figura 2 para um esquema do procedimento.
- Remova cuidadosamente o tecido adiposo subcutâneo com a ajuda de fórceps pontiagudas finos para expor o feixe neurovascular femoral proximal. Use cuidadosamente os fórceps pontiagudos finos para perfurar a membrana da bainha femoral. Use um cotonete umedecido com soro fisiológico para mover a artéria femoral (FA) cuidadosamente longe do nervo femoral (FN) e veia femoral (FV).
- Passe duas suturas absorvíveis 7-0 através da FA proximal, e faça nós duplos usando tesouras de mola para transectar a FA entre os dois laços.
- Para expor a FA distal, passe uma sutura 7-0 absorvível através da borda inferior da incisão e arraste suavemente a incisão para a região do lado direito do joelho do membro traseiro.
- Mova o tecido subcutâneo de lado cuidadosamente para expor o feixe neurovascular. Use fórceps pontiagudos finos para perfurar a membrana da bainha femoral, e dissecar a FA da FV e FN.
- Passe duas suturas absorvíveis 7-0 através da FA distal, e faça nós duplos. Use uma tesoura de mola para transectar a FA entre os dois laços.
NOTA: Não foi realizada ligadura no membro esquerdo, que serviu como controle em cada rato. - Depois, use suturas absorvíveis 6-0 para costurar a incisão. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento em uma gaiola limpa e continue monitorando seus parâmetros vitais até a recuperação. Fornecer analgésicos pós-operatórios: Buprenorfina s.c. (0,1 mg/kg de peso corporal a cada 8 horas durante 48 h). 48 h após a operação, administrar metamizole em água potável (24 mg/5mL de água corresponde a uma dose de 200 mg/kg 4 vezes por dia).
2. Ressonância magnética
NOTA: Um dia após a DLFA, os camundongos devem ser submetidos a ressonâncias magnéticas para avaliar o bloqueio da FA.
- Coloque o mouse em uma câmara de indução transparente e anestesia o mouse com isoflurane de 1,5-2% no ar ambiente até a perda do reflexo de retração.
- Coloque o mouse em uma cama de animal aquecida equipada com um suporte de mordida e posicionada em direção ao ímã com um sistema controlado por laser. Mantenha a temperatura do corpo em 37±1 °C.
- Durante a aquisição de imagens, mantenha a anestesia com 1,5-2% de isoflurane no ar ambiente, e monitore a respiração usando uma sonda de pressão.
- Adquira imagens na orientação de fatia transversal usando uma sequência de angiografia tridimensional (3D) com tempo de eco de parâmetro (TE)/tempo de repetição (TR)/flip angle (FA) = 2 ms/12 ms/13°, quatro médias, uma matriz de aquisição de 178 x 144 reconstruída para 256 x 192 e 121 fatias, resultando em uma resolução isotrópica de 0,15 mm3. Para suprimir o sinal das veias, coloque uma fatia de saturação distally para os membros traseiros.
3. Avaliação clínica e acompanhamento
- Estime a recuperação funcional nos1º,3º,5ºe7º dias após a cirurgia utilizando a pontuação funcional Tarlov escala18,19 (Tabela 1).
4. Avaliação histológica
- Sete dias após a cirurgia, aplique injeção pentobarbital (115 mg/kg) para eutanásia dos camundongos.
- Solução salina tamponada de fosfato perfuse (PBS) contendo 1% de paraformaldeído (PFA) através do ventrículo cardíaco esquerdo (100 mL por rato). Fixar o gastrocnemius bilateral (Gm) dos camundongos em 4% pfa durante a noite a 4 °C.
- Incorporar a amostra em parafina de acordo com o protocolo descrito anteriormente20.
- Corte seções de 4-5 μm de espessura do bloco de tecido embutido em parafina em um microtome. Com a ajuda de uma escova de tinta redonda, coloque as seções de tecido cortado no banho de água mantidas a 42°C.
- Insira o slide do microscópio na água em um ângulo de 45° e posicione-o cuidadosamente sob o grupo de seções a serem coletadas.
- Levante cuidadosamente o escorregador da água e deixe que as seções se conectem ao escorregador e seque durante a noite na incubadora de bancada a 37 °C.
- Realizar a coloração de hematoxilina/eosina (HE) das seções de parafina.
- Coloque os slides contendo as seções em suportes de slides. Prepare 3 recipientes de xileno fresco e coloque os slides em cada recipiente por 5 minutos para desparafinar as seções.
- Reidratar as seções mergulhando as fatias sucessivamente em 96%, 80%, 70%, 50%, 30% etanol e água deionizada por 5 min cada.
- Mancha na solução de hematoxilina por 10 minutos.
- Transfira as fatias para um recipiente de água deionizada e enxágue colocando sob água da torneira por 5 minutos.
- Usando um microscópio, verifique a intensidade da coloração da hematoxilina. Se a coloração permitir a identificação dos núcleos celulares claramente, continue para o próximo passo. Se a intensidade de coloração não facilitar a identificação dos núcleos celulares ou se a intensidade da coloração for fraca, coloque o slide na solução de hematoxilina por 1 min, repita a lavagem com água (passo 4.4.4) e depois verifique novamente.
- Contra-retenção na solução eosin-Y por 5 min.
- Desidratar as seções mergulhando as fatias sucessivamente em recipientes contendo água desionizada e 30%, 50%, 70%, 80% e 96% de etanol sucessivamente por uma duração de 10 s cada. Em seguida, coloque as seções sequencialmente em três recipientes de xileno fresco por 10 s cada.
- Coloque os slides horizontalmente em mapas microscópicos de armazenamento de slides com as seções voltadas para cima. Adicione o meio de montagem suficiente no slide e monte os slides com tampas.
- Realizar a coloração imunohistoquímica (IHC) das seções de parafina.
- Repetição de desparaffinização e reidratação passos 4.4.1-4.4.2. Em seguida, mergulhe as seções em um recipiente com tampão citrato de sódio de 10 mM, pH 6, e leve a amostra para ferver em um micro-ondas.
NOTA: Como o excesso ou o aquecimento excessivo das amostras pode causar manchas inconsistentes, mantenha a temperatura um pouco abaixo do ponto de ebulição por 10 minutos. - Em seguida, esfrie as seções em um banco por 30 minutos. Depois disso, lave as seções na PBS três vezes por 5 minutos. Seque cuidadosamente a área ao redor da amostra, e desenhe um grande círculo em torno da amostra usando uma caneta hidrofóbica. .
NOTA: Nunca toque na amostra. A marcação com uma caneta hidrofóbica cria um limite hidrofóbico, o que facilita o uso de um volume menor de solução de anticorpos. - Sacie a atividade de peroxidase endógena colocando a seção em 0,3% H2O2 na PBS por 10 minutos. Seções de bloco com 400 μL de tampão de bloco (PBS contêm 3% de albumina de soro bovino e 0,3% de detergente não iônico) para 1 h à temperatura ambiente em uma câmara umidificada.
- Lave as seções em PBS por 5 minutos. Em seguida, adicione 100-400 μL de anticorpo anti-CD31 diluído (1:250) o suficiente para cobrir a seção. Na sequência, incubar seções durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada.
NOTA: Certifique-se de que a seção está completamente coberta com a solução de anticorpos. - Remova o anticorpo primário e lave as seções três vezes em PBS por uma duração de 5 minutos cada.
- Prepare a mistura de 3, 3'-diaminobenzidina (DAB) adicionando 1 gota do concentrado DAB a 1 mL do diluente DAB e misture bem. Em seguida, adicione 100-400 μL de mistura DAB às seções e monitore de perto por olho por 2 minutos até que seja observada uma intensidade de coloração aceitável.
NOTA: Certifique-se de que a seção está completamente coberta com a mistura DAB. - Depois, enxágue sob água da torneira por 5 minutos. Realizar a coloração de hematoxilina conforme descrito nas etapas 4.4.3-4.4.5.
- Realizar coloração eosin-Y descrita na etapa 4.4.6. Realizar etapas de desidratação descritas na etapa 4.4.7.
- Montei as seções com tampas usando meio de montagem. Use o ImageJ para estimar o percentual de área positiva cd31 (%) em 5 campos selecionados aleatoriamente (40x) que podem ser considerados como densidade microvascular como descrito anteriormente21.
- Repetição de desparaffinização e reidratação passos 4.4.1-4.4.2. Em seguida, mergulhe as seções em um recipiente com tampão citrato de sódio de 10 mM, pH 6, e leve a amostra para ferver em um micro-ondas.
5. Análise estatística
- Use software de análise estatística para expressar os resultados como ± desvio padrão médio e para realizar teste tnão remunerado nas comparações. Considere P < 0,05 como estatisticamente significante.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Características do ApoE-/- ratos
As cirurgias de DLFA foram realizadas com sucesso em 10 camundongos para estabelecer o modelo HLI, e nenhum dos camundongos morreu após o procedimento. Para acompanhar as mudanças no peso corporal, os camundongos foram pesados antes do procedimento DLFA (Pré-DLFA) e 7 dias após a cirurgia de DLFA (Pós-DLFA). Os pesos pré-DLFA variaram de 29,6 a 38,0 g (média de 34,74 ± 2,47 g), e os pesos pós-DLFA variaram de 26.5 a 34,1 g (média de 30,77 ± 2,15 g), que foram significativamente inferiores aos pesos pré-DLFA(P < 0,05, Figura 3A). O tempo para a cirurgia variou de 15 a 47 min (média de 34,2 ± 8,82 min, sem incluir o tempo da anestesia). O tamanho da incisão em 10 camundongos variou de 3 a 5 mm (média de 4,2 ± 0,63 mm).
Ressonância magnética e recuperação funcional
Os exames de ressonância magnética indicaram claramente que as regiões proximais e distais da FA direita não apresentaram perfusão(Figura 3C),indicando o sucesso deste método. Um dia após a cirurgia, os resultados da Escala tarlov foram significativamente reduzidos (P < 0,05). Embora os resultados tenham aumentado lentamente nos dias seguintes, eles ainda estavam abaixo da linha de base até o dia 7 (P < 0,05, Figura 3B). Essas tendências são consistentes com relatórios anteriores20. Não foram observados necrose ou desenvolvimento de tecido gangreno nos lados bilaterais dos membros posteriores de qualquer camundongo. No entanto, as patas dos membros traseiros isquêmicos em 7 camundongos não foram capazes de esticar naturalmente em comparação com o lado contralateral. Além disso, as patas dos membros traseiros isquêmicos em 4 camundongos apresentaram leve descoloração em comparação com o lado contralateral(Figura 3D).
Análise histológica
Na mancha he do músculo Gm direito, myofibers exibiram necrose isquêmica irregular. As células satélites que proliferam substituíram os miofibers necrosados e foram distribuídas em massa e/ou com dispersão irregular. Myofibers apresentaram infiltração inflamatória por macrófagos multinucleados. Myofibers nas regiões inflamatórias perderam suas características morfológicas normais, e havia poucos miofibers regenerados. Seções transversais desses miofibers regenerados eram redondas, o citoplasma estava manchado de vermelho, e um pequeno núcleo ou núcleos múltiplos estavam localizados no centro. Em contrapartida, esse tipo de padrão inflamatório não foi observado no Gm esquerdo (Figura 4). A coloração de anticorpos CD31 foi realizada para identificar células endoteliais do vaso nas amostras de Gm, e imageJ foi utilizado para avaliar a área CD31-positiva - um substituto para a densidade microvascular - em cada um dos cinco campos de visão (40x) para cada amostra. Os membros traseiros isquêmicos apresentaram significativamente mais densidade microvascular do que o lado não isquêmico(P < 0,05, Figura 5).
Figura 1: Equipamentos e ferramentas necessárias para o experimento. (A) Dissecando microscópio e almofada de aquecimento necessárias para a cirurgia. (B) Ferramentas cirúrgicas: 1. 7-0 e 6-0 suturas absorvíveis, 2. porta-agulhas, 3. fórceps desdentados, 4. tesoura de mola, 5. fórceps pontiagudos finos, 6. fórceps pontiagudos e 7. tesoura cirúrgica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Ilustração esquemática do procedimento. (A e D) Uma pequena incisão é feita na região inguinal para expor o femoral proximal A, que é ligado. (B e E) Uma sutura 6-0 é usada para arrastar a incisão para a região do joelho para expor o femoral distal A, que é ligado. (C, F, e G) Costura da incisão. Abreviaturas: Femoral A = artéria femoral; Femoral N = nervo femoral; Femoral V = veia femoral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Características do modelo de mouse PAD. (A) Comparação do peso corporal antes e 7 dias após dLFA. (B) Recuperação funcional avaliada pela Escala de Tarlov. (C) A angiografia de ressonância magnética indica a FA proximal e distal no membro traseiro esquerdo (seta branca), e no lado direito, a FA proximal e distal desaparece. (D) Alterações no aparecimento do membro traseiro bilateral dos camundongos nº 2 e nº 4, 1 e 7 dias após a DLFA. Os valores mostrados são ± desvio padrão. *P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001, **** P < 0,00001; t-teste nãopago. Abreviaturas: PAD = doença arterial periférica; DLFA = dupla ligadura da artéria femoral; FA = artéria femoral; L = esquerda; R = à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Ele manchando o músculo gastrocnemius. (A) Imagem de baixa ampliação mostrando he mancha do Gm direito 7 dias após o procedimento DLFA. Inflamação foi observada no gm direito (B) No gm direito, os miofibers necrosados apresentaram infiltração inflamatória por macrófagos (seta branca). As fibras musculares perdem suas características morfológicas normais. Havia muito poucos myofibers regenerados (flecha preta). (C) A coloração he de miofibers normais do Gm.(D)direita O músculo GM (não-inimigo) contrariamente esquerdo apresenta um padrão histológico normal. Barras de escala: A = 200 μm, B-D = 50 μm. Abreviaturas: HE = hematoxylin-eosin; DLFA = dupla ligadura da artéria femoral; GM = gastrocnemius; L = esquerda; R= à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Comparação da densidade microvascular do músculo gastrocnemius bilateral. (A) Coloração CD31-IHC da seção Transgênica direita (setas pretas). (B) Coloração CD31-IHC da seção Gm esquerda (setas pretas). (C) Quantificação da densidade microvascular do lado direito, que era muito menor do que a do lado esquerdo. Os valores mostrados são ± desvio padrão. P < 0,00001; t-teste nãopago. Barras de escala: A, B = 20 μm. Abreviaturas: CD31 = cluster de diferenciação 31; IHC = imunohistoquímico; GM = gastrocnemius. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Trilha sonora de Tarlov | 0 | Sem movimento |
| 1 | Movimento quase imperceptível, rolamento sem peso | |
| 2 | Movimento frequente, rolamento sem peso | |
| 3 | Suporta peso, rolamento parcial de peso | |
| 4 | Passeios com déficit leve | |
| 5 | Caminhada normal, mas lenta | |
| 6 | Caminhada completa e rápida |
Tabela 1: Pontuação funcional.
Tabela Suplementar S1: Resumo de 25 artigos da literatura atual sobre o estabelecimento do modelo PAD. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este estudo relata uma abordagem modificada, simplificada e cirurgicamente eficiente para estabelecer um modelo HLI em ApoE-/- camundongos usando ligadura dupla nas regiões proximais e distais da FA através de uma incisão de 3-4 mm sem quaisquer atualizações laboratoriais necessárias. A principal característica deste método é o tamanho menor da incisão em comparação com estudos relatados anteriormente descrevendo os modelos HLI do mouse8,9,10,11,12,15,20,22,23,24 .
Historicamente, uma incisão foi feita do joelho para a mídia apertada, inguinal, ou mesmo o abdômen para melhor exposição, variando de 0,5 a 2 cm ou mais9,11,15,19,22,25,26 (resumido na Tabela Suplementar S1). Este artigo descreve uma técnica cirúrgica para alcançar dLFA e, como resultado, HLI, em camundongos com incisão < 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). A FA foi ligada antes de se ramificar na artéria popliteal e artéria safena, causando isquemia em vários grupos musculares no membro traseiro e resultando em estresse moderado em camundongos. Embora os camundongos tenham se recuperado funcionalmente por7º dia após a operação (Tarlov pontuar um dia antes da operação 6 ± 0,1º dia após a operação 3,9 ± 0,99 vs7º dia após a operação 5,2 ± 0,92), foram observados danos isquêmicos na Gm no nível histológico. Primeiro, os miofibers de perna isquêmica apresentaram necrose isquêmica irregular e foram infiltrados por macrófagos multinucleados, semelhante ao relatado em pacientes pad27,28. Apesar da atrofia da miofibra, alguns miofibers regenerados também foram observados, o que está em linha com um relatório anterior29. Em segundo lugar, a densidade microvascular no GM isquêmico no7º dia após a ligadura foi maior do que na perna não isquêmica, que também foi relatada pelo Ministro et al.30. O foco recente na terapia PAD não se limita apenas ao aumento da densidade microvascular em comparação com o lado não isquêmico, mas também na restauração da perda induzida por isquemia de tecido muscular viável, que suporta a nova formação de vasos, fornecendo uma matriz de fatores de crescimento e suporte biomecânico31. Assim, esse modelo também dá uma ampla janela para testar a eficácia de novas terapias com esses focos. Além disso, alcançar o HLI com incisão menor se encaixa com o conceito 3R de experimentação animal como refinamento do procedimento cirúrgico, ou seja, o pequeno tamanho incisional da pele diminui o trauma e a dor pós-operatória.
Um modelo animal ideal também fornece uma janela terapêutica relativamente longa. Vários procedimentos cirúrgicos para o estabelecimento de isquemia em camundongos foram relatados e aplicados, e exercem diferentes efeitos na restauração do fluxo sanguíneo21. Para a indução de HLI, os métodos cirúrgicos normalmente se concentram na artéria ilíaca12,19,23,32, artéria femoral24,33,34, e seus ramos11,35, alguns incluindo a veia femoral, bem como36,37. Como o nível de ligadura vascular não tem efeito na restauração do fluxo sanguíneo, o fator decisivo é a extensão da lesão na árvore vascular21. Para uma única ligadura da artéria femoral ou ilíaca, uma pequena incisão é feita na região inguinal ou abdominal, enquanto as outras interações ramificadas ainda são mantidas, e a restauração da perfusão no membro traseiro do rato se recupera completamente dentro de 7 dias21,38. Assim, uma única ligadura não é suficiente em termos de fornecer uma janela terapêutica adequada para testar os efeitos de diferentes tratamentos. Se os ramos da FA também precisam ser ligados, a incisão da pele deve ser ainda maior, o que alonga o tempo cirúrgico. Portanto, o HLI by DLFA em camundongos oferece uma janela terapêutica adequada na qual as melhorias induzidas pela terapia podem ser monitoradas eficientemente9,21,22,25.
Estabelecer um modelo animal HLI clinicamente relevante é importante para testar a eficiência de novas abordagens terapêuticas, ou seja, células, células-tronco ou terapia genética para PAD2,3,4. Vários modelos PAD foram desenvolvidos em camundongos15,21, ratos39e coelhos40,41. Del Giudice e colegas estabeleceram um modelo de isquemia de coelhinha criada pela embolização da artéria femoral percutânea, transauricular e distal com partículas calibradas que podem superar algumas das limitações dos modelos animais existentes40. Liddell et al.41 também criaram um modelo PAD de coelho, enrolando a FA superficial através de uma abordagem endovascular, resultando em redução da reperfusão do membro traseiro. Embora animais maiores, como coelhos, possam produzir resultados mais convincentes40,41, levando as terapias um passo mais perto da aplicação clínica, no entanto, eles requerem maior custo e tempo para obter resultados.
Apesar do perfil de risco heterogêneo da maioria dos pacientes com PAD, incluindo fatores hereditários e comportamentais42, ApoE-/- os camundongos apresentam metabolismo de gordura anormal e sintomas de hiperlipidemia, como colesterol total, triglicérides, lipoproteína de densidade muito baixa e lipoproteína de densidade intermediária, replicando algumas das principais características observadas em pacientes com PAD. Além disso, com a dieta rica em gordura, esses indicadores aumentam significativamente. Lo Sasso et al. relataram que nesses camundongos, o acúmulo de gordura arterial ocorre aos 3 meses de idade43, e que um aumento das lesões de AS ocorre com o avanço da idadede 43 anos. Assim, os camundongos ApoE-/- os camundongos são particularmente adequados para o modelo isquemia-PAD aguda-on-crônica porque recapitulam a hipercolesterolemia comumente presente em pacientes com PAD e fornecem uma plataforma adequada para avaliar várias terapias destinadas a promover a neovascularização de membros isquêmicos. Além disso, a relação preço-desempenho de testar novas terapias com ApoE-/- ratos é imbatível.
Apesar das vantagens mencionadas nos parágrafos acima, há duas limitações para este modelo. Em primeiro lugar, dominar este método requer que o experimentador tenha experiência microcirúrgica suficiente e familiaridade com a anatomia do membro traseiro do rato. Em segundo lugar, a exposição cirúrgica limitada e a quantidade de tecido adiposo subcutâneo no membro posterior do ApoE-/- os camundongos aumentam a dificuldade cirúrgica. Portanto, alguma prática relacionada é necessária para a implementação bem sucedida dessa técnica. Em conclusão, este estudo relata uma abordagem modificada e fácil de implementar e cirurgicamente eficiente para estabelecer um modelo HLI em ApoE-/- camundongos usando uma pequena incisão. A pequena incisão reduz significativamente o trauma ao animal e pode ser aplicada pela maioria dos grupos de pesquisa sem quaisquer atualizações laboratoriais.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que o conteúdo do artigo foi composto na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Viktoria Skude, Alexander Schlund e Felix Hörner pelo excelente apoio técnico.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Phosphate buffer saline | Roth | 9143.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| 30% H2O2 | Roth | 9681.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| 6-0 absorbable sutures | PROLENE | 8776H | Used for stitching the skin |
| 6-0 absroable suture | PROLENE | EP8706 | Used in Surgery |
| 7-0 absorbable sutures | PROLENE | EH8021E | Used for ligating the artery |
| 7-0 absroable suture | PROLENE | EP8755 | Used in Surgery |
| Acetic acid | Roth | 6755.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Albumin Fraktion V | Roth | 8076.2 | Used for immunohistochemistry stain |
| Autoclave | Systec GmbH | Systec VX-150 | Used for the sterilisation of the surgical instruments |
| Axio vert A1 microscope | Carl Zeiss | ZEISS Axio Vert.A1 | Used for viewing and taking the pictures from haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Bruker BioSpec 94/20 AVIII | Bruker Biospin MRI GmbH | N/A | Scan the femoral artery blockage |
| Buprenovet Sine 0,3mg/ml | Bayer AG | 2542 (WDT) | Used in post operative pain-management. Dose - 0.1 mg/kg body weight every 8 hours for 48 h after operation |
| CD31 antibody | Abcam | ab28364 | Used for immunohistochemistry stain |
| Eosin Y solution 0.5 % in water | Roth | X883.1 | Used for haematoxylin and eosin stain |
| Epitope Retrieval Solution pH 6 | Leica Biosystems | 6046945 | Used for immunohistochemistry stain |
| Ethanol ≥ 99,5 % | Roth | 5054.1 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Fentanyl | Cayman Chemical | 437-38-7 | Used for anesthesia |
| Fine point forceps | Medixplus | 93-4505S | Used for separating the artery from nerve and vein |
| Glass bead sterilisator | Simon Keller | Type 250 | Used for sterilisation of the surgical instruments |
| Graefe iris forceps curved | VUBU | VUBU-02-72207 | Used for blunt separation of skin and subcutaneous tissue |
| Hair Remover cream, Veet (with aloe vera) | Reckitt Benckiser | 108972 | Remove hair from mice hind limbs |
| Heating plate | STÖRK-TRONIC | 7042092 | Keep the satble temperature of mice |
| Hematoxylin | Roth | T865.2 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
| Leica surgical microscope | Leica | M651 | Enlarge the field of view to facilitate the operation |
| Liquid DAB+Substrate Chromogen System | Dako | K3468 | Used for immunohistochemistry stain |
| Male ApoE-/- mice | Charles River Laboratories | N/A | Used for establish the Peripheral artery disease mice model |
| Medetomidine | Cayman Chemical | 128366-50-7 | Used for anesthesia |
| Micro Needle Holder | Black & Black Surgical | B3B-18-8 | Holding the needle |
| Micro suture tying forceps | Life Saver Surgical Industries | PS-MSF-145 | Used to assist in knotting during surgery |
| Microtome | Biobase | Bk-Mt268m | Used for tissue sectioning |
| Midazolam | Ratiopharm | 44856.01.00 | Used for anesthesia |
| MR-compatible Small Animal Monitoring and Gating System Model 1025 | SA Instruments | N/a | monitoring vital signs of animal during MRI scan |
| Octeniderm farblos | Schülke & Mayr GmbH | 180212 | used for disinfection of the skin |
| Ointment for the eyes and nose | Bayer AG | 1578675 | Keep the eyes wet under the anesthesia |
| Paraformaldehyde | Roth | 0335.1 | Used for fixation of the tissue |
| Pentobarbital | Nembutal | 76-74-4 | Used for anesthesia |
| Saline | DeltaSelect | 1299.99.99 | Used for anesthesia |
| Spring handle scissors with fine, sharp tips | Black & Black Surgical | B66167 | Used for cutting the artery |
| SuperCut Scissors | Black & Black Surgical | B55992 | Used for cutting the skin |
| Triton X-100 | Roth | 9002-93-1 | Used for immunohistochemistry stain |
| Western diet, 1.25% Cholesterol | ssniff Spezialdiäten GmbH | E15723-34 | Diet for the mice |
| Xylene | Roth | 4436.3 | Used for haematoxylin and eosin stain and immunohistochemistry stain |
References
- Shu, J., Santulli, G. Update on peripheral artery disease: Epidemiology and evidence-based facts. Atherosclerosis. 275, 379-381 (2018).
- Tateishi-Yuyama, E., et al. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet. 360 (9331), 427-435 (2002).
- Wang, Z. X., et al. Efficacy of autologous bone marrow mononuclear cell therapy in patients with peripheral arterial disease. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 21 (11), 1183-1196 (2014).
- Botham, C. M., Bennett, W. L., Cooke, J. P. Clinical trials of adult stem cell therapy for peripheral artery disease. Methodist Debakey Cardiovascular Journal. 9 (4), 201-205 (2013).
- van Weel, V., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression in ischemic skeletal muscle enhances myoglobin expression in vivo. Circulation Research. 95 (1), 58-66 (2004).
- Olea, F. D., et al. Vascular endothelial growth factor overexpression does not enhance adipose stromal cell-induced protection on muscle damage in critical limb ischemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (1), 184-188 (2015).
- Peeters Weem, S. M. O., Teraa, M., de Borst, G. J., Verhaar, M. C., Moll, F. L. Bone marrow derived cell therapy in critical limb ischemia: a meta-analysis of randomized placebo controlled trials. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 50 (6), 775-783 (2015).
- Crawford, R. S., et al. Divergent systemic and local inflammatory response to hind limb demand ischemia in wild-type and ApoE-/- mice. Journal of Surgical Research. 183 (2), 952-962 (2013).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P.
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Peck, M. A., et al. A functional murine model of hindlimb demand ischemia. Annals of Vascular Surgery. 24 (4), 532-537 (2010).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Nagase, H., Yao, S., Ikeda, S. Acute and chronic effects of exercise on mRNA expression in the skeletal muscle of two mouse models of peripheral artery disease. PLoS One. 12 (8), 0182456 (2017).
- Fu, J., et al. Hydrogen molecules (H2) improve perfusion recovery via antioxidant effects in experimental peripheral arterial disease. Molecular Medicine Reports. 18 (6), 5009-5015 (2018).
- Yu, J., Dardik, A. A murine model of hind limb ischemia to study angiogenesis and arteriogenesis. Methods in Molecular Biology. 1717, 135-143 (2018).
- Pu, L. Q., et al. Enhanced revascularization of the ischemic limb by angiogenic therapy. Circulation. 88 (1), 208-215 (1993).
- Takeshita, S., et al. Therapeutic angiogenesis. A single intraarterial bolus of vascular endothelial growth factor augments revascularization in a rabbit ischemic hind limb model. Journal of Clinical Investigation. 93 (2), 662-670 (1994).
- Tarlov, I. M. Spinal cord compression studies. III. Time limits for recovery after gradual compression in dogs. AMA Archives of Neurology and Psychiatry. 71 (5), 588-597 (1954).
- Westvik, T. S., et al. Limb ischemia after iliac ligation in aged mice stimulates angiogenesis without arteriogenesis. Journal of Vascular Surgery. 49 (2), 464-473 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Liu, Q., et al. CRISPR/Cas9-mediated hypoxia inducible factor-1α knockout enhances the antitumor effect of transarterial embolization in hepatocellular carcinoma. Oncology Reports. 40 (5), 2547-2557 (2018).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Pellegrin, M., et al. Experimental peripheral arterial disease: new insights into muscle glucose uptake, macrophage, and T-cell polarization during early and late stages. Physiological Reports. 2 (2), 00234 (2014).
- Sun, Z., et al. VEGF-loaded graphene oxide as theranostics for multi-modality imaging-monitored targeting therapeutic angiogenesis of ischemic muscle. Nanoscale. 5 (15), 6857-6866 (2013).
- Craige, S. M., et al. NADPH oxidase 4 promotes endothelial angiogenesis through endothelial nitric oxide synthase activation. Circulation. 124 (6), 731-740 (2011).
- Kant, S., et al. Neural JNK3 regulates blood flow recovery after hindlimb ischemia in mice via an Egr1/Creb1 axis. Nature Communications. 10 (1), 4223 (2019).
- Chevalier, J., et al. Obstruction of small arterioles in patients with critical limb ischemia due to partial endothelial-to-mesenchymal transition. iScience. 23 (6), 101251 (2020).
- Kosmac, K., et al. Correlations of calf muscle macrophage content with muscle properties and walking performance in peripheral artery disease. Journal of the American Heart Association. 9 (10), 015929 (2020).
- Mohiuddin, M., et al. Critical limb ischemia induces remodeling of skeletal muscle motor unit, myonuclear-, and mitochondrial-domains. Scientific Reports. 9 (1), 9551 (2019).
- Ministro, A., et al. Assessing therapeutic angiogenesis in a murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59582 (2019).
- Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nature Medicine. 15 (6), 657-664 (2009).
- Portou, M. J., et al. Hyperglycaemia and ischaemia impair wound healing via Toll-like receptor 4 pathway activation in vitro and in an experimental murine model. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 59 (1), 117-127 (2020).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
- Hazarika, S., et al. MicroRNA-93 controls perfusion recovery after hindlimb ischemia by modulating expression of multiple genes in the cell cycle pathway. Circulation. 127 (17), 1818-1828 (2013).
- Fan, W., et al. mTORC1 and mTORC2 play different roles in the functional survival of transplanted adipose-derived stromal cells in hind limb ischemic mice via regulating inflammation in vivo. Stem Cells. 31 (1), 203-214 (2013).
- Terry, T., et al. CD34(+)/M-cadherin(+) bone marrow progenitor cells promote arteriogenesis in ischemic hindlimbs of ApoE(-)/(-) mice. PLoS One. 6 (6), 20673 (2011).
- Kwee, B. J., et al. Treating ischemia via recruitment of antigen-specific T cells. Science Advances. 5 (7), (2019).
- Nakada, M. T., et al. Clot lysis in a primate model of peripheral arterial occlusive disease with use of systemic or intraarterial reteplase: addition of abciximab results in improved vessel reperfusion. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 15 (2), Pt 1 169-176 (2004).
- Carr, A. N., et al. Efficacy of systemic administration of SDF-1 in a model of vascular insufficiency: support for an endothelium-dependent mechanism. Cardiovascular Research. 69 (4), 925-935 (2006).
- Del Giudice, C., et al. Evaluation of a new model of hind limb ischemia in rabbits. Journal of Vascular Surgery. 68 (3), 849-857 (2018).
- Liddell, R. P., et al. Endovascular model of rabbit hindlimb ischemia: a platform to evaluate therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular and Interventional Radiology: JVIR. 16 (7), 991-998 (2005).
- Aboyans, V., et al. 2017 ESC guidelines on the diagnosis and treatment of peripheral arterial diseases, in collaboration with the European Society for Vascular Surgery (ESVS): Document covering atherosclerotic disease of extracranial carotid and vertebral, mesenteric, renal, upper and lower extremity arteriesEndorsed by: the European Stroke Organization (ESO)The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Peripheral Arterial Diseases of the European Society of Cardiology (ESC) and of the European Society for Vascular Surgery (ESVS). European Heart Journal. 39 (9), 763-816 (2018).
- Lo Sasso, G., et al. The Apoe(-/-) mouse model: a suitable model to study cardiovascular and respiratory diseases in the context of cigarette smoke exposure and harm reduction. Journal of Translational Medicine. 14 (1), 146 (2016).
