Summary
生物元力探针 (BFP) 是一种 原位 动态力光谱 (DFS) 技术。BFP可用于测量活细胞分子相互作用的弹簧常数。此协议对 BFP 检测到的分子键进行弹簧常量分析。
Abstract
生物元原力探针(BFP)最近成为一种原生细胞表面或 原位 动态力光谱(DFS)纳米图,可以测量单分子结合动力学,评估配体受体相互作用的机械特性,可视化蛋白质动态构象变化,更令人振奋地阐明受体介导细胞机械增效机制。最近,BFP被用来测量分子键的弹簧常数。此协议描述了执行分子弹簧恒定 DFS 分析的分步过程。具体来说,讨论了两种 BFP 操作模式,即珠子单元和珠珠模式。此协议侧重于从 DFS 原始数据中提取分子键和细胞的弹簧常数。
Introduction
作为活细胞DFS技术,BFP工程人类红血球(RBC:图1)进入一个超敏感和可调谐的力量传感器与兼容的弹簧恒定范围在0.1-3 pN/nm1,2,3。为了探测配体受体相互作用,BFP 使 DFS 测量在 +1 pN (10-12 N), +3 nm (10-9米) 和 +0.5 ms (10-3 s) 生效, 空间和时间分辨率4,5.其实验配置由两个对立的微管,即探测器和目标组成。探针微管吸气RBC和珠子粘在其顶点通过生物素-链球菌素的相互作用。珠子上涂有感兴趣的配体(图1A)。目标微管吸气细胞或带有利益受体的珠子,分别对应珠细胞(图1B)和珠珠(图1C)模式。
BFP的建造,组装和DFS实验协议被详细描述之前1,6。简言之,BFP 触摸周期由 5 个阶段组成:方法、因平格、接触、缩回和分离(图 1D)。水平 RBC 顶点位置表示为+xRBC。在开始时,未应力(零力)RBC 变形=xRBC为 0(表 1)。然后,目标由压电翻译驱动,以冲压和缩回从探针珠(图1D)。RBC 探头首先由目标压缩,具有负 RBC 变形+xRBC < 0。在债券事件中,缩回阶段从压缩阶段过渡到拉伸阶段,正 RBC 变形=xRBC > 0 (图 2C和D)。根据胡克定律,BFP 承载力可以测量为F = k RBC ×xRBC,其中kRBC (表1)是 BFP 的 RBC 弹簧常数。当键破裂并完成一个触摸周期后,探针珠返回到零力位置与+xRBC = 0 (图1D)。
为了确定kRBC,我们测量并记录探针微管内孔(Rp)、RBC(R0)和 RBC 和探针珠之间的圆形接触区域(Rc)的半径(图1A)。然后kRBC根据埃文的模型(Eq.1)7,8使用实验室VIEW程序,作为一个虚拟仪器(VI)来操作BFP(图S1A)8,9。
(Eq. 1)
通过建立 BFP 和获得 DFS 原始数据,我们介绍如何分析配体受体对或细胞的弹簧常数。DFS关于糖化蛋白Thy-1和K562细胞轴承集成蛋白相互作用的原始数据α 5 β 1(Thy-1-α 5 β 1: 数字3A和3B)10和纤维蛋白和珠涂层的集成物α IIb β 3(FGN-α IIb β 3: 图3C)11,12已分别用于演示珠细胞和珠珠分析模式。
BFP 实验准备
有关 BFP 实验制备和仪器的详细信息,请参阅先前发布的协议3。简言之,人类RBC在碳/碳酸氢盐缓冲中使用了生物素-PEG3500-NHS进行生物素化。感兴趣的蛋白质与磷酸盐缓冲器中使用MAL-PEG3500-NHS的玻硅酸盐玻璃珠共价耦合。为了附着在生物素化RBC上,探针珠还使用MAL-SA涂上链球菌素(SA)。请参阅材料表和表2。
为了组装BFP(图1,左),第三个称为"帮手"的微管将用于交付探针珠,并粘附到RBC的顶点1,3。SA 涂层探针珠和生物镀金 RBC 之间的共价相互作用比配体受体的利益纽带强得多。因此,分离阶段可以解释为配体受体键破裂,而不是探针珠从RBC分离。
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Protocol
1. 获取可分析的 DFS 事件
- 在 BFP 控制和参数设置(图 S1A)的软件(例如 LabVIEW VI)中开始实验。
- 观察 BFP 监视器软件中的重复探针珠目标珠/细胞触摸(图 S1B)。
- 通过调整冲击力和接触时间,在前 50 次接触中测试并实现粘附频率≤ 20%,从而确保 DFS 粘附事件的 ≥ 89% 通过单键12、13、14进行介导。
注:对于每个珠子单元格/珠子对,我们执行 200 个重复的触摸周期。为了获得可发布的数据质量,我们通常执行 n ≥ 3 个珠珠或珠子细胞对。- 通过 BFP 控制和参数设置软件提示,以"强制与时间"的形式将数据保存到每个对末尾的用户定向文件夹。
- 使用 BFP 采集平台(图 S1C)收集债券事件的原力与时间原始数据,如图 2A中所举例。
- 打开 BFP 数据分析软件。单击黄色文件夹图标,通过双击它们来选择相应的原始数据文件。
- 运行程序,然后单击上下按钮在事件之间切换。使用离群值排除标准 (图 S2)筛选出无效事件。选择输出数据类型作为"强制与时间"格式,然后单击 "导出绘图"数据 按钮。
2. 将力与时间曲线转换为力与位移曲线
- 将与缩回阶段对应的数据段导出到电子表格(图2A,方形选框),这与弹簧常数分析相关。
- 使用电子表格软件绘制原力与时间曲线。要获得原力与置换曲线,请将时间值(图 2A、x轴)转换为总位移值(+xtot),将时间值与 Piezo 运动速度(即预设 4,000 nm/s)相乘。
- 从每个获得的位移值中减去最小的位移值,将第一个数据点为零。这种水平转换不会影响缩回阶段的上升坡度,也不会影响随后的弹簧常数计算。
- 值得注意的是,BFP 被认为是一个串行弹簧系统,其中+x托特 (表 1)RBC 的总和变形,+xRBC (表1),分子键,+x摩尔 (表 1),和目标细胞,+x细胞 (表 1),作为 Eq. 2:
(Eq. 2) - 绘制图 2B中显示的原力(F)与位移 (+xtot)曲线。
3. 珠子细胞模式的弹簧神经元分析
- 在力与位移曲线中,可以识别两个不同的斜面,每个斜点可以表示压缩相和拉伸相。将回归线拟合到每个数据组(图 2B),其中较大的线性拟合坡度表示压缩相下的总弹簧常数(图 2B,红色),表示为k1(表 1):较小的线性拟合坡度表示十字形相(图 2B、蓝色)的总弹簧常数,表示为k2(表 1)。
- 对于每步2.2描述的串联弹簧,表示总弹簧常数的对等,ktot(表1),作为RBC、k RBC(表1)、分子键、k摩尔(表1)和目标细胞、k细胞(表1)的弹簧常数反向之和。在珠细胞模式的压缩阶段,分子键不拉伸,因此不考虑kmol。此方案中ktot的对等 (1/k1)表示为
(Eq. 3) 。
在示例数据中,kRBC是预先确定的(默认情况下为 0.25 pN/nm)。k细胞可从 Eq. 3 中提取,并具有获得的k1和kRBC(图3B)。 - 在拉伸阶段,配体受体对之间形成粘附。在此方案中表达 ktot 的对等 (1/k2) 作为
(Eq. 4)
其中 k2 (表 1) 表示拉伸阶段的总弹簧常数。 - 从1/ k 2 中减去1/ k1 (比较 Eq. 3 与 Eq. 4) 。
4. 珠珠模式的春季恒定分析
- 将回归线安装到压缩相数据以获取k1(类似于图 2B,红色)。值得注意的是,在珠珠模式下,目标细胞被涂有兴趣受体的玻璃珠所取代(图1C)。由于珠子变形可以忽略不计,因此可以相应地从 Eq. 3 和 Eq. 4 中删除 1/k细胞术语。压缩相的对等k托特(1/k1)可以表示为:
(Eq. 5) - 将回归线安装到拉伸相数据以获取 k 2(类似于图 2B,蓝色)。拉伸相(1/k2)的对等k托特可表示为:
(Eq. 6) - 从1/ k 2 中减去1/ k1 (比较 Eq. 5 与 Eq. 6) 。
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Representative Results
在这项工作中,我们演示了 BFP 弹簧常数分析的协议。对于珠细胞分析模式,我们分析了涂在探针珠上的糖基化蛋白Thy-1与目标K562细胞(Thy-1-integrin 5 β 1)上表达的特格林α分子键的kmol(Thy-1-integrin α 5 β 1: 图3A)10. k细胞也来自珠细胞模式(K562细胞:图3B)。对于珠珠模式,纤维蛋白原和集成蛋白之间的分子键α IIb β 3(FGN-因特格林α IIb β 3:图3C)11、12用于演示珠珠分析模式。
对于珠细胞模式,我们测量了Thy-1-集成素的弹簧常数α 5 β 1键和K562细胞为kmol = 0.45 ± 0 0.28 pN/nm (图3A) 和k单元格 = 0.18 ± 0.07 pN/nm (图 3B)从 27 预筛选的可分析事件。对于珠珠模式,我们从33个预筛选的分析事件中测量了 FGN-集成αIIbβ 3 键的弹簧常数为kmol = 0.53 ± 0.29 pN/nm (图 3C)。
象征 | 定义 | 象征 | 定义 |
\x托特 | 馅饼的总位移,也可以解释为RBC、靶细胞和分子键的总变形。 | •xRBC | RBC 变形,这也可以解释为探针珠的位移。 |
k托特 | 整个 BFP 串行弹簧系统的总弹簧常数。 | kRbc | 探测器微管的吸气 RBC 的弹簧常数。 |
k摩尔 | BFP 的弹簧常数检测到分子键 | k电池 | 目标单元格的弹簧常数。 |
k1 | k缩回阶段的压缩阶段。 | k2 | k缩回阶段的拉伸阶段。 |
+F1 | 在压缩阶段,探针珠感觉到的力增量。 | +F2 | 探针珠在拉伸阶段感觉到的力增量。 |
\x1 | 压缩阶段的位移增量。 | +x2 | 在紧张阶段的位移增量。 |
表1。BFP分子弹簧常数分析的符号定义。所有物体的水平位置定义为x,而 x [nm]是指相对于原始位置的变形。[F [pN] 是指 BFP 测量的力增量。k [pN/nm] 指弹簧常数。子脚本 1 和 2 分别对应压缩和拉伸相。分子弹簧常数来自原力(F)与。位移(+x托特)曲线。
图1: BFP配置和DFS触摸周期。(A) BFP 系统组装了两个对立的微管,即探测器(左)和目标(右)。探测器微管吸气RBC(红色),玻璃珠粘在其顶点,作为力传感器。目标微管吸气受体携带细胞(蓝色)。RBC 弹簧常数(kRBC)由吸入压力 (+p)和吸气 RBC(R0)、探针微管(Rp)和 RBC 和探针珠之间的圆形接触区域(Rc)的半径决定。(B 和 C)珠细胞 (B) 和珠珠 (C) BFP 模式的显微图。刻度条 = 5 μm. (D) BFP 触摸周期,由方法、因平、接触、缩回和分离阶段组成。+xRBC = 0 破折号线表示 BFP 未受压力或零力位置。缩回阶段包括压缩相(+xRBC < 0,红色),零力位置(+xRBC = 0,黑色)和拉伸相(+xRBC >0,蓝色)的顺序。黑色箭头表示债券事件的位置。请单击此处查看此图的较大版本。
图2:从DFS原始数据中提取分子弹簧常数。 (A) 代表力(F) 与时间(t)DFS 原始数据曲线在一个 BFP 触摸周期中。(B) 代表转换力(F) 与描绘缩回阶段的位移(+xtot)曲线。k1和k2分别表示连续压缩和拉伸相的拟合坡度。[F1 和+F2分别表示压缩相和拉伸相数据中的力增量,其中+x1和+x2分别表示压缩相和拉伸相数据中的排量增量。压缩阶段(R1 2)和拉伸相(R2 2)期间的弹簧常数的R2值在图表上标注,以表示良好的统计适应性。(C 及 D)珠细胞 (C) 和珠珠 (D) 实验模式中缩回阶段的插图。kRBC代表 RBC 的弹簧常数;k细胞和k摩尔分别代表目标细胞的弹簧常数和分子键。在拉伸阶段,配体受体对之间形成粘附,RBC 偏转方向与 Piezo 缩回零力位置(+xRBC > 0)相同。请单击此处查看此图的较大版本。
图3:BFP的直方图测量弹簧常数。在珠子模式下测量的弹簧常数(左 y 轴) 和频率分布 (右 y 轴) α5β1键 (A) 和 K562 目标细胞 (B) 和 FFGN-因特格林αIIbβ3键 (C) 在珠珠模式下。直方图与高斯分布曲线(粉红色)相符,统计参数R2用于表示健身强度。请单击此处查看此图的较大版本。
图 S1:自制 BFP 界面。(A) BFP 控制和参数设置接口。确定RBC弹簧常数的参数是从生物物理参数面板输入的。(B) BFP 监测。将从此相机视图中观察实时 BFP 触摸周期。(C) BFP DFS 分析界面,其中力(F) 与时间(t)曲线被离线审查和预处理,以便进行后续分子弹簧常量分析。请点击这里下载此文件。
图 S2。BFP 可分析数据质量控制和预筛选标准。(A) 高质量的好DFS事件:(一) 珠细胞破裂力事件:(二) 珠细胞终身事件:(三) 珠珠破裂力事件:(四) 珠珠终身活动。(B) 具有某些噪声的可接受 DFS 事件: (i) 数据漂移,但放大缩回阶段仍然有效:(二)债券分离后轻微数据漂移;(三) 零力制度的数据扭结:(四) 保持力小(<10pN)。(C)应丢弃的劣质事件:(一) 无粘附:(二) 数据振荡:(三) 数据一直漂移:(四) 不连续的数据:(五) 压缩力过小(≈0 pN):(六) 多种债券:(七) 与衍生的kmol < 0 的无效数据:(八) 信号错误。灰色间歇性线表示零力。请点击这里下载此文件。
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Discussion
总之,我们提供了详细的数据分析协议,用于在 BFP 珠子和珠子细胞分析模式下对 DFS 原始数据进行预处理并衍生分子弹簧常数。介绍了确定分子和细胞弹簧常数所需的生物力学模型和方程。尽管研究的集成物不同,但珠珠模式和珠细胞模式测量的kmol具有显著的范围差异(图3A与图3C)。值得注意的是,与珠珠模式,受体是共同连接到玻璃珠。相比之下,与珠细胞模式相比,表面受体由底层等离子体膜和细胞骨架调节,最有可能影响测量到的kmol。
数据质量控制对于确保可重复性至关重要。为此,我们已对原力与时间图实施了 DFS 数据预筛选和离群值排除标准。为了证明这一点,我们选择了一个具有代表性的数据集,其中我们将DFS原始数据分为三个质量级别:良好(图S2A),噪声可接受(图S2B)和差(图S2C)。对于使用 BFP 的初学者,我们建议采用严格的标准,以良好的质量(图 S2A)预先筛选数据。 值得注意的是,根据数据预筛选标准,压缩相的回归拟合线应比拉伸相陡峭,特别是 k1 > k2( 图S2C,vii)。当测量 k1 < k2( 图S2C,vii) 时,派生的 kmol < 0 与第 4 步中每次计算的原理不一致。然后,此类事件应被视为无效的离群值并予以丢弃。
为了在数据采集过程中采用单分子水平的BFP测量,根据先前的研究12,已经实施了多个实验配置。首先,通过严格控制溶液浓度、蛋白质数量和反应条件15,珠子上的蛋白质涂层密度通常被压低到最低水平(如60μm-2)。因此,估计珠子上蛋白质之间的平均空间距离比蛋白质的线性尺寸大得多,有利于我们在单分子水平12、13、14上的测量。其次,我们控制每个配体受体对的粘附频率≤20%,根据这种频率结合事件将跟随Poisson分布预测≥89%的事件将是单分子结合14,15。为此,应相应地设置冲击力和接触时间,并且需要在整个实验12中保持一致。然而,仍然有可能连续发生多个债券(图S2C,vi)。在这种情况下,我们将丢弃带有多个债券签名的事件。最后但并非最不重要的,负控制实验将执行与珠涂覆牛血清白蛋白(材料表)或SA单独,以确保非特定粘附频率≤2%16,17。
虽然BFP是强大的研究蛋白质动力学活细胞表面10,11,12,有技术限制。在 BFP 中,一次只能调查一对配体受体对。获得具有统计意义的足够数据将是耗时的。此外,实验程序是劳动密集型的,学习曲线陡峭。实施明智,目前的BFP系统容易受到环境漂移和周围的机械振动。因此,需要持续手动调整以确保 DFS 数据质量。为此,我们最近的一项研究已经推出了超稳定的BFP反馈控制算法,以提高BFP力夹DFS检测4的稳定性。这一技术进步使测量更强分子相互作用,如抗原抗体结合超长粘结寿命(>50s)。不过,我们预计未来将努力将 BFP 数据采集和 DFS 分析自动化并集成到一个计算机化程序中,使整个 BFP 操作和数据分析更加用户友好和高吞吐量。
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Disclosures
作者宣称,他们没有相互竞争的利益来报告本研究。
Acknowledgments
我们感谢纪劳姆·特罗亚德茨的有益讨论,王子豪的硬件咨询,悉尼制造中心,格雷格·苏宁和西蒙·林格支持我们的实验室启动。这项工作得到了澳大利亚研究理事会发现项目(DP200101970 - 洛杉矶J.),新南威尔士州心血管能力建设计划(中早期职业研究员格兰特 - 洛杉矶J.),悉尼研究加速器奖(SOAR - 洛杉矶),拉马乔蒂的支持 基金会健康投资赠款(2020HIG76 - 洛杉矶J.)、国家健康和医学研究理事会创意赠款(APP2003904 - L.A.J.)和悉尼大学工程学院启动基金和主要设备计划(L.A.J.)。李宁·阿诺德·朱是澳大利亚研究理事会DECRA研究员(DE190100609)。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
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