Summary
En biomembrankraftsond (BFP) är en in situ dynamisk kraftspektroskopi (DFS) teknik. BFP kan användas för att mäta fjäderkonstanten av molekylära interaktioner på levande celler. Detta protokoll presenterar våren konstant analys för molekylära bindningar upptäckt av BFP.
Abstract
En biomembrankraftsond (BFP) har nyligen dykt upp som en infödd cell-yta eller in situ dynamisk kraftspektroskopi (DFS) nanotool som kan mäta enmolekylär bindande kinetik, bedöma mekaniska egenskaper hos ligand-receptorinteraktioner, visualisera proteindynamiska konformationsförändringar och mer spännande klargöra receptor medierade cell mekanosenserande mekanismer. På senare tid har BFP använts för att mäta fjäderkonstanten av molekylära bindningar. Detta protokoll beskriver steg-för-steg-proceduren för att utföra molekylär fjäder konstant DFS-analys. Specifikt diskuteras två BFP-driftlägen, nämligen lägena Pärlcell och Pärla-pärla. Detta protokoll fokuserar på härleda fjäderkonstanter av den molekylära bindningen och cellen från DFS-rådata.
Introduction
Som en levande DFS-teknik konstruerar BFP en mänsklig röd blodcell (RBC; Figur 1) till en ultrakänslig och tunable kraftgivare med ett kompatibelt fjäderkonstant intervall vid 0,1-3 pN/nm1,2,3. För att sondera ligand-receptorinteraktion möjliggör BFP DFS-mätningar vid ~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 nm (10-9 m) och ~ 0,5 ms (10-3 s) i kraft, rumslig och temporal upplösning4,5. Dess experimentella konfiguration består av två motsatta mikropipetter, nämligen sonden och målet. Probens mikropipett aspirerar på en RBC och en pärla limmas vid toppen via en biotin-streptavidininteraktion. Pärlan är belagd med ligand av intresse (Figur 1A). Målmikropipette aspirerar antingen en cell eller en pärla som bär den receptor av intresse som motsvarar lägena Pärlcell (figur 1B) respektive Pärla-pärla (figur 1C).
BFP konstruktion, montering och DFS experimentella protokoll beskrevs i detalj tidigare1,6. Kortfattat består en BFP-touchcykel av 5 steg: Approach, Impinge, Contact, Retract and Dissociate (Figur 1D). Det horisontella RBC apex-läget betecknas som ΔxRBC. I början är den ostressade (nollkraftiga) RBC-deformationen ΔxRBC 0 (tabell 1). Målet drivs sedan av en piezotranslator för att invamföra och dra sig tillbaka från sondpärlan (figur 1D). RBC-sonden komprimeras först av målet med negativ RBC-deformation ΔxRBC < 0. I en Bond-händelse övergår upprullningssteget från en tryck- till en dragfas med positiv RBC-deformation ΔxRBC > 0 (figur 2C och D). Enligt Hookes lag kan BFP-bärkraften mätas som F = kRBC × ΔxRBC, där kRBC ( Tabell1) är RBC-fjäderkonstanten i BFP. Vid bindningsbrott och slutförandet av en beröringscykel återgår sondpläden till nollkraftsläge med ΔxRBC = 0 (Figur 1D).
För att bestämma kRBCmäter och registrerar vi radii av sondens mikropipette inre öppning (Rp), RBC (R0) och det cirkulära kontaktområdet (Rc) mellan RBC och sondpläden ( Figur1A). Därefter beräknas kRBC enligt Evans modell (Eq. 1)7,8 medhjälp av ett LabVIEW-program som fungerar som ett virtuellt instrument (VI) för att driva BFP (Figur S1A)8,9.
(Eq. 1)
Med en BFP etablerad och DFS rådata erhålls, presenterar vi härmed hur man analyserar vårkonstanten av ligand-receptorpar eller celler. DFS-rådata om interaktionen mellan det glykosylerade proteinet Thy-1 och K562-cellen med integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Figurerna 3A och 3B)10 och fibrinogenen och pärlans belagda integrin αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3. Figur 3C) 11,12 har använts för att demonstrera analyslägena Pärla-Cell respektive Pärla-pärla.
BFP experimentell förberedelse
För närmare uppgifter om BFP:s experimentella beredning och instrumentering, se de tidigare publiceradeprotokollen 3. I korthet har human RBC biotinylerats med Biotin-PEG3500-NHS i kol-/bikarbonatbufferten. Proteiner av intresse har kovaverats till borosilikatglaspärlor med MAL-PEG3500-NHS i fosfatbufferten. För att fästa på den biotinylerade RBC är sondpläden också belagd med streptavidin (SA) med MAL-SA. Se materialförteckningen och tabell 2.
För att montera BFP (figur 1, vänster), kommer den tredje mikropipeten som kallas "Helper" att användas för att leverera sondpärlan och limma fast den på RBC: s topp1,3. Den kovalsinteraktionen mellan SA-belagda sondpärlor och biotinylerad RBC är mycket starkare än ligand-receptorbindningen av intresse. Således kan dissociatestadiet tolkas som ligand-receptorn bindning bristning snarare än avlossning av Sond pärla från RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Få analysbara DFS-händelser
- Starta experimentet i programvaran (t.ex. LabVIEW VI) för BFP-kontrollen och parameterinställningen (Figur S1A).
- Observera de repetitiva pärl-/celldetaljerna i programvaran för BFP Monitor(figur S1B).
- Testa och uppnå vidhäftningsfrekvensen ≤ 20% inom de första 50 beröringarna genom att justera impingementkraften och kontakttiden, genom vilken det säkerställer att ≥ 89% av DFS vidhäftningshändelse förmedlas av enskildaobligationer 12,13,14.
OBS: För varje pärlcells-/pärlpar utför vi 200 repetitiva beröringscykler. För att få publiceringsbar datakvalitet utför vi vanligtvis n ≥ 3 Bead-Bead- eller Bead-Cell-par.- Spara data i form av Force vs. Time i den användarstyrda mappen i slutet av varje par, som uppmanas av programvaran för BFP-kontroll och parameterinställning.
- Samla in rådata från Force vs. Time för Obligationshändelser, som exemplifieras i figur 2A, med hjälp av BFP-förvärvsplattformen(figur S1C).
- Öppna BFP-dataanalysprogramvaran. Klicka på den gula mappikonen och välj motsvarande rådatafil genom att dubbelklicka på dem.
- Kör programmet och klicka sedan på upp- och nedknappen för att växla mellan händelser. Använd undantagskriterierna(figur S2) föratt avskärma ogiltiga händelser. Välj den exporterande datatypen som Force vs. Time-format och klicka på knappen Exportera diagramdata.
2. Konvertera kraft- kontra tidskurvan till force vs. förskjutningskurvan
- Exportera datasegmentet som motsvarar upprullningssteget till ett kalkylblad (figur 2A, kvadratram), vilket är relevant för vårkonstantanalysen.
- Rita kraften kontra tidskurvan med hjälp av kalkylbladsprogram. Om du vill hämta förskjutningskurvan konverterar du tidsvärdena(figur 2A, x-axeln)till de totala förskjutningsvärdena (Δxtot)genom att multiplicera tidsvärdena med piezorörelsehastighet (dvs. 4 000 nm/s per förinställning).
- Nollställ den första datapunkten genom att subtrahera det minsta förskjutningsvärdet från varje förvärvat förskjutningsvärde. Denna horisontella omvandling påverkar inte de stigande sluttningarna på upprullningssteget eller den efterföljande vårkonstantberäkningen.
- BFP betraktas särskilt som ett seriellt fjädersystem där Δxtot (tabell 1) summerar deformationer av RBC, ΔxRBC (tabell 1),denmolekylära bindningen, Δxmol ( tabell1) och målcellen Δxcell (tabell 1), som Eq. 2:
(Eq. 2) - Rita inkurvan Kraft( F ) kontra Förskjutning (Δxtot) som visas i figur 2B.
(Eq. 2)3. Vår cnstant analys av pärlcellsläge
- I kurvan Kraft kontra Förskjutning kan två distinkta slop identifieras, där var och en kan representera tryckfasen och dragfasen. Montera en regressionslinje på varje datagrupp (figur 2B), där den större linjära lutningen representerar den totala fjäderkonstanten vid komprimeringsfasen (figur 2B, röd), betecknad som k1 (tabell 1). och den mindre linjära lutningen representerar den totala fjäderkonstanten vid tenslilefasen (figur 2B, blå), betecknad som k2 (tabell 1).
- För fjädrar som är anslutna i serie per steg 2.2 beskrivning, uttrycka reciprocal av den totalafjäderkonstanten, ktot (Tabell 1), som summan av fjäderkonstantens inverser av RBC, kRBC ( Tabell 1 ), denmolekylärabindningen, kmol (tabell 1), och målcellen, kcell (tabell 1). Under komprimeringsfasen av beadcellsläget sträcks inte den molekylära bindningen,därför beaktas inte kmol. K tots ömsesidiga idetta scenario (1/k1) uttrycks som
(Eq. 3).
I exempeldata är kRBC förutbestämt (0,25 pN/nm som standard). kcell kan härledas från Eq. 3 med den förvärvade k1 och kRBC ( Figur3B). - Under dragfasen bildas vidhäftning mellan ligandreceptorparet. Uttrycka k tots ömsesidigainbördes ingående i detta scenario (1/k2) som
(Eq. 4)
där k2 (tabell 1) representerar den totala fjäderkonstanten under dragfasen. - Härled kmol från subtrahering 1/k1 från 1/k2 (jämför Eq. 3 vs. Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. Vårkonstant analys av pärl- pärlläge
- Montera en regressionslinje på tryckfasdata för att erhålla k1 (liknar figur 2B, röd). Observera att målcellen i pärl-pärlläge ersätts av en glaspläd belagd med intressereceptorn (figur 1C). Eftersom pärldeformation är försumbar kan celltermen 1/k tas bort från Eq. 3 och Eq. 4 i enlighet därmed. Den ömsesidiga ktoten i tryckfasen (1/k1)kan uttryckas som
(Eq. 5) - Montera en regressionslinje på dragfasdata för att erhålla k2 (liknar figur 2B, blå). Dragfasens ömsesidiga ktot (1/k2)kan uttryckas som
(Eq. 6) - Härled kmol från subtrahering 1/k1 från 1/k2 (jämför Eq. 5 vs. Eq. 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta arbete har vi visat protokollet från BFP:s vårkonstantanalys. För analysläget för pärlceller analyserade vik-moln i denmolekylära bindningen mellan det glykosylerade proteinet Thy-1 belagt på sondpärlan och integrin α5β1 uttryckt på mål K562-cellen (Thy-1-integrin α5β1; Figur 3A) 10.K-cellen härleds också från pärlcellsläget (K562 Cell; Figur 3B). För pärlpärlan bildas den molekylära bindningen mellan fibrinogen och integrin αIIbβ3 (FGN-integrin αIIbβ3; Figur 3C) 11,12 används för att demonstrera analysläget Pärla-pärla.
För beadcell-läget Vi mätte fjäderkonstanterna i Thy-1-integrin α5β1 bindning och K562 cell som kmol = 0,45 ± 0,28 pN/nm (Figur 3A) och kcell = 0,18 ± 0,07 pN/nm (Figur 3B) från 27 förskärmade analysbara händelser. För pärl-pärlläget mätte vi fjäderkonstanterna för FGN-integrin αIIbβ3-bindning som kmol = 0,53 ± 0,29 pN/nm (Figur 3C) från 33 förskärmade analysbara händelser.
| Symbol | Definition | Symbol | Definition |
| Δxtot | Den totala förskjutningen av piezo, som också kan tolkas som den totala deformationen av RBC, målcell och molekylär bindning. | ΔxRBC (rbc) | RBC-deformationen, som också kan tolkas som sondplädens förskjutning. |
| ktot | Den totala fjäderkonstanten i hela BFP-seriens fjädersystem. | kRBC (rbc) | Fjäderkonstanten hos den insugna RBC:n av probemikropipeten. |
| kmol | Fjäderkonstanten i BFP detekterat molekylärt band | kcell | Vårkonstanten i målcellen. |
| k1 (på 1) | ktot av tryckfasen i upprullningssteget. | k2 (på 2) | ktot av dragfasen i upprullningssteget. |
| ΔF1 (Δ F 1) | Den ökning av kraften som avkänns av sondpläden i tryckfasen. | ΔF2 (Δ F 2) | Den ökning av kraften som avkäns av sondpläden i dragfasen. |
| Δx1 | Ökning av förskjutningen i tryckfasen. | Δx2 | Ökning av förskjutningen i dragfasen. |
Tabell 1. Symboldefinitioner för BFP molekylär fjäderkonstantanalys. Horisontella positioner för alla objekt definieras som x, medan Δx [nm] avser deformationen i förhållande till den ursprungliga positionen. ΔF [pN] avser kraftsteget mätt med BFP. k [pN/nm] avser fjäderkonstanten. Nedsänkta 1 och 2 motsvarar de tryck- respektive draghållfasta faserna. Den molekylära fjäderkonstanten härleds från kraften(F)vs. Deplacement (Δxtot)kurva.
Bild 1:BFP-konfiguration och DFS-pekcykel. A) BFP-systemet monterar två motsatta mikropipetter, nämligen sonden(vänster)och målet (höger). Probe micropipette aspirerar en RBC(röd) med en glaspära limmad vid sin spets för att fungera som en kraftgivare. Target-mikropipettet aspirerar på en receptorbärande cell (blå). RBC-fjäderkonstanten (kRBC) bestäms av aspirationstrycket (Δp) och radier av aspirerad RBC(R0),Probe micropipette (Rp) och cirkulär kontaktyta (Rc) mellan RBC och Probepläden. B och C) Mikrografer av lägena Pärlcell (B) och Pärla-Pärla (C) BFP. Skalstänger = 5 μm. (D) En BFP-beröringscykel som består av inflygnings-, impinge-, kontakt-, tillbakadragnings- och dissociatsteg. ΔxRBC = 0 strecklinje anger BFP-positionen eller nollkraftspositionen. Upprullningssteget omfattar tryckfas (ΔxRBC < 0, röd),nollkraftsposition (ΔxRBC = 0, svart)och draghållfast fas (ΔxRBC > 0, blå)i följd. Svart pil anger positionen för Bond-händelsen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Härled molekylfjäderkonstanter från DFS-rådata. (A) Representativ kraft(F) jämfört medtime (t) kurvaför DFS-rådata i en BFP-beröringscykel. B)Representativ konverterad kraft(F)kontra förskjutning (Δxtot)kurva som visar upprullningssteget. k1 och k2 representerar passformslutningen för de på varandra följande tryck- respektive dragfaserna. ΔF1 och ΔF2 representerar kraftstegen i tryckfasen respektive tensilfasdata, där Δx1 respektive Δx2 representerar förskjutningsstegen i tryckfasen respektive dragfasdata. R2-värden för fjäderkonstant under trycksteg (R12) och dragfas (R22) är märkta på diagrammet för att indikera god statistisk kondition. Coch D. Illustrationer av retract-scenen i experimentella lägena Pärla-Cell (C) och Pärla-Pärla (D). kRBC representerar RBC:s fjäderkonstant. kcell och kmol representerar vårkonstanterna i målcellen respektive den molekylära bindningen. Under dragfasen bildas vidhäftning mellan ligandreceptorparet, RBC avböjer i samma riktning som piezo drar sig tillbaka bortom nollkraftsläge (ΔxRBC-> 0). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Representativa histogram av BFP uppmätta fjäderkonstanter. Händelsenumret (vänstery-axel)och frekvensfördelningen(höger y-axel)för uppmätta fjäderkonstanter för Thy-1-integrin α5β1 bindning (A) och K562 Målcell (B) i pärlcellsläge och FGN-integrin αIIbβ3-bindning (C) i pärl-pärlläge. Histogram är lämpliga med gaussisk fördelningskurva(rosa)och den statistiska parametern, R2,används för att indikera konditionens styrka. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur S1: Det hemlagade BFP-gränssnittet. (A) BFP-kontroll- och parameterinställningsgränssnitt. Parametrarna för att bestämma RBC-fjäderkonstanten anges från panelen av biofysiska parametrar. B) Övervakning av BFP. Live BFP-beröringscykler observeras från denna kameravy. C) BFP DFS-analysgränssnitt där kurvorna Force (F) vs. Time (t) är offlinegranskade och för bearbetade för efterföljande molekylär fjäderkonstantanalys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S2. BFP-analysbara datakvalitetskontroll och kriterier för förscreening. A)Bra DFS-händelser med hög kvalitet: i) Sprängkraftshändelse för pärlor och celler; ii) Livstidshändelse för pärlceller. iii) Brytningskraftshändelse för pärla-pärla. iv) Livstidshändelse för pärla och pärla. (B) Godtagbara DFS-händelser med visst brus: (i) Datadrift men inzoomningssteget förblir giltigt; ii) i artikel 3.2 i eg Smärre data som driver efter obligationsdisociation. iii) Dataknöjning vid nollkraftssystemet. iv) Hållkraften är liten (< 10 pN). C) I artikel 3.1 skall Händelser av dålig kvalitet som bör kasseras: i) Ingen vidhäftning; ii) Datasvängning. iii) Data som driver hela tiden. iv) Icke-registrerade uppgifter. v) Tryckkraften är för liten (≈ 0 pN). vi) Flera obligationer. vii) Ogiltiga uppgifter med härledda kmol < 0. viii) Signalfel. Nollkraft indikeras av den grå intermittenta linjen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sammanfattningsvis har vi tillhandahållit ett detaljerat dataanalysprotokoll för förbearbetning av DFS-rådata och härledande molekylära fjäderkonstanter i analyslägena BFP Bead-Bead och Bead-Cell. Biomekaniska modeller och ekvationer som krävs för att bestämma molekylära och cellulära fjäderkonstanter presenteras. Även om olika integrins studeras, hark-moln mätt med pärlpärlor och pärlcellsläget betydande intervallskillnader(figur 3A jämfört med figur 3C). Observera, med pärl-pärlläget är receptorn kovaveriskt kopplad till glaspläd. I motsats till beadcellläget anpassas ytreceptorn av det underliggande plasmamembranet och cytoskeletonerna, vilket sannolikt påverkar den uppmätta k-moln.
Kvalitetskontroll av uppgifter är avgörande för att säkerställa reproducerbarheten. I detta syfte har vi implementerat DFS-data förscreening och avvikande uteslutningskriterier på kraft kontra tidsdiagram. För att visa detta valdes en representativ datauppsättning, där vi kategoriserade DFS-rådata i tre kvalitetsnivåer: Bra (Figur S2A), Acceptabelt med buller (figur S2B) och Dålig oacceptabel (Figur S2C). För nybörjare av att använda BFP rekommenderar vi de strikta kriterierna för att förskärma data med god kvalitet (Figur S2A). Observera att på grundval av datakriterierna före screening bör tryckfasens regressionspassningslinje vara brantare än dragfasens, särskilt k1 > k2 (figur S2C,vii). Vid mäts k1 < k2 (figur S2C,vii) är den härleddak-moln < 0 emot logiken per beräkning i steg 4. Sådana händelser bör sedan betraktas som de ogiltiga avvikande värdena och kasseras.
För att gynna BFP-mätningen på enmolekylär nivå under datainsamlingen har flera experimentella konfigurationer implementerats enligt tidigare studie12. För det första titreras proteinbeläggningstätheten på pärlor vanligtvis ner till en minimal nivå (t.ex. 60 μm-2) genom att strikt kontrollera lösningskoncentrationen, mängden protein och reaktionsförhållandena15. Det genomsnittliga rumsliga avståndet mellan proteiner på pärlan uppskattas därmed mycket större än proteinets linjära dimensioner, vilket gynnar våra mätningar på enmolekylär nivå12,13,14. För det andra kontrollerar vi vidhäftningsfrekvensen för varje ligandreceptorpar ≤ 20%, enligt vilket molekylära bindande händelser kommer att följa Poisson-distribution som förutspår att ≥ 89% av händelserna skulle vara enmolekylärbindning 14,15. För att uppnå detta fastställs impingementkraft och kontakttid i enlighet därmed och måste vara konsekventa under hela experimentet12. Det är dock fortfarande möjligt att flera obligationer förekommer sekventiellt(figur S2C, vi). I sådana fall kommer vi att kassera händelserna med signaturer av flera obligationer. Sist men inte minst kommer negativa kontrollexperiment att utföras med pärlor belagda med bovint serumalbumin(Table of Materials)eller SA ensamt för att säkerställa att den icke-specifika vidhäftningsfrekvensen är ≤ 2%16,17.
Även om BFP är kraftfullt för att undersöka proteindynamiken på levande cellyta10,11,12, finns det tekniska begränsningar. I BFP kan endast ett ligandreceptorpar undersökas åt gången. Det skulle vara tidskrävande att få tillräckliga uppgifter med statistisk signifikans. Dessutom är de experimentella procedurerna arbetsintensiva med branta inlärningskurvor. Implementeringsmässigt är det nuvarande BFP-systemet mottagligt för miljödrift och omgivande mekanisk vibration. Som ett resultat krävs kontinuerlig manuell justering för att säkerställa DFS-datakvaliteten. För detta ändamål har en av våra senaste studier introducerat ultrastabila BFP-återkopplingskontrollalgoritmer för att förbättra stabiliteten hos BFP-kraftklämman DFS-analyserna4. Detta tekniska framsteg möjliggör mätningar av starkare molekylär interaktion såsom antigenantikroppsbindning med ultralång bondlivslängd (>50 s). Vi förutser dock att framtida ansträngningar kommer att göras för att automatisera och integrera BFP-datainsamlingen och DFS-analysen i ett datoriserat program, vilket gör hela BFP-driften och dataanalysen mer användarvänlig och genomströmning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen att rapportera om den aktuella studien.
Acknowledgments
Vi tackar Guillaume Troadec för hjälpsam diskussion, Zihao Wang för hårdvarukonsultation och Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning och Simon Ringer för stöd för vår labbstart. Detta arbete stöddes av Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) och University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund och Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju är en australisk forskare från Australian Research Council DECRA (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
