Summary
Uma sonda de força biomembrana (BFP) é uma técnica in situ dynamic force spectroscopy (DFS). O BFP pode ser usado para medir a constante de mola das interações moleculares em células vivas. Este protocolo apresenta análises constantes de mola para ligações moleculares detectadas pela BFP.
Abstract
Uma sonda de força biomembana (BFP) emergiu recentemente como uma superfície de célula nativa ou no nanotool de espectroscopia de força dinâmica in situ (DFS) que pode medir cinéticas de ligação uni-molecular, avaliar propriedades mecânicas de interações ligantes-receptores, visualizar alterações conformais dinâmicas de proteína e elucidar mecanismos de mecanosensing de células mediadas pelo receptor. Mais recentemente, o BFP tem sido usado para medir a constante de mola de ligações moleculares. Este protocolo descreve o procedimento passo-a-passo para realizar a análise constante de DFS da mola molecular. Especificamente, dois modos de operação BFP são discutidos, ou seja, os modos Bead-Cell e Bead-Bead. Este protocolo se concentra em derivar as constantes de mola da ligação molecular e células a partir de dados brutos do DFS.
Introduction
Como técnica de DFS de células vivas, a BFP projeta um glóbulo vermelho humano (RBC; Figura 1) em um transdutor de força ultrasensível e tunable com uma faixa de constante de mola compatível em 0,1-3 pN/nm1,2,3. Para sondar a interação ligante-receptor, o BFP permite medições de DFS em ~1 pN (10-12 N), ~3 nm (10-9 m) e ~0,5 ms (10-3 s) em vigor, resolução espacial e temporal4,5. Sua configuração experimental consiste em dois micropipettos opostos, ou seja, a Sonda e o alvo. A micropipette sonda aspira um RBC e uma conta é colada em seu ápice através de uma interação biotina-streptavidina. A conta é revestida com o ligante de interesse(Figura 1A). O micropipette target aspira uma célula ou uma esfera com o receptor de interesse, correspondendo aos modos De célula de contas(Figura 1B) e Bead-Bead(Figura 1C),respectivamente 5.
A construção, montagem e os protocolos experimentais DFS foram descritos em detalhes anteriormente1,6. Resumidamente, um ciclo de toque BFP consiste em 5 estágios: Abordagem, Impinge, Contato, Retraímento e Dissociado(Figura 1D). A posição de ápice RBC horizontal é denotada como ΔxRBC. No início, a deformação RBC não-apoiada (com força zero) ΔxRBC é 0 (Tabela 1). O Alvo é então conduzido por um piezotranslator para impingir e retrair da conta da sonda(Figura 1D). A sonda RBC é primeiramente compactada pelo Target com deformação RBC negativa ΔxRBC < 0. Em um evento de Bond, a fase Retract passa de uma fase compressiva para uma fase de tração com deformação RBC positiva ΔxRBC > 0 (Figura 2C e D). De acordo com a lei de Hooke, a força de rolamento BFP é capaz de ser medida como F = kRBC × ΔxRBC, onde kRBC ( Tabela1) é a constante de mola RBC do BFP. Após a ruptura da ligação e a conclusão de um ciclo de toque, a conta da sonda retorna à posição de força zero com ΔxRBC = 0 (Figura 1D).
Para determinar o kRBC,medimos e registramos os raios do orifício interno da sonda(Rp),a RBC (R0) e a área de contato circular(Rc)entre a RBC e a placa da sonda(Figura 1A). Em seguida, a KRBC é calculada de acordo com o modelo do Evan (Eq.1) 7,8 utilizando um programa LabVIEW que atua como um instrumento virtual (VI) para operar o BFP (Figura S1A)8,9.
(Eq. 1)
Com um BFP estabelecido e dados brutos DFS obtidos, apresentamos como analisar a constante de mola do par ou células do receptor de ligantes. Os dados brutos do DFS sobre a interação da proteína glicosilada Thy-1 e K562 rolam integrin α5β1 (Thy-1-α5β1; Figuras 3A e 3B)10 e a do fibrinogênio e da integrin revestida de contas αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 foram usados para demonstrar os modos de análise de Células de Contas e Contas de Contas, respectivamente.
Preparação Experimental BFP
Para obter detalhes sobre a preparação experimental e instrumentação da BFP, consulte os protocolos publicados anteriormente3. Resumindo, a RBC humana foi biotinilada usando o Biotin-PEG3500-NHS no buffer de carbono/bicarbonato. Proteínas de interesse foram covalentemente acoplado às contas de vidro borossilicato usando MAL-PEG3500-NHS no tampão fosfato. Para anexar ao RBC biotinilado, a conta da sonda também é revestida com streptavidina (SA) usando o MAL-SA. Consulte a Tabela de Materiais e Tabela 2.
Para montar o BFP (Figura 1, à esquerda),a terceira micropipette denominada 'Ajudante' será usada para entregar a conta da sonda e colá-la ao ápice da RBC1,3. A interação covalente entre a conta da sonda revestida SA e a RBC biotinilada é muito mais forte do que a ligação ligante-receptor de interesse. Assim, o estágio Dissociado pode ser interpretado como a ruptura da ligação ligante-receptor em vez do desprendimento da conta da sonda da RBC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Obter eventos de DFS analisáveis
- Inicie o experimento no software (por exemplo, LabVIEW VI) para a configuração de controle e parâmetro BFP(Figura S1A).
- Observe os toques de esferas/células de esferas de esferas de teste repetitivo no software para Monitor BFP(Figura S1B).
- Teste e alcance a frequência de adesão ≤ 20% dentro dos primeiros 50 toques, ajustando a força de impacto e o tempo de contato, pelo qual garante que ≥ 89% do evento de adesão do DFS sejam mediados por ligações únicas12,13,14.
NOTA: Para cada par de células de contas/contas, realizamos 200 ciclos de toque repetitivos. Para obter qualidade de dados publicáveis, geralmente executamos n ≥ 3 pares De Contas ou Contas-Célula.- Salve os dados, na forma de Força vs. Tempo, à pasta dirigida pelo usuário até o final de cada par, solicitado pelo software para o controle bfp e configuração do parâmetro.
- Colete os dados brutos force vs. Time dos eventos bond, conforme exemplificado na Figura 2A,utilizando a plataforma de aquisição BFP(Figura S1C).
- Abra o software de análise de dados BFP. Clique no ícone da pasta amarela e selecione o arquivo de dados brutos correspondente clicando neles.
- Execute o programa e clique no botão para cima e para baixo para alternar entre os eventos. Use os critérios de exclusão outlier(Figura S2) para selecionar eventos inválidos. Selecione o tipo de dados de exportação como formato Força vs. Tempo e clique no botão Exportar dados de gráficos.
2. Converta a curva força vs. tempo para a curva força vs. deslocamento
- Exporte o segmento de dados correspondente ao estágio Retractção para uma planilha (Figura 2A, letreiro quadrado), que é relevante para a análise constante da mola.
- Plote a Curva Força vs. Tempo usando o software de planilha. Para obter a curva Força vs. Deslocamento, converta os valores de tempo(Figura 2A, x-eixo) para os valores de deslocamento totais (Δxtot) multiplicando os valores do tempo com a velocidade de movimento piezo (ou seja, 4.000 nm/s por predefinição).
- Zero o primeiro ponto de dados subtraindo o menor valor de deslocamento de cada valor de deslocamento adquirido. Essa transformação horizontal não afeta as encostas ascendentes do estágio Retractção nem o cálculo constante de mola subsequente.
- Notavelmente, o BFP é considerado como um sistema de mola serial no qual Δxtot (Tabela 1) somam deformações do RBC, ΔxRBC (Tabela 1),a ligação molecular, Δxmol (Tabela 1),e a célula Alvo, Δxcélula (Tabela 1),como o Eq. 2:
(Eq. 2) - Plote a Força (F) vs. Deslocamento (Δxtot) curva como mostrado na Figura 2B.
(Eq. 2)3. Análise cnstante de mola do modo de célula de contas
- Na curva Força vs. Deslocamento, pode-se identificar dois slop distintos, onde cada um pode representar a fase compressiva e a fase de tração. Encaixe uma linha de regressão em cada grupo de dados(Figura 2B),onde a inclinação de ajuste linear maior representa a constante total da mola na fase compressiva(Figura 2B, vermelha),denotada como k1 (Tabela 1); e a inclinação de ajuste linear menor representa a constante total da mola na fase detração (Figura 2B, azul),denotada como k2 (Tabela 1).
- Para molas conectadas em séries por descrição passo 2.2, expresse a recíproca da constante total da mola, ktot (Tabela 1),como a soma dos inversos constantes da mola de RBC, kRBC (Tabela 1),a ligação molecular, kmol (Tabela 1),e a célula Alvo,célula K(Tabela 1). Durante a fase compressiva do modo Célula de Contas, a ligação molecular não é esticada, portanto kmol não é levado em consideração. A recíproca do ktot neste cenário (1/k1) é expressa como
(Eq. 3).
Nos dados de exemplo, kRBC é pré-determinado (0,25 pN/nm por padrão). kcélula pode ser derivada do Eq. 3 com os adquiridos k1 e kRBC ( Figura3B). - Durante a fase de tração, a adesão é formada entre o par ligante-receptor. Expresse a recíproca do ktot neste cenário (1/k2) como
(Eq. 4)
onde k2 (Tabela 1) representa a constante total da mola durante a fase de tração. - Deriva kmol de subtração 1/k1 de 1/k2 (compare Eq. 3 vs. Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. Análise constante da mola do modo contas-contas
- Encaixe uma linha de regressão nos dados da fase compressiva para obter k1 (semelhante à Figura 2B, vermelho). Note-se que, no modo Bead-Bead, a célula Target é substituída por uma conta de vidro revestida com o receptor de interesse(Figura 1C). Uma vez que a deformação das contas é insignificante, o termode célula de 1/kpode ser removido do Eq. 3 e Eq. 4 em conformidade. O ktot recíproco da fase compressiva (1/k1) pode ser expresso como:
(Eq. 5) - Encaixe uma linha de regressão nos dados da fase de tração para obter k2 (semelhante à Figura 2B, azul). O ktot recíproco da fase de tração (1/k2) pode ser expresso como:
(Eq. 6) - Deriva kmol de subtrair 1/k1 de 1/k2 (compare Eq. 5 vs. Eq. 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Neste trabalho, demonstramos o protocolo da análise constante da mola BFP. Para o modo de análise de células de contas, analisamos o kmol da ligação molecular entre a proteína glicosilácida Thy-1 revestida na conta da sonda e a integrin α5β1 expressas na célula Target K562 (Thy-1-integrin α5β1; Figura 3A) 10. Acélula ktambém é derivada do modo Célula de Contas (Célula K562; Figura 3B). Para o modo Bead-Bead, a ligação molecular formou-se entre fibrinogênio e integrin αIIbβ3 (FGN-integrin αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 é usado para demonstrar o modo de análise Bead-Bead.
Para o modo Bead-Cell, medimos as constantes de mola de Thy-1-integrin α5β1 ligação e célula K562 como kmol = 0,45 ± 1 0,28 pN/nm (Figura 3A) ecélula k= 0,18 ± 0,07 pN/nm(Figura 3B) de 27 eventos analisáveis pré-selecionados. Para o modo Bead-Bead, medimos as constantes de mola de FGN-integrin αIIbβ3 bond como kmol = 0,53 ± 0,29 pN/nm(Figura 3C) de 33 eventos analisáveis pré-selecionados.
| Símbolo | Definição | Símbolo | Definição |
| Δxtot | O deslocamento total do piezo, que também pode ser interpretado como a deformação total da RBC, célula-alvo e ligação molecular. | ΔxRBC | A deformação RBC, que também pode ser interpretada como o deslocamento da conta da sonda. |
| ktot | A constante total de mola de todo o sistema de mola serial BFP. | kRBC | A constante de mola do RBC aspirado pela micropipette sonda. |
| kmol | A constante de mola do BFP detectou ligação molecular | célula k | A constante de mola da célula Alvo. |
| k1 | ktot da fase compressiva na fase Retract. | k2 | ktot da fase de tração na fase Retract. |
| ΔF1 | O incremento da força sentido pela conta da sonda na fase compressiva. | ΔF2 | O incremento da força sentido pela conta da sonda na fase de tração. |
| Δx1 | O incremento do deslocamento na fase compressiva. | Δx2 | O incremento do deslocamento na fase de tração. |
Mesa 1. Definições de símbolo para a análise constante da mola molecular BFP. As posições horizontais de todos os objetos são definidas como x, enquanto Δx [nm] refere-se à deformação em relação à posição original. ΔF [pN] refere-se ao incremento de força medido por BFP. k [pN/nm] refere-se à constante da mola. Os subscritos 1 e 2 correspondem às fases compressivas e de tração, respectivamente. A constante da mola molecular é derivada da Força (F) vs. Curva de deslocamento (Δxtot).
Figura 1: Configuração BFP e ciclo de toque DFS. (A) O sistema BFP monta dois micropipettos opostos, a sonda(esquerda)e o Target(direita). A micropipette sonda aspira um RBC (vermelho)com uma contas de vidro colada em seu ápice para servir como um transdutor de força. A micropipette Target aspira uma célula receptora(azul). A constante de mola RBC (kRBC) é determinada pela pressão de aspiração (Δp) e pelos raios de RBC aspirado(R0),micropipette probe(Rp) e área de contato circular(Rc) entre a RBC e a torre da sonda. (B e C) Micrografos dos modos B (B) e Bead-Bead (C). Barras de escala = 5 μm. (D) Um ciclo de toque BFP que consiste nas etapas Approach, Impinge, Contact, Retract e Dissociate. A linha de traço ΔxRBC = 0 indica a posição BFP sem controle, ou com força zero. A fase Retract inclui fase compressiva (ΔxRBC < 0, vermelho),posição de força zero (ΔxRBC = 0, preto) e fase de tração (ΔxRBC > 0, azul) em sequência. A seta preta indica a posição do evento bond. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Derivam constantes de mola molecular a partir de dados brutos DFS. (A) Força Representativa (F) vs. Tempo(t) curva de dados brutos DFS em um ciclo de toque BFP. (B) Curva de Força convertida representativa (F) vs. Deslocamento (Δxtot) que retrata o estágio Retract. k1 e k2 representam a inclinação fit das fases compressivas e de tração consecutivas, respectivamente. ΔF1 e ΔF2 representam os incrementos de força na fase compressiva e os dados da fase de tração, respectivamente, onde Δx1 e Δx2 representam os incrementos de deslocamento nos dados de fase compressiva e fase de tração, respectivamente. Osvalores R2 para a constante de mola durante o estágio compressivo(R12) e a fase de tração (R22) são rotulados no gráfico para indicar boa aptidão estatística. (C e D) Ilustrações do estágio Retraída nos modos experimentais Célula de Contas (C) e Bead-Bead (D). kRBC representa a constante de primavera da RBC; kcélula e kmol representam as constantes de mola da célula Alvo e da ligação molecular, respectivamente. Durante a fase de tração, a adesão é formada entre o par de ligantes-receptores, o RBC desvia na mesma direção que piezo se retrai além da posição de força zero (ΔxRBC > 0). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Histogramas representativos de BFP mediram as constantes de mola. O número de evento(esquerda y-axis) e a distribuição de frequência(eixo direito y)das constantes de mola medidas para Thy-1-integrin α5β1 bond (A) e célula alvo K562 (B) no modo Bead-Cell e FGN-integrin αIIbβ3 bond (C) no modo Bead-Bead. Os histogramas são adequados com a curva de distribuição gaussiana(rosa)e o parâmetro estatístico, R2,é usado para indicar a força do condicionamento físico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura S1: A interface BFP caseira. (A) Interface de configuração de controle bfp e parâmetro. Os parâmetros para determinar a constante de mola RBC são inseridos a partir do painel de parâmetros biofísicos. (B) Monitoramento BFP. Serão observados ciclos de toque BFP ao vivo a partir desta visualização da câmera. (C) Interface de análise BFP DFS onde as curvas Force (F) vs. Time(t)são revisadas offline e pré-processadas para análise constante subsequente da mola molecular. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura S2. Critérios de controle de qualidade de dados analisáveis da BFP e critérios de pré-triagem. (A) Bons eventos dfs com alta qualidade: (i) Evento de força de ruptura de células de contas; (ii) Evento vitalício de células de contas; (iii) Evento de força de ruptura de contas de contas; (iv) Evento vitalício de Bead-Bead. (B) Eventos DFS aceitáveis com algum ruído: (i) Deriva de dados, mas o estágio de retirada de zoom permanece válido; (ii) Leves dados à deriva após dissociação de títulos; (iii) Dobra de dados no regime de força zero; (iv) A força de retenção é pequena (< 10 pN). (C) Eventos de má qualidade que devem ser descartados: (i) Sem adesão; (ii) Oscilação de dados; (iii) Dados à deriva o tempo todo; (iv) Dados descontínuos; v Força compressiva muito pequena (≈ 0 pN); (vi) Ligações múltiplas; (vii) Dados inválidos com < 0 de kmol derivados; (viii) Erro de sinal. A força zero é indicada pela linha cinza intermitente. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Em resumo, fornecemos um protocolo detalhado de análise de dados para pré-processamento dos dados brutos do DFS e que deriva constantes de mola molecular nos modos de análise BFP Bead-Bead e Bead-Cell. São apresentados modelos biomecânicos e equações necessárias para determinar as constantes moleculares e celulares da mola. Embora sejam estudadas integrins diferentes, o kmol medido pelo modo Bead-Bead e pelo modo Bead-Cell possui diferenças significativas de alcance(Figura 3A vs. Figura 3C). Note-se que, com o modo Bead-Bead, o receptor está covalentemente ligado à conta de vidro. Em contraste, com o modo Bead-Cell, o receptor de superfície é adaptado pela membrana plasmática subjacente e citoesqueletos, que provavelmente influenciam a medida kmol.
O controle de qualidade dos dados é crucial para garantir a reprodutibilidade. Para isso, implementamos os critérios de pré-triagem e exclusão de dados do DFS nos gráficos Força vs. Time. Para demonstrar isso, foi selecionado um conjunto de dados representativo, no qual categorizamos os dados brutos do DFS em três níveis de qualidade: Bom (Figura S2A), Aceitável com ruído(Figura S2B) e Pobre inaceitável(Figura S2C). Para iniciantes do uso do BFP, recomendamos os critérios rigorosos para pré-triagem dos dados com a boa qualidade (Figura S2A). Note-se que, com base nos critérios de pré-triagem dos dados, a linha de ajuste de regressão da fase compressiva deve ser mais íngreme que a da fase de tração, especificamente k1 > k2 (Figura S2C, vii). Quando medido k1 < k2 ( FiguraS2C, vii), o derivado kmol < 0 é contra a lógica por cálculo na etapa 4. Tais eventos devem então ser considerados como outliers inválidos e descartados.
Para favorecer a medição do BFP em nível mono molecular durante a aquisição de dados, várias configurações experimentais foram implementadas de acordo com o estudo anterior12. Em primeiro lugar, a densidade de revestimento de proteínas em contas é geralmente titulada até um nível mínimo (por exemplo, 60 μm-2) pelo controle estritamente da concentração da solução, quantidade da proteína e condições de reação15. A distância espacial média entre proteínas na conta é, portanto, estimada muito maior do que as dimensões lineares da proteína, favorecendo nossas medições no nível mono molecular12,13,14. Em segundo lugar, controlamos a frequência de adesão para cada par de receptores de ligante ≤ 20%, sob os quais os eventos de ligação molecular seguirão a distribuição de Poisson prevendo ≥ 89% dos eventos seriam de ligação uni molecular14,15. Para isso, a força de impacto e o tempo de contato são definidos de acordo e precisam ser consistentes ao longo do experimento12. No entanto, ainda é possível que múltiplas ligações ocorram sequencialmente(Figura S2C, vi). Nesses casos, descartaremos os eventos com assinaturas de múltiplos vínculos. Por último, mas não menos importante, serão realizados experimentos de controle negativos com contas revestidas com albumina de soro bovino(Tabela de Materiais) ou SA apenas para garantir que a frequência de adesão não específica seja ≤ 2%16,17.
Embora o BFP seja poderoso para investigar a dinâmica proteica na superfície das células vivas10,11,12, há limitações técnicas. No BFP, apenas um par de receptores de ligante pode ser investigado por vez. Seria demorado obter dados suficientes com significância estatística. Além disso, os procedimentos experimentais são intensivos em mão-de-obra com curvas de aprendizagem íngremes. Implementação sábia, o sistema BFP atual é suscetível à deriva ambiental e vibração mecânica circundante. Como resultado, é necessário um ajuste manual contínuo para garantir a qualidade dos dados do DFS. Para isso, um de nossos estudos recentes introduziu algoritmos de controle de feedback BFP ultra-estáveis para melhorar a estabilidade dos ensaios DFS de grampo de força BFP4. Este avanço técnico permite medições de uma interação molecular mais forte, como a ligação antígeno-anticorpo com a vida útil de ligação ultra-longa (>50 s). No entanto, prevemos que esforços futuros serão feitos para automatizar e integrar a aquisição de dados BFP e a análise do DFS em um programa informatizado, tornando toda a operação e análise de dados do BFP mais fáceis de usar e de alto rendimento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses concorrentes a relatar em relação ao presente estudo.
Acknowledgments
Agradecemos a Guillaume Troadec pela discussão útil, Zihao Wang pela consulta de hardware, e o Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning e Simon Ringer pelo apoio à nossa startup de laboratório. Este trabalho foi apoiado pelo Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.), e The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju é um membro do Conselho de Pesquisa Australiano (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
