Summary
Une sonde de force biombrane (BFP) est une technique de spectroscopie de force dynamique (DFS) in situ. BFP peut être utilisé pour mesurer la constante de ressort des interactions moléculaires sur les cellules vivantes. Ce protocole présente une analyse de la constante de ressort pour les liaisons moléculaires détectées par BFP.
Abstract
Une sonde de force biomébrarane (BFP) a récemment émergé en tant que nanooutil de spectroscopie de force dynamique (DFS) à surface cellulaire native ou in situ qui peut mesurer la cinétique de liaison moléculaire unique, évaluer les propriétés mécaniques des interactions ligand-récepteur, visualiser les changements conformationnels dynamiques des protéines et élucider de manière plus excitante les mécanismes de mécanosension cellulaire médiés par les récepteurs. Plus récemment, le BFP a été utilisé pour mesurer la constante de ressort des liaisons moléculaires. Ce protocole décrit la procédure étape par étape pour effectuer une analyse DFS de la constante de ressort moléculaire. Plus précisément, deux modes de fonctionnement BFP sont discutés, à savoir les modes Bead-Cell et Bead-Bead. Ce protocole se concentre sur la dérivation des constantes de ressort de la liaison moléculaire et de la cellule à partir de données brutes DFS.
Introduction
En tant que technique DFS à cellules vivantes, BFP conçoit un globule rouge humain (RBC; Figure 1) dans un transducteur de force ultrasensible et accordable avec une plage constante de ressort compatible à 0,1-3 pN/nm1,2,3. Pour sonder l’interaction ligand-récepteur, BFP permet des mesures DFS à ~1 pN(10 -12 N), ~3 nm(10 -9 m) et ~0,5 ms (10-3 s) en force, résolution spatiale et temporelle4,5. Sa configuration expérimentale se compose de deux micropipettes opposées, à savoir la sonde et la cible. La micropipette Probe aspire un globules biologiques et une perle est collée à son sommet via une interaction biotine-streptavidine. La perle est recouverte du ligand d’intérêt (Figure 1A). La micropipette cible aspire soit une cellule, soit une perle portant le récepteur d’intérêt, correspondant aux modes Bead-Cell(Figure 1B)et Bead-Bead(Figure 1C),respectivement5.
La construction BFP, l’assemblage et les protocoles expérimentaux DFS ont été décrits en détail précédemment1,6. En bref, un cycle tactile BFP se compose de 5 étapes : Approcher, Impinge, Contact, Retract et Dissocier(Figure 1D). La position horizontale de l’apex RBC est notée ΔxRBC. Au début, la déformation RBC non étayée (force nulle) ΔxRBC est 0(tableau 1). La cible est ensuite entraînée par un piézotranslateur pour empiéter et se rétracter sur le cordon de la sonde(Figure 1D). La sonde RBC est d’abord comprimée par la cible avec une déformation RBC négative ΔxRBC < 0. Dans un cas de liaison, l’étage de rétraction passe d’une phase de compression à une phase de traction avec une déformation RBC positive ΔxRBC > 0(Figure 2C et D). Selon la loi de Hooke, la force de roulement BFP peut être mesurée comme F = kRBC × ΔxRBC, où kRBC ( Tableau1) est la constante de ressort RBC du BFP. À la rupture de la liaison et à la fin d’un cycle tactile, le bille de sonde revient à la position de force nulle avec ΔxRBC = 0(Figure 1D).
Pour déterminer le kRBC,nous mesurons et enregistrons les rayons de l’orifice interne de la micropipette de sonde (Rp), du RBC (R0) et de la zone de contact circulaire (Rc) entre le RBC et le bille de sonde ( Figure1A). Ensuite, kRBC est calculé selon le modèle d’Evan (Eq. 1)7,8 à l’aide d’un programme LabVIEW qui agit comme un instrument virtuel (VI) pour faire fonctionner le BFP(Figure S1A)8,9.
(Eq. 1)
Avec un BFP établi et des données brutes DFS obtenues, nous présentons ici comment analyser la constante de ressort de la paire ligand-récepteur ou des cellules. Les données brutes DFS sur l’interaction de la protéine glycosylée Thy-1 et de la cellule K562 portant l’intégrine α5β1 (Thy-1-α5β1; Figures 3A et 3B)10 et celle de l’intégrine enduite de fibrinogène et de billes αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figure 3C) 11,12 ont été utilisés pour démontrer les modes d’analyse Bead-Cell et Bead-Bead, respectivement.
Préparation expérimentale BFP
Pour plus de détails sur la préparation expérimentale et l’instrumentation du BFP, veuillez vous référer aux protocoles précédemment publiés3. En bref, les globules biologiques humains ont été biotinylés à l’aide du Biotin-PEG3500-NHS dans le tampon carbone/bicarbonate. Les protéines d’intérêt ont été couplées de manière covalente aux billes de verre borosilicate en utilisant MAL-PEG3500-NHS dans le tampon de phosphate. Pour se fixer au globule rouge biotinylé, la bille de sonde est également recouverte de streptavidine (SA) à l’aide du MAL-SA. Veuillez consulter le tableau des matériaux et le tableau 2.
Pour assembler le BFP(Figure 1, à gauche),la troisième micropipette appelée « Helper » sera utilisée pour délivrer la bille de sonde et la coller à l’apex du RBC1,3. L’interaction covalente entre la bille de sonde revêtue de SA et les globules rouges biotinylés est beaucoup plus forte que la liaison ligand-récepteur d’intérêt. Ainsi, l’étape dissociée peut être interprétée comme la rupture de la liaison ligand-récepteur plutôt que le détachement de la perle de sonde du globule rouge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Obtenir des événements DFS analysables
- Démarrez l’expérience dans le logiciel (par exemple, LabVIEW VI) pour le contrôle BFP et le réglage des paramètres (Figure S1A).
- Observez les touches répétitives perles cibles de perles/cellules de la sonde dans le logiciel pour BFP Monitor (Figure S1B).
- Testez et atteignez la fréquence d’adhérence ≤ 20% dans les 50 premières touches en réglant la force d’impingement et le temps de contact, ce qui garantit que ≥ 89% de l’événement d’adhérence DFS sont médiées par des liaisons simples12,13,14.
REMARQUE: Pour chaque paire Bead-Cell/Bead, nous effectuons 200 cycles tactiles répétitifs. Pour obtenir une qualité de données publiable, nous effectuons généralement n ≥ 3 paires Perle-Perle ou Perle-Cellule.- Enregistrez les données, sous la forme de Force vs. Time, dans le dossier dirigé par l’utilisateur à la fin de chaque paire, invité par le logiciel pour le contrôle BFP et le réglage des paramètres.
- Collectez les données brutes Force vs Temps des événements Bond, comme illustré dans la Figure 2A, à l’aide de la plate-forme d’acquisition BFP (Figure S1C).
- Ouvrez le logiciel d’analyse de données BFP. Cliquez sur l’icône du dossier jaune et sélectionnez le fichier de données brutes correspondant en double-cliquant dessus.
- Exécutez le programme, puis cliquez sur les boutons haut et bas pour basculer entre les événements. Utilisez les critères d’exclusion des valeurs aberrantes (Figure S2) pour éliminer les événements non valides. Sélectionnez le type de données d’exportation au format Force vs. Heure et cliquez sur le bouton Exporter les données des tracés.
2. Convertissez la courbe Force vs Temps en Courbe Force vs Déplacement
- Exportez le segment de données correspondant à l’étape De retrait vers une feuille de calcul(Figure 2A, cadre de sélection carré),ce qui est pertinent pour l’analyse de la constante de ressort.
- Tracez la courbe Force vs Temps à l’aide d’un tableur. Pour obtenir la courbe Force vs Déplacement, convertissez les valeurs de temps(Figure 2A,axe des x)en valeurs de déplacement total (Δxtot)en multipliant les valeurs de temps par la vitesse de mouvement piézoélectrique (c’est-à-dire 4 000 nm/s par préréglage).
- Élilinez le premier point de données à zéro en soustrayant la plus petite valeur de déplacement de chaque valeur de déplacement acquise. Cette transformation horizontale n’affecte pas les pentes ascendantes de l’étage De rétraction ni le calcul ultérieur de la constante de ressort.
- Notamment, le BFP est considéré comme un système de ressorts en série dans lequel Δxtot (Tableau 1) additionne les déformations du RBC, ΔxRBC (Tableau 1), la liaison moléculaire, Δxmol (Tableau 1), et la cellule Cible, Δxcellule (Tableau 1), comme l’Eq. 2:
(Eq. 2) - Tracez la courbe Force (F) vs Déplacement (Δxtot)comme illustré à la figure 2B.
(Eq. 2)3. Analyse de ressort Cnstant du mode perle-cellule
- Dans la courbe Force vs Déplacement, deux pentes distinctes peuvent être identifiées, où chacune peut représenter la phase de compression et la phase de traction. Ajuster une ligne de régression à chaque groupe de données (Figure 2B), où la plus grande pente d’ajustement linéaire représente la constante totale du ressort en phase de compression (Figure 2B, rouge), notée k1 (Tableau 1); et la plus petite pente d’ajustement linéaire représente la constante totale du ressort à la phase de traction (Figure 2B, bleu), notée k2 (Tableau 1).
- Pour les ressorts connectés en série par description de l’étape 2.2, exprimer la réciproque de la constante totale du ressort, ktot (Tableau 1), comme la somme des inverses de la constante du ressort de RBC, kRBC (Tableau 1), la liaison moléculaire, kmol (Tableau 1), et la cellule cible, kcellule (Tableau 1). Pendant la phase de compression du mode Bead-Cell, la liaison moléculaire n’est pas étirée, donc kmol n’est pas pris en considération. La réciproque du ktot dans ce scénario (1/k1) est exprimée comme
(Eq. 3).
Dans les exemples de données, kRBC est prédéterminé (0,25 pN/nm par défaut). Lacellule k peut être dérivée de l’Eq. 3 avec les k1 et kRBC acquis(Figure 3B). - Pendant la phase de traction, l’adhésion se forme entre la paire ligand-récepteur. Exprimer la réciproque du ktot dans ce scénario (1/k2) comme
(Eq. 4)
où k2 (Tableau 1) représente la constante totale du ressort pendant la phase de traction. - Dériver kmol en soustrayant 1/k1 de 1/k2 (comparer Eq. 3 vs Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. Analyse constante du ressort du mode perle-perle
- Ajuster une ligne de régression aux données de phase de compression pour obtenir k1 (similaire à la figure 2B, rouge). Il est à noter qu’en mode Perle-Perle, la cellule cible est remplacée par une perle de verre recouverte du récepteur d’intérêt(Figure 1C). Étant donné que la déformation des billes est négligeable, le termede cellule 1 /kpeut être retiré de l’Eq. 3 et de l’Eq. 4 en conséquence. Le ktot réciproque de la phase de compression (1/k1)peut être exprimé comme :
(Eq. 5) - Ajuster une ligne de régression aux données de phase de traction pour obtenir k2 (similaire à la figure 2B, bleu). Le ktot réciproque de la phase de traction (1/k2) peut être exprimé comme :
(Eq. 6) - Dériver kmol en soustrayant 1/k1 de 1/k2 (comparer Eq. 5 vs Eq. 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dans ce travail, nous avons démontré le protocole de l’analyse constante du ressort BFP. Pour le mode d’analyse Bead-Cell, nous avons analysé le kmol de la liaison moléculaire entre la protéine glycosylé Thy-1 enrobée sur la perle de la sonde et l’intégrine α5β1 exprimée sur la cellule Cible K562 (Thy-1-intégrine α5β1; Figure 3A) 10. Lacellule kest également dérivée du mode Bead-Cell (K562 Cell; Figure 3B). Pour le mode Perle-Perle, la liaison moléculaire formée entre le fibrinogène et l’intégrine αIIbβ3 (FGN-intégrine αIIbβ3; Figure 3C) 11,12 est utilisé pour démontrer le mode d’analyse Perle-Perle.
Pour le mode Bead-Cell, nous avons mesuré les constantes de ressort de Thy-1-intégrine αliaison 5β1 et de la cellule K562 en kmol = 0,45 ± 0,28 pN/nm(Figure 3A)et kcellule = 0,18 ± 0,07 pN/nm(Figure 3B)à partir de 27 événements analysables présélectionnés. Pour le mode Perle-Perle, nous avons mesuré les constantes de ressort de la liaison FGN-intégrine αIIbβ3 en kmol = 0,53 ± 0,29 pN/nm(Figure 3C)à partir de 33 événements analysables présélectionnés.
| Symbole | Définition | Symbole | Définition |
| Δxtot | Le déplacement total du piézo, qui peut également être interprété comme la déformation totale des globules rouges, de la cellule cible et de la liaison moléculaire. | ΔxRBC | La déformation RBC, qui peut également être interprétée comme le déplacement de la perle de la sonde. |
| ktot | Constante totale du ressort de l’ensemble du système de ressorts série BFP. | kRBC | Constante du ressort du RBC aspiré par la micropipette Probe. |
| kmol | La constante de ressort de la liaison moléculaire détectée BFP | kcellule | Constante de ressort de la cellule Cible. |
| k1 | ktot de la phase de compression dans l’étape de rétraction. | k2 | ktot de la phase de traction dans l’étape de rétraction. |
| ΔF1 | Incrément de force détecté par le bille de sonde dans la phase de compression. | ΔF2 | L’incrément de force détecté par le bille de sonde dans la phase de traction. |
| Δx1 | Incrément de déplacement dans la phase de compression. | Δx2 | L’incrément de déplacement dans la phase de traction. |
Tableau 1. Définitions de symboles pour l’analyse de la constante de ressort moléculaire BFP. Les positions horizontales de tous les objets sont définies comme x, tandis que Δx [nm] fait référence à la déformation par rapport à la position d’origine. ΔF [pN] fait référence à l’incrément de force mesuré par BFP. k [pN/nm] fait référence à la constante de ressort. Les indices 1 et 2 correspondent respectivement aux phases de compression et de traction. La constante de ressort moléculaire est dérivée de la Force (F) vs. Courbe de déplacement (Δxtot).
Figure 1: Configuration BFP et cycle tactile DFS. (A) Le système BFP assemble deux micropipettes opposées, à savoir la sonde(à gauche)et la cible(à droite). La micropipette Probe aspire un RBC(rouge)avec une bille de verre collée à son sommet pour servir de transducteur de force. La micropipette Target aspire une cellule porteuse de récepteurs(bleu). La constante de ressort RBC (kRBC) est déterminée par la pression d’aspiration (Δp) et les rayons de RBC aspiré (R0), de la micropipette de sonde (Rp) et de la zone de contact circulaire (Rc) entre le RBC et le bille de sonde. (B et C) Micrographies des modes BFP Bead-Cell (B) et Bead-Bead (C). Barres d’échelle = 5 μm. (D) Cycle tactile BFP composé d’étapes d’approche, d’impinge, de contact, de rétraction et de dissociation. La ligne de tiret ΔxRBC = 0 indique la position BFP non étayée, ou de force nulle. L’étape de rétraction comprend la phase de compression (ΔxRBC < 0, rouge),la position de force nulle (ΔxRBC = 0, noir)et la phase de traction (ΔxRBC > 0, bleu)dans l’ordre. La flèche noire indique la position de l’événement Bond. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Dériver les constantes de ressort moléculaire à partir des données brutes DFS. (A) Force représentative (F) vs. Courbe de temps (t) des données brutes DFS dans un cycle tactile BFP. (B) Force convertie représentative (F) vs Courbe de déplacement (Δxtot) qui représente l’étape de retrait. k1 et k2 représentent la pente d’ajustement des phases consécutives de compression et de traction respectivement. ΔF1 et ΔF2 représentent les incréments de force dans les données de phase de compression et de phase de traction, respectivement, où Δx1 et Δx2 représentent les incréments de déplacement dans les données de phase de compression et de phase de traction, respectivement. Lesvaleurs R2 pour la constante du ressort pendant la phase de compression (R12) et la phase de traction (R22) sont indiquées sur le graphique pour indiquer une bonne aptitude statistique. (C et D) Illustrations de l’étape De rétraction dans les modes expérimentaux Bead-Cell (C) et Bead-Bead (D). kRBC représente la constante de ressort de RBC; kcellule et kmol représentent les constantes de ressort de la cellule cible et de la liaison moléculaire, respectivement. Pendant la phase de traction, l’adhésion se forme entre la paire ligand-récepteur, le RBC dévie dans la même direction que le piézo se rétracte au-delà de la position de force nulle (ΔxRBC > 0). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Histogrammes représentatifs des constantes de ressort mesurées par BFP. Le numéro d’événement(axe y gauche)et la distribution de fréquence(axe y droit)des constantes de ressort mesurées pour Thy-1-intégrine αliaison 5β1 (A) et K562 Cellule cible (B) en mode Perle-Cellule et FGN-intégrine αliaison IIbβ3 (C) en mode Perle-Perle. Les histogrammes sont ajustés à la courbe de distribution gaussienne(rose)et le paramètre statistique, R2, est utilisé pour indiquer la force de la forme physique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure S1 : L’interface BFP maison. (A) Interface de contrôle BFP et de réglage des paramètres. Les paramètres pour déterminer la constante de ressort RBC sont saisis à partir du panel de paramètres biophysiques. B) Surveillance de la BFP. Les cycles tactiles BFP en direct seront observés à partir de cette vue de caméra. (C) Interface d’analyse BFP DFS où les courbes Force (F) vs Temps (t) sont examinées hors ligne et prétraitées pour une analyse ultérieure de la constante moléculaire du ressort. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure S2. BFP analyseable contrôle de la qualité des données et critères de présélection. (A) Bons événements DFS de haute qualité: (i) Événement de force de rupture perle-cellule; ii) Événement de la durée de vie de la cellule perle; iii) Force de rupture perle-perle; (iv) Événement de la vie Perle-Perle. (B) Événements DFS acceptables avec un certain bruit: (i) Dérive des données mais l’étape de retrait du zoom avant reste valide; (ii) Légère dérive des données après dissociation des liaisons; iii) Problèmes de données au régime de force zéro; iv) La force de maintien est faible (< 10 pN). (C) Événements de mauvaise qualité qui devraient être écartés: i) pas d’adhérence; ii) Oscillation des données; iii) Les données dérivent tout le temps; iv) Données discontinues; v) Force de compression trop faible (≈ 0 pN); vi) Obligations multiples; vii) Données non valides avec kmol dérivé < 0; (viii) Erreur de signal. La force zéro est indiquée par la ligne intermittente grise. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En résumé, nous avons fourni un protocole d’analyse de données détaillé pour le prétraitement des données brutes DFS et la dérivation des constantes de ressort moléculaire dans les modes d’analyse BFP Bead-Bead et Bead-Cell. Des modèles biomécaniques et des équations nécessaires à la détermination des constantes de ressort moléculaires et cellulaires sont présentés. Bien que différentes intégrines soient étudiées, le kmol mesuré par le mode Perle-Perle et le mode Perle-Cellule possède des différences de portée significatives(Figure 3A vs. Figure 3C). Il est à noter qu’avec le mode Perle-Perle, le récepteur est lié de manière covalente à la perle de verre. En revanche, avec le mode Bead-Cell, le récepteur de surface est adapté par la membrane plasmique sous-jacente et les cytosquelettes, qui influencent très probablement le kmolmesuré.
Le contrôle de la qualité des données est crucial pour assurer la reproductibilité. À cette fin, nous avons mis en œuvre les critères de présélection et d’exclusion des valeurs aberrantes des données DFS sur les diagrammes Force vs Temps. Pour le démontrer, un ensemble de données représentatif a été sélectionné, dans lequel nous avons classé les données brutes DFS en trois niveaux de qualité : Bon(Figure S2A),Acceptable avec le bruit(Figure S2B)et Mauvais inacceptable(Figure S2C). Pour les débutants d’utilisation du BFP, nous recommandons les critères stricts pour pré-filtrer les données avec la bonne qualité (Figure S2A). Il convient de noter que, sur la base des critères de présélection des données, la ligne d’ajustement de régression de la phase de compression devrait être plus raide que celle de la phase de traction, en particulier k1 > k2 (figure S2C, vii). Lorsqu’il est mesuré k1 < k2 (figure S2C,vii), le kmol dérivé < 0 est par rapport à la justification par calcul de l’étape 4. De tels événements devraient alors être considérés comme des valeurs aberrantes non valides et écartés.
Pour favoriser la mesure BFP au niveau moléculaire unique lors de l’acquisition de données, de multiples configurations expérimentales ont été mises en œuvre selon une étude précédente12. Tout d’abord, la densité de revêtement protéique sur les billes est généralement titrée à un niveau minimal (par exemple 60 μm-2)en maxquant strictement la concentration de la solution, la quantité de protéine et les conditions de réaction15. La distance spatiale moyenne entre les protéines sur la perle est ainsi estimée beaucoup plus grande que les dimensions linéaires de la protéine, favorisant nos mesures au niveau moléculaire unique12,13,14. Deuxièmement, nous contrôlons la fréquence d’adhésion pour chaque paire ligand-récepteur ≤ 20%, sous laquelle les événements de liaison moléculaire suivront la distribution de Poisson prédisant ≥ 89% des événements seraient une liaison moléculaire unique14,15. Pour ce faire, la force d’impingement et le temps de contact sont réglés en conséquence et doivent être cohérents tout au long de l’expérience12. Néanmoins, il est toujours possible que plusieurs liaisons se produisent séquentiellement(Figure S2C, vi). Dans de tels cas, nous rejetterons les événements avec des signatures de plusieurs obligations. Enfin et surtout, des expériences de contrôle négatif seront réalisées avec des perles recouvertes d’albumine sérique bovine(Table des matériaux)ou d’AS seule pour s’assurer que la fréquence d’adhérence non spécifique est ≤ 2%16,17.
Bien que la BFP soit puissante pour étudier la dynamique des protéines à la surface des cellulesvivantes10,11,12, il existe des limitations techniques. Dans la BFP, une seule paire ligand-récepteur peut être étudiée à la fois. Il serait long d’obtenir suffisamment de données avec une signification statistique. En outre, les procédures expérimentales sont exigeantes en main-d’œuvre avec des courbes d’apprentissage abruptes. Du point de vue de la mise en œuvre, le système BFP actuel est sensible à la dérive environnementale et aux vibrations mécaniques environnantes. Par conséquent, un ajustement manuel continu est nécessaire pour assurer la qualité des données DFS. À cette fin, l’une de nos études récentes a introduit des algorithmes de contrôle de rétroaction BFP ultra-stables pour améliorer la stabilité des tests DFS À pince de force BFP4. Cette avancée technique permet de mesurer une interaction moléculaire plus forte telle que la liaison antigène-anticorps avec une durée de vie de liaison ultra-longue (>50 s). Néanmoins, nous prévoyons que des efforts futurs seront déployés pour automatiser et intégrer l’acquisition de données BFP et l’analyse DFS dans un seul programme informatisé, rendant l’ensemble de l’exploitation BFP et de l’analyse des données plus conviviales et à haut débit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents à signaler concernant la présente étude.
Acknowledgments
Nous remercions Guillaume Troadec pour la discussion utile, Zihao Wang pour la consultation sur le matériel, et Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning et Simon Ringer pour le soutien de notre démarrage de laboratoire. Ce travail a été soutenu par l’Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), le NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), le Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), la National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) et le Fonds de démarrage et le programme d’équipement majeur de la Faculté d’ingénierie de l’Université de Sydney (L.A.J.). Lining Arnold Ju est un boursier DECRA de l’Australian Research Council (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
