Summary
Биомембранный силовой зонд (BFP) - это метод динамической силовой спектроскопии in situ (DFS). BFP может быть использован для измерения пружинной постоянной молекулярных взаимодействий на живых клетках. Этот протокол представляет весенний постоянный анализ молекулярных связей, обнаруженных BFP.
Abstract
Биомембранный силовой зонд (BFP) недавно появился как наноинструмент для нативной клеточной поверхности или динамической силовой спектроскопии in situ (DFS), который может измерять кинетику одномолекулярного связывания, оценивать механические свойства взаимодействий лиганд-рецептор, визуализировать динамические конформационные изменения белка и более захватывающе разъяснять механизмы механозонирования клеток, опосредованные рецепторами. Совсем недавно BFP был использован для измерения пружинной постоянной молекулярных связей. Этот протокол описывает пошаговую процедуру выполнения анализа DFS с константой молекулярной пружины. В частности, обсуждаются два режима работы BFP, а именно режимы Bead-Cell и Bead-Bead. Этот протокол фокусируется на получении пружинных констант молекулярной связи и клетки из необработанных данных DFS.
Introduction
В качестве метода DFS с живыми клетками BFP разрабатывает эритроцит человека (RBC; Рисунок 1) в сверхчувствительный и настраиваемый преобразователь силы с совместимым постоянным диапазоном пружин при 0,1-3 пН/нм1,2,3. Для зондирования взаимодействия лиганд-рецептор BFP позволяет проводить измерения DFS при ~1 пН (10-12 Н), ~3 нм (10-9м) и ~0,5 мс (10-3 с) в силе, пространственном и временном разрешении 4,5. Его экспериментальная конфигурация состоит из двух противоположных микропипет, а именно зонда и мишени. Микропипетка Probe аспирирует эрицит, и шарик приклеивается на его вершине посредством взаимодействия биотин-стрептавидин. Шарик покрыт интересующих лигандами(рисунок 1А). Микропипетка-мишень аспирирует либо клетку, либо бусину, несущую интересующих рецептор, соответствующий режимам Бисероплетение(Рисунок 1В)и Бусина-Бусина(Рисунок 1С),соответственно5.
Построение, сборка и экспериментальные протоколы DFS были подробно описаныранее 1,6. Вкратце, сенсорный цикл BFP состоит из 5 этапов: подход, ущемление, контакт, втягивание и диссоциат(рисунок 1D). Горизонтальная вершинная позиция RBC обозначается как ΔxRBC. В начале безударная (с нулевой силой) деформация RBC ΔxRBC равна 0(таблица 1). Затем мишень приводится в движение пьезотранслятором для впрызания и втягивания из шарика зонда(рисунок 1D). Зонд RBC сначала сжимается мишенью с отрицательной деформацией RBC ΔxRBC < 0. В событии Связи стадия втягивания переходит из сжимающей в растягиваемую фазу с положительной деформацией RBC ΔxRBC > 0(рис. 2C и D). Согласно закону Гука, несущая сила BFP может быть измерена как F = kRBC × ΔxRBC, где kRBC (Таблица 1)— константа пружины RBC BFP. При разрыве связи и завершении цикла одного касания шарик зонда возвращается в положение с нулевой силой при ΔxRBC = 0(рисунок 1D).
Чтобы определить kRBC,мы измеряем и регистрим радиусы внутреннего отверстия микропипетки зонда(Rp),RBC(R0)и круговой области контакта(Rc)между RBC и шариком зонда(рисунок 1A). Затем kRBC вычисляется по модели Эвана (Eq. 1) 7,8 с использованием программы LabVIEW, которая действует как виртуальный инструмент (VI) для работы BFP(рисунок S1A)8,9.
(Экв. 1)
Установив БФП и получив исходные данные DFS, мы представляем, как анализировать пружинную константу пары лиганд-рецептор или клеток. Исходные данные DFS о взаимодействии гликозилированного белка Thy-1 и клетки K562, несущей интегрин, α5β1 (Thy-1-α5β1; Фиг.3А и 3В)10и фибриноген и интегрин с шариковым покрытием αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Рисунок 3C) 11,12 были использованы для демонстрации режимов анализа Бисероплетняя клетка и Бисероплета, соответственно.
Экспериментальная подготовка BFP
Для получения подробной информации об экспериментальной подготовке и приборах BFP, пожалуйста, обратитесь к ранее опубликованным протоколам3. Короче говоря, человеческий эриртикат был биотинилирован с использованием Biotin-PEG3500-NHS в буфере углерода / бикарбоната. Интересуемые белки были ковалентно соединены с боросиликатными стеклянными шариками с использованием MAL-PEG3500-NHS в фосфатном буфере. Для прикрепления к биотинилированному эрициту шарик зонда также покрывают стрептавидином (SA) с использованием MAL-SA. Пожалуйста, ознакомьтесь с Таблицей материалов и Таблицей 2.
Для сборки BFP(рисунок 1, слева)третья микропипетка, названная «Помощник», будет использоваться для доставки шарика зонда и приклеивания его к вершинеRBC 1,3. Ковалентное взаимодействие между шариком зонда с покрытием SA и биотинилированным RBC намного сильнее, чем интересуящее связь лиганд-рецептор. Таким образом, диссоциатная стадия может быть интерпретирована как разрыв связи лиганд-рецептор, а не отделение шарика зонда от эрицита.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение анализируемых событий DFS
- Запустите эксперимент в программном обеспечении (например, LabVIEW VI) для управления BFP и настройки параметров(рисунок S1A).
- Наблюдайте за повторяющимися касаниями шариков/ячеек в программном обеспечении для монитора BFP(рисунок S1B).
- Проверьте и достигните частоты сцепления ≤ 20% в течение первых 50 касаний, настроив силу столкновения и время контакта, с помощью которых он гарантирует, что ≥ 89% событий сцепления DFS опосредованы одиночными связями12,13,14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой пары Бисероплетения и Ячейки/Бусины мы выполняем 200 повторяющихся сенсорных циклов. Для получения качества публикуемых данных мы обычно выполняем n ≥ 3 пары Бисера-Бусина или Бисер-Ячейка.- Сохраните данные в виде Force vs. Time в папку, направленную пользователем, к концу каждой пары, запрашиваемую программным обеспечением для управления BFP и настройки параметров.
- Соберите необработанные данные Force vs. Time событий Bond, как показано на рисунке 2A,используя платформу сбора BFP(рисунок S1C).
- Откройте программное обеспечение для анализа данных BFP. Нажмите на желтый значок папки и выберите соответствующий файл необработанных данных, дважды щелкнув по ним.
- Запустите программу, а затем нажмите кнопку вверх и вниз, чтобы переключаться между событиями. Используйте критерии исключения выбросов(рисунок S2),чтобы отсеять недопустимые события. Выберите экспортируемый тип данных в формате Force vs. Time и нажмите кнопку Экспорт данных графиков.
2. Преобразуйте кривую «Сила против времени» в кривую «сила против смещения»
- Экспортируйте сегмент данных, соответствующий этапу Retract, в электронную таблицу(рисунок 2A, квадратная область),которая имеет отношение к анализу пружинной константы.
- Построение кривой силы и времени с помощью программного обеспечения для работы с электронными таблицами. Чтобы получить кривую «Сила против смещения», преобразуйте значениявремени (рисунок 2A, ось x)в значения полного смещения (Δxtot)путем умножения значений времени на скорость пьезодвижения (т.е. 4000 нм/с по заданному значению).
- Обнулите первую точку данных, вычитая наименьшее значение смещения из каждого приобретенного значения смещения. Это горизонтальное преобразование не влияет ни на восходящие склоны стадии втягивания, ни на последующее вычисление пружинной константы.
- Примечательно, что BFP рассматривается как последовательная пружинная система, в которой Δxtot (Таблица 1)суммируют деформации RBC, ΔxRBC (Таблица 1),молекулярную связь, Δxmol (Таблица 1),и Целевую ячейку, Δxячейку (Таблица 1),как Экв. 2:
(Экв. 2) - Построй кривую «Сила (F) против смещения (Δxtot)», как показано на рисунке 2B.
(Экв. 2)3. Весенний cnstant анализ бисерно-клеточного режима
- В кривой «Сила против смещения» можно идентифицировать два различных помоя, где каждый из них может представлять фазу сжатия и фазу растяжений. Подогнать линию регрессии к каждой группе данных(рисунок 2B),где больший линейный наклон соответствия представляет собой общую константу пружины на фазе сжатия(рисунок 2B, красный),обозначаемую как k1 (таблица 1); и меньший линейный наклон соответствия представляет собой общую константу пружины на фазе растяжений(рисунок 2B, синий),обозначаемую как k2 (таблица 1).
- Для пружин, соединенных последовательно на этапе 2.2 описания, выражают обратную величину полнойконстанты пружины, ktot(таблица 1),как сумму пружинной константы, обратной РБК, kRBC (Таблица 1),молекулярной связи, kмоль (Таблица 1),и Целевой ячейки, kячейки (Таблица 1). Во время сжимающей фазы режима «шарик-клетка» молекулярная связь не растягивается, поэтому kмоль не принимается во внимание. Обратная k tot в этом сценарии (1/k1)выражается как
(Экв. 3).
В примере данных предварительно определено k RBC (по умолчанию 0,25 пН/нм). kячейка может быть получена из экв. 3 с приобретенными k1 и kRBC (рис. 3B). - Во время фазы растяживания образуется адгезия между парой лиганд-рецептор. Выражают обратнуюktot в этом сценарии (1/k2)как
(Экв. 4)
где k2 (Таблица 1)представляет собой общую постоянную пружины во время фазы растязывки. - Получить kмоль из вычитания 1/k1 из 1/k2 (сравните Eq. 3 и Eq. 4).
(Экв. 3).
(Экв. 4)4. Весенний постоянный анализ режима бисера-бисера
- Подогнать линию регрессии к данным фазы сжатия для получения k1 (аналогично рисунку 2B, красный). Следует отметить, что в режиме Бисера-Бусина ячейка Target заменяется стеклянной бусиной, покрытой интересующих рецептором(рисунок 1C). Поскольку деформация шарика незначительна, член1/k-клетки может быть удален из Eq. 3 и Eq. 4 соответственно. Обратный k-тот фазы сжатия (1/k1)может быть выражен как:
(Экв. 5) - Подогнать линию регрессии к данным фазы растязания для получения k2 (аналогично рисунку 2B, синий). Обратная k-тота растягиваемой фазы (1/k2)может быть выражена как:
(Экв. 6) - Получить kмоль из вычитания 1/k1 из 1/k2 (сравните Eq. 5 и Eq. 6).
(Экв. 5)
(Экв. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В этой работе мы продемонстрировали протокол анализа пружинных констант BFP. Для режима анализа «шарик-клетка» мы проанализировали kмоль молекулярной связи между гликозилированным белком Thy-1, покрытым на шарике зонда, и интегрином α5β1, экспрессируемым на клетке Target K562 (Thy-1-integrin α5β1; Рисунок 3А) 10.K-ячейка также получена из режима Шарик-Ячейка (K562 Cell; Рисунок 3B). Для режима Бисера-Шарик молекулярная связь, образованная между фибриногеном и интегрином, αIIbβ3 (FGN-интегрин αIIbβ3; Рисунок 3C) 11,12 используется для демонстрации режима анализа бисера-бусины.
Для режима «шарик-ячейка» мы измерили пружинные константы Thy-1-интегрина αсвязи 5β1 и ячейки K562 как kмоль = 0,45 ± 0,28 пН/нм(рисунок 3A)иk-ячейки = 0,18 ± 0,07 пН/нм(рисунок 3B)из 27 предварительно экранированных анализируемых событий. Для режима Бисера-Бусина мы измерили пружинные константы FGN-интегрина α связиIIbβ3 как kмоль = 0,53 ± 0,29 пН/нм(рисунок 3C)из 33 предварительно экранированных анализируемых событий.
| Символ | Определение | Символ | Определение |
| Δxtot | Полное смещение пьезо, которое также можно интерпретировать как полную деформацию эрицитового лишая, клетки-мишени и молекулярной связи. | ΔxРБК | Деформация RBC, которую также можно интерпретировать как смещение шарика зонда. |
| ktot | Общая константа пружины всей системы последовательных пружин BFP. | kРБК | Пружинная константа аспирированного RBC микропипеткой Probe. |
| кмоль | Пружинная постоянная обнаруженной молекулярной связи BFP | kячейки | Пружинная константа целевой ячейки. |
| к1 | ktot фазы сжатия в стадии втягивления. | к2 | ktot фазы растязания в стадии втягивки. |
| ΔF1 | Приращение силы, вощущаемой шариком зонда в фазе сжатия. | ΔF2 | Приращение силы, ощущаемой шариком зонда в фазе растязывания. |
| Δх1 | Приращение смещения в фазе сжатия. | Δx2 | Приращение смещения в фазе растязывания. |
Таблица 1. Определения символов для анализа молекулярной пружины BFP. Горизонтальные положения всех объектов определяются как x,в то время как Δx [нм] относится к деформации относительно исходного положения. ΔF [pN] относится к приращению силы, измеренное BFP. k [pN/нм] относится к постоянной пружины. Подстрочные индексы 1 и 2 соответствуют фазам сжатия и растяжению соответственно. Константа молекулярной пружины получена из Силы(F)против. Кривая смещения (Δxtot).
Рисунок 1:Конфигурация BFP и сенсорный цикл DFS. (A) Система BFP собирает два противоположных микропипета, а именно зонд(слева)и мишень(справа). Микропипетка Probe аспирирует RBC(красный)стеклянной бусиной, приклеенной на его вершине, чтобы служить преобразователем силы. Микропипетка Target аспирирует рецептор-несущую клетку(синий). Константа пружины RBC(kRBC)определяется давлением аспирации (Δp)и радиусами аспирированного RBC(R0),микропипетки зонда(Rp)и круговой области контакта(Rc)между RBC и шариком зонда. (В и С) Микрофотографии режимов BFP «Шарик-ячейка» (B) и «Шарик-шарик» (C). Шкала стержней = 5 мкм. (D) Сенсорный цикл BFP, состоящий из стадий подхода, импажа, контакта, втягивания и диссоциата. Линия тире ΔxRBC = 0 указывает на положение BFP безударной или нулевой силы. Стадия втягивления включает в себя фазу сжатия (ΔxRBC < 0, красный),положение с нулевой силой (ΔxRBC = 0, черный)и фазу растяжива (ΔxRBC > 0, синий)в последовательности. Черная стрелка указывает на положение события Бонда. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Получение констант молекулярной пружины из необработанных данных DFS. (A) Репрезентативная сила (F) против кривой времени (t) необработанных данных DFS за один сенсорный цикл BFP. (B) Репрезентативная преобразованная сила(F)против смещения (Δxtot)кривая, которая изображает стадию втягивания. k1 и k2 представляют собой наклон подгонки последовательных фаз сжатия и растяжений соответственно. ΔF1 и ΔF2 представляют собой приращения силы в фазе сжатия и данные фазы растяжений соответственно, где Δx1 и Δx2 представляют собой приращения смещения в фазе сжатия и данные фазы растяжений, соответственно. ЗначенияR2 для постоянной пружины во время стадии сжатия(R12)и фазы растяжений(R22)обозначены на графике для указания хорошей статистической пригодности. (C и D) Иллюстрации стадии втягивания в экспериментальных режимах Bead-Cell (C) и Bead-Bead (D). kРБК представляет собой пружинную постоянную РБК; k-клетка и kмоль представляют собой пружинные константы целевой клетки и молекулярной связи соответственно. Во время фазы растяживания между парой лиганд-рецептор образуется адгезия, эрицит отклоняется в том же направлении, что и пьезоусадки за пределы положения с нулевой силой (ΔxRBC > 0). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Репрезентативные гистограммы измеренных пружинных констант BFP. Номер события(левая ось Y)и распределение частоты(правая ось Y)измеренных констант пружины для Thy-1-интегрина α5β1 связи (A) и K562 Целевой ячейки (B) в режиме Bead-Cell и FGN-интегрина αIIbβ3 связи (C) в режиме Bead-Bead. Гистограммы соответствуют кривой распределения Гаусса(розовый),а статистический параметр R2используется для обозначения силы приспособленности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок S1: Самодельный интерфейс BFP. (A) Интерфейс управления BFP и настройки параметров. Параметры для определения константы пружины РБК вводятся из панели биофизических параметров. (B) Мониторинг БПП. С этого вида камеры будут наблюдаться сенсорные циклы BFP в реальном времени. (C) Интерфейс анализа BFP DFS, в котором кривые силы(F)против времени(t)автономно просматриваются и предварительно обрабатываются для последующего анализа константы молекулярной пружины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Рисунок S2. BFP анализируемые критерии качества данных и предварительного отбора. (A)Хорошие события DFS с высоким качеством: (i) Событие силы разрыва ячейки бусины; ii) событие, посвященное сроку службы шариковой клетки; iii) событие разрыва бусины и бусины; iv) пожизненное мероприятие «Бисера-бисер». (B)Допустимые события DFS с некоторым шумом: (i) Дрейф данных, но стадия втягивания с увеличением остается действительной; (ii) Незначительный дрейф данных после диссоциации связи; iii) перегиб данных при режиме нулевой силы; iv) удерживающая сила невелика (< 10 пН). (С) Некачественные события, которые следует отбросить: i) отсутствие адгезии; ii) колебания данных; iii) постоянное дрейфующие данные; iv) прерывистые данные; v) слишком малая сила сжатия (≈ 0 пН); vi) множественные облигации; vii) недействительные данные с производными kмоль < 0; viii) Ошибка сигнала. Нулевая сила обозначается серой прерывистой линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Таким образом, мы предоставили подробный протокол анализа данных для предварительной обработки необработанных данных DFS и получения констант молекулярной пружины в режимах анализа BFP Bead-Bead и Bead-Cell. Представлены биомеханические модели и уравнения, необходимые для определения молекулярных и клеточных пружинных констант. Хотя изучаются различные интегрины, kмоль, измеренный режимом Бисера-Бусина и режимом Бисера-Ячейка, обладает значительными различиями в диапазоне(Рисунок 3А против Рисунка 3С). Следует отметить, что в режиме Бисера-Бусина рецептор ковалентно связан со стеклянной бусиной. В отличие от режима Бисера-Клетка, поверхностный рецептор адаптируется подлежащей плазматической мембраной и цитоскелетами, которые, скорее всего, влияют на измеренный kмоль.
Контроль качества данных имеет решающее значение для обеспечения воспроизводимости. С этой целью мы внедрили критерии предварительного отбора данных ДФС и исключения выбросов на участках «Сила против времени». Чтобы продемонстрировать это, был выбран репрезентативный набор данных, в котором мы классифицировали необработанные данные DFS на три уровня качества: хороший(рисунок S2A),приемлемый сшумом (рисунок S2B)и плохо неприемлемый(рисунок S2C). Для новичков в использовании BFP мы рекомендуем строгие критерии предварительного скрининга данных с хорошим качеством(рисунок S2A). Следует отметить, что, исходя из критериев предварительного отбора данных, линия регрессионного соответствия фазы сжатия должна быть круче, чем линия растязания фазы растяживания, в частности k1 > k2 (рисунок S2C,vii). При измерении k1 < k2 (рисунок S2C,vii) производное kмоль < 0 соответствует обоснованию расчета на этапе 4. Такие события следует рассматривать как недопустимые выбросы и отбрасывать.
Чтобы способствовать измерению BFP на одномолекулярном уровне во время сбора данных, в соответствии с предыдущим исследованием 12 были реализованы несколько экспериментальныхконфигураций. Во-первых, плотность белкового покрытия на шариках обычно титруется до минимального уровня (например, 60мкм-2)путем строгого контроля концентрации раствора, количества белка и условий реакции15. Среднее пространственное расстояние между белками на шарике, таким образом, оценивается намного больше, чем линейные размеры белка, что благоприятствует нашим измерениям на одномолекулярном уровне12,13,14. Во-вторых, мы контролируем частоту адгезии для каждой пары лиганд-рецептор ≤ 20%, при которой события молекулярного связывания будут следовать за распределением Пуассона, предсказывая, ≥ 89% событий будут одномолекулярным связыванием14,15. Для этого сила наевания и время контакта устанавливаются соответствующим образом и должны быть последовательными на протяжении всего эксперимента12. Тем не менее, все еще возможно, что множественные связи происходят последовательно(рисунок S2C,vi). В таких случаях мы отбросим события с подписями нескольких облигаций. И последнее, но не менее важное: отрицательные контрольные эксперименты будут проводиться с шариками, покрытыми бычковым сывороточным альбумином(Таблица материалов)или только SA, чтобы гарантировать, что неспецифическая частота адгезии составляет ≤2% 16,17.
Хотя BFP является мощным для исследования динамики белка на поверхности живых клеток10,11,12,существуют технические ограничения. В BFP одновременно может быть исследована только одна пара лиганд-рецептор. Получение достаточных данных, имеющих статистическую значимость, отнимает много времени. Кроме того, экспериментальные процедуры являются трудоемкими с крутыми кривыми обучения. С точки зрения реализации, текущая система BFP восприимчива к дрейфу окружающей среды и окружающей механической вибрации. В результате для обеспечения качества данных DFS требуется непрерывная ручная настройка. С этой целью в одном из наших недавних исследований были введены сверхстабильное алгоритмы управления обратной связью BFP для повышения стабильности анализов BFP DFS4. Этот технический прогресс позволяет измерять более сильное молекулярное взаимодействие, такое как связывание антигена с антителом со сверхдвысоким сроком службы связи (>50 с). Тем не менее, мы предполагаем, что в будущем будут предприняты усилия по автоматизации и интеграции сбора данных BFP и анализа DFS в одну компьютеризированную программу, что сделает всю работу BFP и анализ данных более удобными для пользователя и высокопроизводительными.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов для представления информации о настоящем исследовании.
Acknowledgments
Мы благодарим Гийома Троадека за полезную дискуссию, Zihao Wang за консультации по аппаратному обеспечению и Sydney Manufacturing Hub, Грегга Суанинга и Саймона Рингера за поддержку нашего лабораторного стартапа. Эта работа была поддержана Австралийским исследовательским советом Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), Программой наращивания сердечно-сосудистого потенциала Нового Южного Уэльса (грант исследователя в начале и середине карьеры - L.A.J.), премией Сиднейского исследовательского акселератора (SOAR - L.A.J.), Инвестиционным грантом Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), Грантом идей Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (APP2003904 - L.A.J.) и Фондом стартапов факультета инженерных разработок Университета Сиднея и схемой крупного оборудования (L.A.J.). Лайнинг Арнольд Джу является членом Австралийского исследовательского совета DECRA (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
