Summary
Una sonda di forza biomembrana (BFP) è una tecnica di spettroscopia di forza dinamica in situ (DFS). La BFP può essere utilizzata per misurare la costante di molla delle interazioni molecolari sulle cellule viventi. Questo protocollo presenta l'analisi costante a molla per i legami molecolari rilevati da BFP.
Abstract
Una sonda di forza biomembrana (BFP) è recentemente emersa come nanostrutto per spettroscopia di forza dinamica (DFS) a superficie cellulare nativa o in situ in grado di misurare la cinetica di legame molecolare singolo, valutare le proprietà meccaniche delle interazioni ligando-recettore, visualizzare i cambiamenti conformazionali dinamici della proteina e chiarire in modo più eccitante i meccanismi di meccanosensing cellulare mediati dal recettore. Più recentemente, la BFP è stata utilizzata per misurare la costante di molla dei legami molecolari. Questo protocollo descrive la procedura passo-passo per eseguire l'analisi DFS a molla molecolare costante. In particolare, vengono discusse due modalità operative BFP, vale a dire le modalità Bead-Cell e Bead-Bead. Questo protocollo si concentra sulla derivazione di costanti molle del legame molecolare e della cellula dai dati grezzi DFS.
Introduction
Come tecnica DFS a cellule vive, BFP progetta un globuli rossi umani (RBC; Figura 1) in un trasduttore di forza ultrasensibile e sintonizzabile con un intervallo costante di molla compatibile a 0,1-3 pN/nm1,2,3. Per sondare l'interazione ligando-recettore, BFP consente misurazioni DFS a ~ 1 pN(10 -12 N), ~ 3 nm(10 -9 m) e ~ 0,5 ms(10 -3 s) in forza, risoluzione spaziale e temporale4,5. La sua configurazione sperimentale è costituita da due micropipette opposte, ovvero la sonda e il bersaglio. La micropipetta Probe aspira un RBC e una perle viene incollata al suo apice tramite un'interazione biotina-streptavitina. Il perno è rivestito con il ligando di interesse (Figura 1A). La micropipetta target aspira una cellula o una perna che porta il recettore di interesse, corrispondente rispettivamente alle modalità Bead-Cell (Figura 1B) e Bead-Bead (Figura 1C), rispettivamente5.
La costruzione, l'assemblaggio e i protocolli sperimentali DFS BFP sono stati descritti in dettaglio in precedenza1,6. In breve, un ciclo tattile BFP è costituito da 5 fasi: Approccio, Impinge, Contatto, Retract e Dissociate (Figura 1D). La posizione dell'apice RBC orizzontale è indicata come ΔxRBC. All'inizio, la deformazione RBC non accentata (forza zero) ΔxRBC è 0 (Tabella 1). Il bersaglio viene quindi guidato da un piezotraduatore per impattarsi e ritrarsi dal perla della sonda (Figura 1D). La sonda RBC viene prima compressa dal Target con deformazione RBC negativa ΔxRBC < 0. In un evento di legame, lo stadio di retrazione passa da una fase di compressione a una fase di trazione con deformazione RBC positiva ΔxRBC > 0 (Figura 2C e D). Secondo la legge di Hooke, la forza portante BFP può essere misurata come F = kRBC × ΔxRBC, dove kRBC ( Tabella1) è la costante della molla RBC del BFP. Dopo la rottura del legame e il completamento di un ciclo di tocco, il perle della sonda ritorna in posizione di forza zero con ΔxRBC = 0 (Figura 1D).
Per determinare il kRBC,misuriamo e registriamo i raggi dell'orifizio interno della micropipetta della sonda (Rp), l'RBC (R0) e l'area di contatto circolare (Rc) tra l'RBC e il perlo della sonda ( Figura1A). Quindi kRBC viene calcolato secondo il modello di Evan (Eq. 1)7,8 utilizzando un programma LabVIEW che funge da strumento virtuale (VI) per far funzionare il BFP(Figura S1A)8,9.
(Eq. 1)
Con un BFP stabilito e i dati grezzi DFS ottenuti, presentiamo come analizzare la costante di molla della coppia o delle cellule ligando-recettore. I dati grezzi DFS sull'interazione della proteina glicosilata Thy-1 e della cellula K562 portante integrina α5β1 (Thy-1-α5β1; Figure 3A e 3B)10 e quella dell'integrina rivestita di fibrinogeno e perle αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 sono stati utilizzati per dimostrare le modalità di analisi Bead-Cell e Bead-Bead, rispettivamente.
Preparazione sperimentale BFP
Per i dettagli sulla preparazione sperimentale e la strumentazione BFP, fare riferimento ai protocolli3precedentemente pubblicati. In breve, l'RBC umano è stato biotinilato utilizzando la Biotina-PEG3500-NHS nel tampone di carbonio / bicarbonato. Le proteine di interesse sono state accoppiate covalentemente alle perle di vetro borosilicato utilizzando MAL-PEG3500-NHS nel tampone fosfato. Per attaccarsi al RBC biotinilato, il perla della sonda è anche rivestito con streptavitina (SA) utilizzando il MAL-SA. Si prega di consultare la Tabella dei materiali e la Tabella 2.
Per assemblare il BFP (Figura 1, a sinistra), la terza micropipetta denominata 'Helper' verrà utilizzata per consegnare la sonda e incollarla all'apice del RBC1,3. L'interazione covalente tra il perle della sonda rivestito sa e l'RBC biotinilato è molto più forte del legame ligando-recettore di interesse. Pertanto, lo stadio di dissociato può essere interpretato come la rottura del legame ligando-recettore piuttosto che il distacco del perlo della sonda dal RBC.
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Protocol
1. Ottenere eventi DFS analizzabili
- Avviare l'esperimento nel software (ad esempio, LabVIEW VI) per il controllo BFP e l'impostazione dei parametri (Figura S1A).
- Osservare i ripetitivi tocchi di perle/celle del bersaglio della sonda nel software per BFP Monitor (Figura S1B).
- Testare e raggiungere la frequenza di adesione ≤ 20% entro i primi 50 tocchi regolando la forza di impingement e il tempo di contatto, con cui assicura che ≥'89% dell'evento di adesione DFS siano mediati da singoli legami12,13,14.
NOTA: per ogni coppia Bead-Cell/Bead, eseguiamo 200 cicli tattili ripetitivi. Per ottenere una qualità dei dati pubblicabile, di solito eseguiamo n ≥ 3 coppie Bead-Bead o Bead-Cell.- Salva i dati, sotto forma di Forza vs. Tempo, nella cartella diretta dall'utente entro la fine di ogni coppia, richiesto dal software per il controllo BFP e l'impostazione dei parametri.
- Raccogliere i dati grezzi Force vs. Time degli eventi bond, come esemplificato nella Figura 2A,utilizzando la piattaforma di acquisizione BFP (Figura S1C).
- Aprire il software di analisi dei dati BFP. Fare clic sull'icona della cartella gialla e selezionare il file di dati grezzi corrispondente facendo doppio clic su di essi.
- Eseguire il programma, quindi fare clic sul pulsante su e giù per passare da un evento all'altro. Utilizzare i criteri di esclusione outlier (Figura S2) per escludere gli eventi non validi. Selezionare il tipo di dati di esportazione come formato Forza vs. Tempo e fare clic sul pulsante Esporta dati grafici.
2. Converti la curva forza vs. tempo nella curva forza vs. spostamento
- Esportare il segmento di dati corrispondente alla fase Retract in un foglio di calcolo (Figura 2A, tendone quadrato), che è rilevante per l'analisi della costante della molla.
- Traccia la curva forza rispetto a time utilizzando un software per fogli di calcolo. Per ottenere la curva Force vs. Displacment, convertire i valori temporali(Figura 2A, asse x)nei valori di spostamento totale (Δxtot)moltiplicando i valori temporali con la velocità di movimento piezoelettrico (cioè 4.000 nm/s per preset).
- Azzerare il primo punto dati sottraendo il valore di spostamento più piccolo da ogni valore di spostamento acquisito. Questa trasformazione orizzontale non influisce sulle pendenze ascendenti dello stadio Retract né sul successivo calcolo della costante di molla.
- In particolare, il BFP è considerato come un sistema a mollaseriale in cui Δxtot ( Tabella1) sommano le deformazioni del RBC, ΔxRBC ( Tabella1), il legame molecolare, Δxmol ( Tabella1), e la cellula bersaglio,cella Δx( Tabella1), come Eq. 2:
(Eq. 2) - Tracciate la curva Forza (F) vs. Spostamento (Δxtot) come mostrato nella Figura 2B.
(Eq. 2)3. Analisi della molla Cnstant della modalità Bead-Cell
- Nella curva Forza vs. Spostamento, si possono identificare due pendenze distinte, in cui ciascuna può rappresentare la fase di compressione e la fase di trazione. Adattare una linea di regressione a ciascun gruppo di dati (Figura 2B), dove la pendenza di adattamento lineare più grande rappresenta la costante totale della molla in fase di compressione (Figura 2B, rosso), indicata come k1 (Tabella 1); e la pendenza di adattamento lineare più piccola rappresenta la costante totale della molla in fase di tenslile (Figura 2B, blu), denotata come k2 (Tabella 1).
- Per le molle collegate in serie per la descrizione del passo 2.2, esprimere il reciproco della costante totale della molla, ktot (Tabella 1), come somma degli inversi costanti della molla di RBC, kRBC (Tabella 1), il legame molecolare, kmol (Tabella 1) e la cella bersaglio, k cella (Tabella 1). Durante la fase compressiva del modo Bead-Cell, il legame molecolare non viene allungato, quindi kmol non viene preso in considerazione. Il reciproco del ktot in questo scenario (1/k1) è espresso come
(Eq. 3).
Nei dati di esempio, kRBC è predeterminato (0,25 pN/nm per impostazione predefinita). kcell può essere derivata dall'Eq. 3 con il K1 e kRBC acquisito ( Figura3B). - Durante la fase di trazione, si forma l'adesione tra la coppia ligando-recettore. Esprimere il reciproco del ktot in questo scenario (1/k2) come
(Eq. 4)
dove k2 (Tabella 1) rappresenta la costante totale della molla durante la fase di trazione. - Derivare kmol sottraendo 1/k1 da 1/k2 (confrontare Eq. 3 vs Eq. 4).
(Eq. 3).
(Eq. 4)4. Analisi costante della molla della modalità Perla- perla
- Adattare una linea di regressione ai dati della fase di compressione per ottenere k1 (simile alla Figura 2B, rossa). Da notare, nella modalità Bead-Bead, la cellula Target è sostituita da una perle di vetro rivestita con il recettore di interesse (Figura 1C). Poiché la deformazione del perle è trascurabile, il terminecellulare 1/kpuò essere rimosso dall'Eq. 3 e dall'Eq. 4 di conseguenza. Il ktot reciproco della fase compressiva (1/k1) può essere espresso come:
(Eq. 5) - Adattare una linea di regressione ai dati della fase di trazione per ottenere k2 (simile alla Figura 2B, blu). Il ktot reciproco della fase di trazione (1/k2) può essere espresso come:
(Eq. 6) - Derivare kmol sottraendo 1/k1 da 1/k2 (confrontare Eq. 5 vs Eq. 6).
(Eq. 5)
(Eq. 6)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In questo lavoro, abbiamo dimostrato il protocollo dell'analisi costante della molla BFP. Per la modalità di analisi Bead-Cell, abbiamo analizzato il kmol del legame molecolare tra la proteina glicosilata Thy-1 rivestita sul probe bead e l'integrina α5β1 espressa sulla cellula Target K562 (Thy-1-integrina α5β1; Figura 3A) 10. Lacella kderiva anche dal modo Bead-Cell (K562 Cell; Figura 3B). Per il modo Bead-Bead, il legame molecolare formatosi tra fibrinogeno e integrina αIIbβ3 (FGN-integrina αIIbβ3; Figura 3C) 11,12 viene utilizzato per dimostrare la modalità di analisi Bead-Bead.
Per la modalità Bead-Cell, abbiamo misurato le costanti di molla del legame Thy-1-integrina α5β1 e della cella K562 come kmol = 0,45 ± 0,28 pN/nm (Figura 3A) e kcell = 0,18 ± 0,07 pN/nm (Figura 3B) da 27 eventi analizzabili pre-vascinati. Per la modalità Bead-Bead, abbiamo misurato le costanti di molla di FGN-integrina αIIbβ3 legame come kmol = 0,53 ± 0,29 pN/nm (Figura 3C) da 33 eventi analizzabili pre-vascinati.
| Simbolo | Definizione | Simbolo | Definizione |
| Δxtot | Lo spostamento totale del piezo, che può anche essere interpretato come la deformazione totale di RBC, cellula bersaglio e legame molecolare. | ΔxRBC | La deformazione RBC, che può anche essere interpretata come lo spostamento del perlo della sonda. |
| ktot | Costante totale della molla dell'intero sistema di molle seriali BFP. | kRBC | La costante della molla dell'RBC aspirato dalla micropipetta Probe. |
| kmol | La costante di molla del legame molecolare rilevato BFP | kcella | Costante di molla della cella di destinazione. |
| k1 | ktot della fase compressiva nello stadio Retract. | k2 | ktot della fase di trazione nella fase di retrazione. |
| ΔF1 | L'incremento di forza percepito dal perno della sonda nella fase di compressione. | ΔF2 | L'incremento di forza percepito dal perla della sonda nella fase di trazione. |
| Δx1 | Incremento dello spostamento nella fase di compressione. | Δx2 | L'incremento dello spostamento nella fase di trazione. |
Tabella 1. Definizioni dei simboli per l'analisi della costante molecolare della molla BFP. Le posizioni orizzontali di tutti gli oggetti sono definite come x, mentre Δx [nm] si riferisce alla deformazione rispetto alla posizione originale. ΔF [pN] si riferisce all'incremento di forza misurato da BFP. k [pN/nm] si riferisce alla costante della molla. I pedice 1 e 2 corrispondono rispettivamente alle fasi di compressione e trazione. La costante molecolare della molla è derivata dalla Forza (F) vs. Curva di spostamento (Δxtot).
Figura 1: Configurazione BFP e ciclo tattile DFS. (A) Il sistema BFP assembla due micropipette opposte, vale a dire la Sonda(a sinistra)e il Bersaglio(a destra). La micropipetta Probe aspira un RBC(rosso)con una perle di vetro incollata al suo apice per fungere da trasduttore di forza. La micropipetta Target aspira una cellula portatrice di recettori (blu). La costante della molla RBC (kRBC) è determinata dalla pressione di aspirazione (Δp) e dai raggi dell'RBC aspirato (R0), della micropipetta della sonda (Rp) e dell'area di contatto circolare (Rc) tra l'RBC e il perla della sonda. (B e C) Micrografie delle modalità Bead-Cell (B) e Bead-Bead (C) BFP. Barre di scala = 5 μm. (D) Un ciclo tattile BFP costituito da fasi di avvicinamento, impinge, contatto, retrazione e dissociazione. La linea di tratteni ΔxRBC = 0 indica la posizione BFP non accentata o a forza zero. Lo stadio Retract comprende la fase compressiva (ΔxRBC < 0, rosso),la posizione a forza zero (ΔxRBC = 0, nero)e la fase di trazione (ΔxRBC > 0, blu)in sequenza. La freccia nera indica la posizione dell'evento Bond. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Derivare costanti molecolari a molla da dati grezzi DFS. (A) Forza rappresentativa (F) vs. Tempo (t) curva di dati grezzi DFS in un ciclo di tocco BFP. (B) Rappresentativa convertita Forza (F) vs. Spostamento (Δxtot) curva che raffigura lo stadio di retrazione. k1 e k2 rappresentano la pendenza di adattamento delle fasi consecutive di compressione e trazione rispettivamente. ΔF1 e ΔF2 rappresentano rispettivamente gli incrementi di forza nella fase compressiva e i dati della fase di trazione, dove Δx1 e Δx2 rappresentano rispettivamente gli incrementi di spostamento nei dati della fase di compressione e della fase di trazione. Ivalori R2 per la costante di molla durante la fase di compressione (R12) e la fase di trazione (R22) sono etichettati sul grafico per indicare una buona idoneità statistica. (C e D) Illustrazioni dello stadio Retract nelle modalità sperimentali Bead-Cell (C) e Bead-Bead (D). kRBC rappresenta la costante di molla di RBC; kcell e kmol rappresentano rispettivamente le costanti di molla della cellula bersaglio e del legame molecolare. Durante la fase di trazione, si forma l'adesione tra la coppia ligando-recettore, l'RBC devia nella stessa direzione in cui il piezo si ritrae oltre la posizione di forza zero (ΔxRBC > 0). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Istogrammi rappresentativi di costanti di molla misurate BFP. Il numero di evento(asse y sinistro)e la distribuzione di frequenza(asse y destro)delle costanti di molla misurate per Thy-1-integrina αlegame 5β1 (A) e K562 Cella bersaglio (B) in modalità Bead-Cell e legame FGN-integrina αIIbβ3 (C) in modalità Bead-Bead. Gli istogrammi sono adatti alla curva di distribuzione gaussiana (rosa) e il parametro statistico, R2 , viene utilizzato perindicarela forza della forma fisica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura S1: L'interfaccia BFP fatta in casa. (A) Interfaccia di controllo BFP e di impostazione dei parametri. I parametri per determinare la costante della molla RBC vengono inseriti dal pannello dei parametri biofisici. (B) Monitoraggio BFP. I cicli di tocco BFP in tempo reale verranno osservati da questa vista della telecamera. (C) Interfaccia di analisi DFS BFP in cui le curve Force (F) vs Time (t) vengono riviste offline e pre-elaborate per la successiva analisi della costante di molla molecolare. Fare clic qui per scaricare questo file.
Figura S2. Controllo della qualità dei dati analizzabili BFP e criteri di pre-screening. (A) Buoni eventi DFS con alta qualità: (i) Evento di forza di rottura della cellula del perno; (ii) evento di durata di Bead-Cell; iii) evento della forza di rottura del perno-perno; (iv) Evento di vita Bead-Bead. (B) Eventi DFS accettabili con un certo rumore: (i) Dati alla deriva ma lo zoom-in Retract stage rimane valido; ii) Leggera deriva dei dati dopo la dissociazione del legame; (iii) Kink dei dati al regime a forza zero; (iv) La forza di tenuta è piccola (< 10 pN). C) Eventi di scarsa qualità che dovrebbero essere scartati: (i) Nessuna adesione; (ii) Oscillazione dei dati; (iii) Dati che vanno alla deriva tutto il tempo; (iv) dati discontinui; (v) Forza di compressione troppo piccola (≈ 0 pN); (vi) Legami multipli; vii) dati non validi con kmol derivato < 0; (viii) Errore di segnale. La forza zero è indicata dalla linea grigia intermittente. Fare clic qui per scaricare questo file.
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Discussion
In sintesi, abbiamo fornito un protocollo di analisi dei dati dettagliato per la pre-elaborazione dei dati grezzi DFS e la derivazione di costanti molecolari a molla nelle modalità di analisi BFP Bead-Bead e Bead-Cell. Vengono presentati i modelli biomeccanici e le equazioni necessarie per determinare le costanti molecolari e cellulari della molla. Sebbene siano studiate integrine diverse, la kmol misurata dal modo Bead-Bead e il modo Bead-Cell possiedono differenze di gamma significative ( Figura3A vs Figura 3C). Da notare, con la modalità Bead-Bead, il recettore è legato covalentemente al perle di vetro. Al contrario, con la modalità Bead-Cell, il recettore di superficie viene adattato dalla membrana plasmatica sottostante e dai citoscheletri, che molto probabilmente influenzano la kmolmisurata .
Il controllo della qualità dei dati è fondamentale per garantire la riproducibilità. A tal fine, abbiamo implementato i criteri di pre-screening dei dati DFS e di esclusione outlier sui grafici Force vs. Time. Per dimostrarlo, è stato selezionato un set di dati rappresentativo, in cui sono stati classificati i dati grezzi DFS in tre livelli di qualità: Buono (Figura S2A), Accettabile con rumore (Figura S2B) e Scarso inaccettabile (Figura S2C). Per i principianti dell'utilizzo del BFP, raccomandiamo i criteri rigorosi per pre-vagliare i dati con la buona qualità (Figura S2A). Da notare, in base ai criteri di pre-screening dei dati, la linea di regressione della fase compressiva dovrebbe essere più ripida di quella della fase di trazione, in particolare k1 > k2 ( FiguraS2C, vii). Quando misurato k1 < k2 ( FiguraS2C, vii), il kmol derivato < 0 è contro il razionale per calcolo nella fase 4. Tali eventi dovrebbero quindi essere considerati come valori anomali non validi e scartati.
Per favorire la misurazione BFP a livello monomolemole durante l'acquisizione dei dati, sono state implementate più configurazioni sperimentali secondo il precedente studio12. In primo luogo, la densità del rivestimento proteico sulle perline è solitamente titolata fino a un livello minimo (ad esempio 60 μm-2) controllando rigorosamente la concentrazione della soluzione, la quantità della proteina e le condizioni direazione 15. La distanza spaziale media tra le proteine sul perline è quindi stimata molto più grande delle dimensioni lineari della proteina, favorendo le nostre misurazioni a livello monomolemole12,13,14. In secondo luogo, controlliamo la frequenza di adesione per ogni coppia ligando-recettore ≤ 20%, in base alla quale gli eventi di legame molecolare seguiranno la distribuzione di Poisson predicendo ≥ l'89% degli eventi sarebbe un legame singolo-molecolare14,15. Per raggiungere questo obiettivo, la forza di impingement e il tempo di contatto sono impostati di conseguenza e devono essere coerenti durante l'esperimento12. Tuttavia, è ancora possibile che più legami si verifichino in sequenza (Figura S2C, vi). In questi casi, scartiamo gli eventi con le firme di più obbligazioni. Ultimo ma non meno importante, gli esperimenti di controllo negativo saranno eseguiti con perle rivestite con albumina sierica bovina(Tabella dei materiali)o SA da sola per garantire che la frequenza di adesione non specifica sia ≤ 2%16,17.
Sebbene la BFP sia potente per studiare la dinamica delle proteine sulla superficie cellulare vivente10,11,12,ci sono limitazioni tecniche. Nella BFP, solo una coppia ligando-recettore può essere studiata alla volta. Sarebbe dispendioso in termini di tempo ottenere dati sufficienti con significatività statistica. Inoltre, le procedure sperimentali sono laboriose con curve di apprendimento ripide. Per quanto riguarda l'implementazione, l'attuale sistema BFP è suscettibile alla deriva ambientale e alle vibrazioni meccaniche circostanti. Di conseguenza, è necessaria una regolazione manuale continua per garantire la qualità dei dati DFS. A tal fine, uno dei nostri recenti studi ha introdotto algoritmi di controllo del feedback BFP ultra-stabili per migliorare la stabilità dei saggi DFS del morsetto di forza BFP4. Questo progresso tecnico consente di misurare l'interazione molecolare più forte come il legame antigene-anticorpo con una durata di legame ultra-lunga (>50 s). Tuttavia, prevediamo che saranno compiuti sforzi futuri per automatizzare e integrare l'acquisizione dei dati BFP e l'analisi DFS in un unico programma computerizzato, rendendo l'intero funzionamento BFP e l'analisi dei dati più facili da usare e ad alto throughput.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti da riferire in merito al presente studio.
Acknowledgments
Ringraziamo Guillaume Troadec per l'utile discussione, Zihao Wang per la consulenza hardware e Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning e Simon Ringer per il supporto della nostra startup di laboratorio. Questo lavoro è stato supportato dall'Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), nsw Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), Ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) e The University of Sydney Faculty of Engineering Startup Fund and Major Equipment Scheme (L.A.J.). Lining Arnold Ju è un borsista DECRA dell'Australian Research Council (DE190100609).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| BFP data acquisition VI | LabVIEW | BFP control and parameter setting | |
| BFP data analysis VI | LabVIEW | BFP raw data analysis | |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology, Netherlands | 9002 | Glass bead functionalization |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalization |
| Camera VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode’s buffer preparation |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode’s buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Glass bead functionalization |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation; Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode’s buffer preparation |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Streptavidin-Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
References
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975 (2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
- Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
- An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
- Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C.
- Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
- Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580 (1995).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886 (2014).
- Passam, F., et al.
- Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
- Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
- Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
- Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
- Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
- Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447 (2016).
