Kleuring van de Cytoplasmatische Ca²⁺ met Fluo-4/AM in Appelpulp

Summary

Geïsoleerde protoplasten van appelpulpcellen werden geladen met een calciumconsprecerend reagens om cytoplasmatische Ca²⁺ concentratie te detecteren.

Abstract

Cytosolic Ca²⁺ speelt een sleutelrol in de ontwikkeling van planten. Calciumbeeldvorming is de meest veelzijdige methode om dynamische veranderingen in Ca²⁺ in het cytoplasma te detecteren. In deze studie verkregen we levensvatbare protoplasten van pulpcellen door enzymatische hydrolyse. Geïsoleerde protoplasten werden geïncubeerd met het fluorescerende reagens met kleine moleculen (Fluo-4/AM) gedurende 30 minuten bij 37 °C. De fluorescerende sondes vlekten met succes cytosolische Ca²⁺ maar hoopten zich niet op in vacuolen. La^3+,een Ca²⁺ kanaalblokker, verminderde de cytoplasmatische fluorescentie-intensiteit. Deze resultaten suggereren dat Fluo-4/AM kan worden gebruikt om veranderingen in cytosolische Ca²⁺ in het vruchtvlees te detecteren. Samenvattend presenteren we een methode om protoplasten effectief te isoleren uit vleescellen van de vrucht en Ca²⁺ te detecteren door een klein molecuul calcium fluorescerend reagens in het cytoplasma van pulpcellen te laden.

Introduction

Ca²⁺ speelt een belangrijke rol bij de transductie en stofwisseling van^{plantensignalen 1,2.} Verder reguleert het de eigenschappen van de fruitkwaliteit^3,4,waaronder hardheid, suikergehalte en gevoeligheid voor fysiologische stoornissen tijdens opslag^5,6. Cytoplasmatisch Ca²⁺ speelt een belangrijke rol bij signaaltransductie en reguleert de groei en ontwikkeling van planten⁷. Verstoring van cellulaire calciumhomeostase kan bittere pit in appels^{veroorzaken 8,}bruine vlekkenziekte in peren⁹en navelstrengrot in tomaten^10,waardoor de fruitkwaliteit wordt aangetast en ernstige economische verliezen worden veroorzaakt^3,11. Calciumbeeldvorming heeft voldoende ruimtelijke en temporele resolutie en is een belangrijke methode voor het observeren van Ca²⁺ dynamiek in levende cellen^12,13.

Op dit moment zijn er twee hoofdmethoden voor intracellulaire calciumbeeldvorming in levende cellen: de ene maakt gebruik van chemische kleinmoleculaire fluorescerende sondes¹⁴en de andere is de gencoderingssensor (GECI)^15,16. Gezien de moeilijkheid om een stabiel transgeen systeem in fruitbomen en een langere vruchtontwikkeling tot stand te brengen, is GECI_S ongeschikt voor beeldvorming van fruit Ca²⁺ fluorescentie.

Fluorescentiesondes met kleine moleculen zoals Fluo-4 / AM hebben een bijzonder voordeel: hun AM-estervorm (celdoorlatend acetoxymethylesterderivaat) kan gemakkelijk in bulk in levende cellen worden geladen zonder de noodzaak van transfectie, waardoor het flexibel, snel en niet-cytotoxisch^{is 17}. Fluo-4/AM kon met succes worden geladen in de stuifmeelbuis van Pyrus pyrifolia¹⁸ en Petunia,^19, evenals in wachtcellen²⁰ en wortelhaar van Arabidopsis²¹.

Op dit moment zijn er weinig rapporten over de calciumfluorescentiekleuring van pulpcellen²². Als belangrijk mineraal element speelt calcium een sleutelrol bij de groei en kwaliteitscontrole van boomvruchten zoals appels. Appelbomen worden wereldwijd erkend als een belangrijke economische soort en appels worden beschouwd als een gezond voedsel²³. In deze studie verkregen we levensvatbare protoplasten uit appelvruchtpulp door middel van enzymatische hydrolyse en laadden vervolgens fluorescerende reagentia met kleine moleculen in het cytoplasma om Ca^{2 +}te detecteren.

Protocol

1. Protoplast extractie

1. Bereid de basisoplossing: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-morfolino)ethaansulfonzuur en 0,4 M D-sorbitol.
   OPMERKING: De pH van de basisoplossing werd aangepast naar 5,8 met 0,1 M Tris-buffer, gefilterd door 0,22 μm in water oplosbare filters en bewaard bij 4 °C.
2. Bereid de enzymatische oplossing voor: Meng 0,3% (w / v) MacerozymE R-10 en 0,5% (w / v) cellulase R-10 met de basisoplossing.
3. Voeg 0,5 ml enzymatische oplossing toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml. Kies een gezonde en rijpe appel. Snijd vervolgens de pulp in 10 x 5 x 1 mm³ formaat (Figuur 1A-1C).
4. Plaats de stukjes appelvruchtpulp in een centrifugebuis van 1,5 ml met enzymatische oplossing en sluit vervolgens de buis(figuur 1D).
5. Incubeer de buis bij 28 °C gedurende 1 uur en schud bij 70 rpm/min in een shaker in het donker.
6. Was de pulpstukjes. Aspirateer alle enzymatische oplossing en voeg vervolgens 0,5 ml van de basisoplossing toe.
7. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
8. Om een protoplast suspensie te verkrijgen, zuigt u de oplossing op vanaf de bodem van de centrifugebuis (figuur 1E).

2. Calciumionfluorescentiekleuring met kleine moleculen

1. Bereid de Fluo-4/AM-laadoplossing voor met 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 en 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS:80 mM Na₂HPO_4,1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄en 26 mM KCI) in een verhouding van 1:1:2.
2. Voeg 1 μL Fluo-4/AM-laadoplossing toe aan 99 μL van de protoplastsuspensie in de centrifugebuizen van 1,5 ml. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van de fluorescerende kleurstof 5 μM is. Meng de oplossing en sluit vervolgens de buis.
3. La³⁺ behandeling: Bereid 100 μM La³⁺ oplossing met 98 μL van de protoplast suspensie, 1 μL van 10 mM La³⁺en 1 μL Fluo-4/AM laadoplossing. Meng de oplossing en sluit de buis.
4. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in het donker.
5. Was de protoplasten door centrifugeren op 300 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Aspirateer 70 μL van de oplossing en voeg 70 μL van de basisoplossing toe.
6. Incubeer de protoplast suspensie bij 37 °C gedurende 30 minuten om volledig te de-estereren.
7. Aspirateer 15 μL van de protoplast suspensie en druppel op een dia.
8. Observeer onder een fluorescentiemicroscoop (aanvullende figuur S1).
   OPMERKING: Gebruik een kleurencamera met een hoge gevoeligheid, d.w.z. 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-sensor met een pixelresolutie van 3,45 μm.
9. Selecteer het GFP-kanaal voor beeldvorming (20x). Stel de helderheid in op 0,5.
   OPMERKING: Verlichting is led-lichtkubussen met instelbare intensiteit met een geïntegreerde filterset met harde coating. De excitatiegolflengte van Fluo-4/AM is 490 nm.

3. Protoplast levensvatbaarheidstest

1. Bereid de fluoresceïnediacetaat (FDA) stamoplossing voor: Los FDA op in aceton totdat de eindconcentratie 1 mg / ml is.
2. Bereid de FDA-werkoplossing voor met 1 μL van de stamoplossing en 99 μL aceton.
3. Voeg 1 μL FDA-werkoplossing toe aan 99 μL protoplastsuspensie. Meng de oplossing door op en neer te pipetteren en sluit vervolgens de buis.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van de FDA is 100 μg / L.
4. Vlek bij kamertemperatuur gedurende 5 min in het donker.
5. Bereid de dia's voor en observeer onder een fluorescentiemicroscoop.
6. Selecteer het GFP-kanaal voor beeldvorming(figuur 1F).

4. Beeldanalyse

1. Analyseer de verkregen afbeeldingen met behulp van beeldanalyse- en spreadsheetsoftware (bijv. Image-Pro Plus en Excel 2010).
2. Selecteer twee verticale diameters uit de protoplasten om de fluorescentie-intensiteit te berekenen(aanvullende figuur S2). De fluorescentie-intensiteit van alle protoplasten onder verschillende behandelingen werd gemeten. Gebruik voor de uiteindelijke verwerking fotobewerkingssoftware.

5. Statistische analyse

1. Statistische analyse uitvoeren met behulp van statistische software(aanvullende figuur S3). De gegevens worden gepresenteerd in Gemiddelde ± SD. De t-toetsvan de student werd gebruikt om de verschillen tussen de experimentele groepen te analyseren.

Representative Results

Volgens het hierboven beschreven protocol gebruikten we de enzymatische methode om levensvatbare protoplasten uit de pulp te verkrijgen(figuur 1). Sommige protoplasten hadden vacuolen, terwijl anderen dat niet deden. Terwijl de protoplasten geen fluorescentie vertoonden wanneer de Ca²⁺ fluorescerende indicator er niet in werd geladen. Toen Fluo-4/AM in de protoplasten werd geladen, werd het cytoplasma, maar niet de vacuole, fluorescerend (figuur 2). Dit resultaat gaf aan dat Fluo-4/AM met succes Ca²⁺ in het cytoplasma had gekleurd en dat er geen compartimentering werd waargenomen²⁴. Protoplasten werden gedurende 5 minuten gekleurd met FDA en vertoonden cytoplasmatische fluorescentie. Dit gaf aan dat hoge temperatuur (37 °C) de levensvatbaarheid van protoplasten niet beïnvloedt.

La^3+,een blokkerend middel van het Ca²⁺ kanaal²⁵, werd toegevoegd toen Fluo-4/AM in protoplasten werd geladen. Bij 100 μM verminderde La³⁺ de calciumfluorescentie-intensiteit(figuur 3).

Figuur 1: Protoplasten verkregen door enzymatische hydrolyse. (A) Een stuk werd gesneden uit een rijpe appel. (B) Protoplasten werden gewonnen uit pulpstukken. (C) De pulp werd in 10 × 5 × 1 mm³ stuks gesneden. (D) Pulpstukken werden in centrifugebuizen geplaatst die 0,5 ml enzymoplossing bevatten. (E) Protoplasten. Pijlpunten wijzen naar de protoplast en pijlen geven de vacuole in de protoplast aan. (F)Protoplasten werden gekleurd met FDA gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. (Deze figuur is gewijzigd ten opzichte van referentie ²² [Tuinbouwonderzoek: het laden van calcium fluorescerende sondes in protoplasten om calcium in de vleesweefselcellen van Malus domesticate detecteren]. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Laden van Fluo-4/AM en La³⁺ in de protoplasten. (A) Controle: Intacte protoplast zonder geladen fluorescerende sonde. (B) Protoplasten geladen met Fluo-4/AM. (C) La³⁺ werd toegevoegd wanneer de protoplasten werden geladen met Fluo-4/AM. De uiteindelijke concentratie van La³⁺ was 100 μM. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3: Statistische analyse van de fluorescentie-intensiteit in de protoplasten. Geef een significant verschil aan volgens de t-toetsvan de student (P <0,001). Verticale balken geven ± SD aan. Elk datapunt vertegenwoordigt het gemiddelde van 20 protoplasten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Fluorescentiemicroscoop. (A) Het algehele uiterlijk van de fluorescentiemicroscoop. (B) Instellingen pagina. Selecteer 20x-objectief, GFP-kanaal en pas de helderheid gelijkmatig aan op 0,5. (C) Fluorescentie-excitatiegebied. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Stappen die worden gebruikt om de Ca²⁺ fluorescentie-intensiteit te berekenen bij protoplast van fruitcellen. Fluorescentie-intensiteitseenheden die in deze studie worden^gebruikt,zijn gebaseerd op eerdere rapporten^26,27,28,29. Het berekeningsproces is als volgt: (A) Open het protoplast fluorescentiebeeld in de software. Klik op het gereedschap Meten. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Profiellijn. (B) Selecteer Cirkel in het venster Lijnprofiel. Teken hiermee een ellips bij de protoplast. (C) Selecteer nu in het venster Lijnprofiel de optie Bestand | Gegevens exporteren (D) Controleer of de lege spreadsheet wordt geopend en importeer gegevens door op Gegevensexportte klikken. Gebruik de 'gemiddelde' functie om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit te berekenen. Elke behandeling werd driemaal herhaald met elk meer dan 20 protoplasten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S3: Gegevensstatistieken werden uitgevoerd met behulp van statistische analysesoftware. Plak de gegevens in de tabel en klik op Analyseren voor gegevensanalyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S4: Extractie van protoplasten uit de pulp van andere appelvariëteiten. (A) Dounan. (B) Honing Crisp. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

In deze studie werden levensvatbare protoplasten verkregen door enzymatische hydrolyse. Merk op dat deze methode verse appels vereist. Het huidige protocol maakt de snelle isolatie van een groot aantal protoplasten uit vruchtenpulp mogelijk voor gebruik in onderzoeksstudies. De toepasbaarheid van deze methode is niet beperkt tot 'Fuji'; de protoplasten van de appelpulp van 'Dounan' en 'Honey Crisp' kunnen ook via hetzelfde protocol worden geëxtraheerd (aanvullende figuur S4). De protoplastoplossing na enzymolyse bevat celresten, die enigszins verbeterd waren in vergelijking met eerdere methoden. Als essentieel celmateriaal kunnen protoplasten van appelpulp worden gebruikt voor celeiwitexpressietechnologie, eencellige sequencing en ander onderzoek.

Er zijn veel methoden met betrekking tot chemische fluorescerende reagenskleuring in plantencellen³⁰. Fluo-3/AM werd bijvoorbeeld geladen bij een lage temperatuur (4 °C), zodanig dat het de wortelpuntcellen³¹zou binnendringen. Fluo-3/AM kan ook bij hoge temperatuur (37 °C) in de pollenbuis worden geladen³². Fluo-4/AM is met succes geladen in de stuifmeelbuis van Pyrus pyrifolia (25 °C gedurende 15 min)¹⁸ en het wortelhaar van Arabidopsis (4 °C gedurende 30 min)³³. Deze methoden zijn echter niet geschikt voor het kleuren van appelpulpprotoplasten. In deze studie hebben we met succes fluorescerende sondes in protoplasten geladen bij een hoge temperatuur (37 °C). Bovendien is de huidige methode eenvoudig, snel, nauwkeurig en heeft deze geen invloed op de vitaliteit van protoplasten. Een cruciale stap in de voorgestelde methode is om de gekleurde protoplasten te wassen en gedurende 30 minuten te incuberen. Na het kleuren moeten de protoplasten worden gewassen. Het wassen zal de achtergrondfluorescentie tijdens de observatie verminderen, zodat de fluorescentie-intensiteit van de protoplasten nauwkeuriger kan worden geteld. Incubeer gedurende 30 minuten om meer sondes in de protoplasten te kunnen laden. Houd er rekening mee dat het essentieel is om blootstelling aan licht tijdens het laden te vermijden.

La³⁺ is een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van Ca^2+. Het bindt aan de Mg²⁺ katalytische plaats op het cytoplasmatische membraan Ca²⁺-ATPase, waardoor de steady-state omzet van Ca²⁺-ATPase wordt geremd en de Ca²⁺ transmembraanfunctie wordt geblokkeerd³⁴. La³⁺ behandeling verminderde cytoplasmatisch Ca²⁺en Fluo-4/AM zou deze verandering kunnen weerspiegelen, met uitsluiting van de interferentie van andere divalente kationen en het verifiëren van de haalbaarheid van chemische fluorescentiereagentia.

Hoewel deze laadmethode meer voordelen biedt dan andere methoden, moet deze nog verder worden verbeterd bij het transformeren van gegevensresultaten. Hier schatten we het relatieve cytoplasmatische Ca²⁺ gehalte door de fluorescentiewaarde van protoplasten te detecteren, wat kwalitatieve gegevens zijn in plaats van kwantitatieve. Daarom is het bijzonder belangrijk om de kleuringsresultaten in toekomstige studies te vertalen naar specifieke cytoplasmatische Ca^{2 +} -inhoud, die een onderzoeksbasis kunnen bieden voor het analyseren van fruit Ca^{2 +} -signalering.

Samenvattend kan de hierin beschreven methode cytoplasmatisch Ca²⁺ in appelpulpcellen detecteren, waardoor technische ondersteuning wordt geboden voor de gerelateerde studies van fruitpulpcelcalcium.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.