Summary
本文介绍了用于评估紫外线辐射和化学毒素对原代和永生化细胞系的毒性的程序。
Abstract
本文介绍了测量紫外线 （UV） 辐射和眼毒素对原发性 （pHCEC） 和永生化 （iHCEC） 人角膜上皮细胞培养物的毒性的方法。细胞暴露于紫外线辐射和有毒剂量的苯扎氯铵（BAK），过氧化氢（H 2 O2）和十二烷基硫酸钠（SDS）。使用代谢测定法测量代谢活性。使用多重白细胞介素（IL）-1β，IL-6，IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定法测量炎症细胞因子的释放，并使用荧光染料评估细胞的活力。
紫外线对细胞代谢活性和细胞因子释放的破坏性影响发生在iHCEC的紫外线暴露5分钟和pHCEC的20分钟。在暴露于BAK，H2O2 或SDS后，iHCEC和pHCEC的代谢活性下降百分比相似，IL-6和IL-8的细胞因子释放变化最显着。荧光染色的iHCEC和pHCEC BAK暴露细胞的显微镜检查显示，在0.005%BAK暴露时细胞死亡，尽管iHCEC的乙锭染色程度高于pHCEC。利用多种方法评估使用显微镜的毒性作用，评估代谢活性和细胞因子产生，可以确定原代和永生化细胞系的紫外线辐射和化学毒素的毒性。
Introduction
进行体外毒理学研究以预测可能对细胞造成损害的化学物质和其他试剂的毒性作用。在评估对角膜的毒性时，人角膜上皮细胞（HCEC）已被用于评估这些影响的模型中1，2，3，4。这些模型通常评估生理效应，例如细胞代谢活动的变化，细胞增殖和其他细胞功能，例如炎性细胞因子的产生和释放。对于这些毒理学研究，已经选择了来自不同来源的细胞来评估化学物质和紫外线辐射对HCEC的破坏作用2，3。pHCEC系可从提供来自成人供体组织的这些细胞的公司获得。原代细胞可以用分散酶处理，并轻轻刮掉角膜进行培养5。然后对细胞进行病毒和污染测试，然后用10%二甲基亚砜冷冻保存。
原代细胞系的优点是细胞在遗传上与供体的细胞相同。这是理想的，因为 体外 模型应尽可能模仿 体内 组织。原代细胞系的缺点是它们的细胞分裂或传代次数有限6。可用的细胞数量有限，限制了使用单一原代培养物可以进行的实验数量，增加了实验的成本。
永生化细胞系也已用于细胞培养毒性模型。然而，与从体内组织获得的原代细胞系不同，永生化的细胞系已经过遗传改变。永生化细胞是通过将病毒的基因结合到原代细胞6，7，8的DNA中而创建的。为永生化细胞系选择具有成功病毒基因掺入的细胞。永生化的优点是它允许无限期的快速增殖，提供无限数量的细胞来使用相同的细胞系进行多次实验。这允许实验之间的一致性并降低成本。
除了限制细胞增殖的基因变化外，关键功能基因表达的变化也可能发生9。因此，使用永生化细胞的缺点是，就对各种外部刺激的反应而言，它们可能不再 代表原始体内 细胞10。比较涉及观察化学物质对原代和永生化的人角膜角质细胞的毒性作用11，以及永生化的HCEC和兔角膜上皮原代细胞12。毒素对原代人角质细胞和永生化角质细胞的影响之间的比较显示没有显着差异11。使用本文中详述的方法，将确定这些测定法评估紫外线辐射和眼部毒素对pHCEC和iHCEC的毒性的有效性。
选择了体外测定中常用的三种眼部毒素：BAK，H 2 O2和SDS。BAK是一种阳离子防腐剂，常用于眼用溶液13，14，H2O2通常用于消毒隐形眼镜15，SDS是一种阴离子表面活性剂，存在于洗涤剂和洗发水中14。与眼部毒素类似，紫外线辐射也会对HCEC造成重大损害3。此外，过度暴露于紫外线会导致一种称为光角膜炎的眼部疾病，其特征是流泪、对光敏感和砂砾感的症状16.
可以使用无限数量的原代细胞培养物和已开发的各种永生化细胞系。因此，进行了一项研究，将原代HCEC与永生化的HCEC系进行比较，以确定包含这些类型细胞的模型之间的异同。
这项研究使用显微镜来评估pHCEC和iHCEC之间对紫外线和毒素的细胞生理反应的可能差异。还评估了紫外线辐射和化学物质对两种细胞系的细胞代谢活性和炎性细胞因子释放的影响。确定两种细胞系之间的差异的重要性在于了解这些细胞系的最佳用途，以评估：1）紫外线辐射对细胞的影响，2）毒素对细胞的影响，以及3）由此产生的代谢，细胞活力和细胞因子释放的变化，以供未来的研究。
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Protocol
1. 生物用氯环油酸和生物异氯环氧乙烷的培养
- 使用以下补充剂在人眼上皮培养基 （HOEM） 中培养 pHCEC 和 iHCEC：6 mM L-谷氨酰胺、0.002% 细胞培养基补充剂 O（材料表）、1.0 μM 肾上腺素、0.4% 细胞培养基补充剂 P（材料表）、5 μg/mL rh 胰岛素、5 μg/mL 载脂转铁蛋白和 100 ng/mL 半琥珀酸氢化可的松半琥珀酸酯在胶原蛋白-1 包被培养瓶中（75 cm2 培养瓶中为 18 mL）。
- 每2-3天更换一次培养瓶中的培养基，在细胞生长至~80%汇合后除去培养基。加入不含酚红的解离溶液，并将烧瓶在37°C孵育直至细胞完全分离。用血清用DMEM / F12中和解离溶液，然后以500 × g离心细胞。除去上清液培养基并将细胞重悬于HOEM培养基中。
2. 使用共聚焦显微镜测定细胞大小
- 用 1 mL HOEM 以 1 × 105 的浓度将 pHCEC 和 iHCEC 接种到带有玻璃底盖玻片的胶原蛋白包被的培养皿上。在含有5%CO2的37°C培养箱中培养pHCEC和iHCEC，一组培养物24小时，另一组培养物48小时。
- 孵育期后，用含有钙黄绿素（4μM），乙锭同源二聚体-1（8μM）和膜联蛋白V（5μL在500μL缓冲液-Alexa Fluor 647偶联物中的5μL）的膜联蛋白染色缓冲液在37°C下染色细胞20分钟。 染色细胞后，使用共聚焦激光扫描显微镜调整显微镜以捕获钙黄绿素-AM的488/515 nm，乙锭同源二聚体-1的543/600 nm和膜联蛋白V的633/665 nm的激发/发射波长。
- 获取图像并采用Z堆栈以评估三维细胞大小。
- 要获取二维 （2D） 和三维 （3D） 图像，请使用复消色差 40x/1.2 水镜找到要成像的区域。使用氩气 （488）（第一次扫描）、HeNe1 （543）（第二次扫描）和 HeNe2 （633）（第三次扫描）激光器，使用 HFT 488/543/633、NFT 635 Vis 和 NFT 545 LP560、LP505 在三个单独的通道中进行扫描。
- 使用多轨顺序扫描来减少串扰。
注意：LP505 用于带有 488 激光器的通道 2，以捕获钙黄绿素染料的发射。LP560 在通道 3 中使用 543 激光器来捕获乙锭同源二聚体 1 的发射。NFT 635 与 633 激光一起使用以捕获膜联蛋白 V 的发射。高频处理的目的是分离激发光和发射光。NFT 通过将指定波长<光反射到单独的通道来分割光，同时让>指定波长的光通过第二个通道。LP滤光片阻挡比指定波长更短的波长，并让较长的波长通过。 - 要以 3D 方式成像，请将共聚焦设置为 Z 堆栈并扫描至少 20 帧。
3. 细胞暴露于紫外线辐射
- 在 24 孔胶原蛋白-1 包被的培养板的每个孔中以 5 ×10 4/mL HOEM 接种细胞，并在 37 °C 下用 5% CO2 孵育 3 小时。孵育期后，将孔中培养基的体积减少至300μL。接下来，将细胞暴露在紫外线辐射下（6.48W / m 2的UVA和1.82W /m 2的UVB，因为UVA和UVB管同时在培养箱中打开）在37°C培养箱中单独实验5和20分钟。
- 紫外线辐射后，向每个孔中加入200μL新鲜HOEM，并在37°C下用5%CO2孵育20小时。
- 孵育后，收集每个孔中的细胞上清液并将其转移到无菌的2 mL聚丙烯管中。在-80°C冷冻。 为了确定 pHCEC 和 iHCEC 在紫外线照射后释放的细胞因子水平，请使用多重细胞因子测定并按照试剂盒的说明量化以下四种细胞因子：IL-6、IL-8、IL-1β 和 TNF-α。
- 向孔中的细胞中加入代谢测定试剂。
- 在DMEM / F12中制备10%代谢测定试剂。用1mL的10%代谢测定溶液替换每个孔中的培养基，并在37°C下用5%CO2 孵育4小时。
- 使用荧光板读数器在530/590nm激发/发射波长下测量每种溶液的荧光。
4. 细胞暴露于化学毒素
- 在24孔胶原蛋白-1包被的培养板的每个孔中接种5×104 / mL HOEM的细胞，并在37°C下用5%CO2孵育3小时。孵育期后，除去培养基并将细胞暴露于1mL化学毒素（BAK 0.001%，H 2 O2 0.01%和SDS 0.0025%磷酸盐缓冲盐水（PBS））中5和15分钟。
- 暴露于化学毒素后，从孔中取出毒素，用 1 mL PBS 冲洗，并向每个孔中加入 1 mL HOEM。孵育20小时后，通过用1mL的10%代谢测定溶液替换培养基并在37°C下用5%CO2 孵育4小时来进行代谢测定。使用荧光多孔板读数器在530/590nm激发/发射波长下测量荧光。
- 孵育20小时后将细胞上清液从孔中转移到单独的无菌2mL聚丙烯管中，并在-80°C下冷冻。 量化pHCEC和iHCEC在接触化学物质后释放的细胞因子。使用与评估来自紫外线处理细胞的细胞因子相同的多重平台。按照试剂盒的说明使用多重细胞因子测定来定量以下四种细胞因子：IL-6、IL-8、IL-1β 和 TNF-α。
5. 检查暴露于各种浓度BAK的细胞
- 在24孔胶原蛋白-1包被的培养板的每个孔中接种1×105 / mL HOEM的细胞，并在37°C下用5%CO2 孵育24小时。孵育期后，除去培养基并将细胞暴露于 1 mL 化学毒素（BAK 0.001%，BAK 0.005% 和 BAK 0.01% 在 PBS 中）中 5 分钟。
- 暴露后，去除化学毒素，用 1 mL PBS 冲洗孔，并向每个孔中加入 1 mL HOEM。孵育20小时后，用含有钙黄绿素（4μM），乙锭同源二聚体-1（8μM）和膜联蛋白V（5μL在500μL缓冲液-Alexa Fluor 647偶联物中的5μL）的膜联蛋白染色缓冲液在37°C下染色细胞20分钟。 调整显微镜以分别在 630/675 nm、495/515 nm 和 528/617 nm 的激发/发射波长下测量膜联蛋白 V、钙黄绿素 AM 和乙锭-1 染色的强度。使用荧光显微镜对细胞进行成像
6. 数据分析
- 在执行方差分析 （ANOVA）、Welch ANOVA 或 Kruskal-Wallis 检验之前，执行正态性检验和相等方差检验。使用适当的 事后 测试来比较每个测试组。将 p 设置为 0.05 <。
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Representative Results
细胞大小
用三种荧光染料可视化原代和永生化的HCEC，它们反映了细胞活力的三个不同阶段。活细胞为绿色（钙黄绿素-AM），死细胞为红色（乙锭同源二聚体-1），凋亡细胞为黄色（膜联蛋白V-计算机调整的颜色，以便更好地可视化荧光信号）。活细胞在细胞质中含有酯酶，并将钙黄绿素-AM转化为钙黄绿素。死细胞具有可渗透乙锭同源二聚体-1的细胞膜。凋亡细胞在细胞膜处有染色，因为磷脂酰丝氨酸被转移到外膜。
使用共聚焦显微镜比较了两种类型的HCEC在生长24和48小时后的细胞大小，如图 1所示。iHCEC（图1A）是较小的细胞，范围为10μm至20μm，pHCEC（图1B）在生长24小时后的大小范围为20μm至50μm。在生长48小时后，iHCEC（图1C）和pHCEC（图1D）的大小范围也观察到类似的差异。使用共聚焦显微镜制作两种类型的HCEC的3D图像（图2A 显示了pHCEC; 图2B 显示了iHCECs）。
图 1：使用共聚焦显微镜的 细胞大小比较。 iHCEC在生长24（A）和48（C）小时后，细胞大小从10到20μm不等。 pHCEC在生长24（B）和48（D）小时后，细胞大小从20到50μm不等。 40倍水物镜。比例尺 = 10 和 20 μm （A）;25和50微米（B）;10和20微米（C）;50微米（D）。缩写：iHCEC=永生化的人角膜上皮细胞;pHCEC = 原代人角膜上皮细胞。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：3D 共聚焦图像。 生长48小时后pHCEC的3D共聚焦图像（A）和24小时后的iHCECs（B）。40倍水镜。缩写：iHCEC=永生化的人角膜上皮细胞;pHCEC = 原代人角膜上皮细胞。请点击此处查看此图的大图。
紫外线对原发性和永生化HCEC的影响
暴露于紫外线后初级和永生化HCEC的代谢活性如图 3所示。该图显示了来自测试孔（一式四份井，两个独立实验）的归一化均值。与非紫外线暴露细胞相比，照射的pHCEC的代谢活性在暴露20分钟时显着降低。对于iHCEC，在5和20分钟照射的细胞的代谢活性降低。因此，与iHCEC相比，降低pHCEC的代谢活性需要更长的暴露时间。
图3：暴露于5和20分钟紫外线辐射后pHCEC和iHCEC的代谢活性 。 *p < 0.05 的非紫外线暴露对照。非紫外线暴露对照是与测试样品一起孵育但不暴露于紫外线的孔中的细胞。Y轴是相对于未暴露于紫外线的细胞的代谢活性的百分比。误差线表示标准偏差。缩写：iHCEC=永生化的人角膜上皮细胞;pHCEC=原代人角膜上皮细胞;紫外线 = 紫外线。 请点击此处查看此图的大图。
紫外线照射对HCEC释放炎性细胞因子的影响如图 4所示。最大细胞因子释放发生在原发性和永生化HCEC的不同紫外线暴露时间。iHCEC的最大细胞因子释放量为紫外线照射5分钟。与非紫外线暴露的细胞相比，细胞释放了显着水平（p < 0.05）的IL-1β，IL-6和IL-8。此外，在紫外线照射20分钟时，iHCEC没有发生显着的细胞因子释放。然而，pHCEC的最大细胞因子释放发生在紫外线照射20分钟时。与非紫外线暴露细胞相比，所有四种细胞因子（IL-1β，IL-6，IL-8和TNF-α）均以显着水平释放。就释放的炎性细胞因子总量（pg/mL）而言，pHCEC释放的IL-1β、IL-8和TNF-α明显高于iHCEC，而iHCEC释放的IL-6更多。
图 4：暴露于紫外辐射后 pHCEC 和 iHCEC 释放的细胞因子（pg/mL）。 定量的四种促炎细胞因子是IL-1β（A），IL-6（B），IL-8（C）和TNF-α（D）。*p < 0.05 的非紫外线暴露对照。误差线表示标准偏差。缩写：iHCEC=永生化的人角膜上皮细胞;pHCEC=原代人角膜上皮细胞;紫外线 = 紫外线;IL = 白细胞介素;TNF-α = 肿瘤坏死因子α。 请点击此处查看此图的大图。
化学毒素对初级和永生化HCEC的影响
暴露于三种眼部毒素后代谢活性降低的百分比在pHCEC和iHCEC之间相似，如图 5所示。该图显示了来自测试孔（一式四份井，两个独立实验）的归一化均值。
图5：暴露于三种眼部毒素5和15分钟后pHCEC和iHCEC的代谢活性*p <对照的0.05。非毒素暴露对照是与测试样品一起孵育但不暴露于化学毒素的孔中的细胞。Y轴是相对于未暴露于化学毒素的细胞的代谢活性的百分比。误差线表示标准偏差。缩写：iHCEC=永生化的人角膜上皮细胞;pHCEC=原代人角膜上皮细胞;BAK = 苯扎氯铵;H2O2 = 过氧化氢;SDS = 十二烷基硫酸钠。请点击此处查看此图的大图。
pHCEC释放的细胞因子量大于iHCEC释放的量。暴露于三种化学物质对细胞因子IL-6的释放影响最大（BAK 0.001%，H 2 O2 0.01%，SDS 0.0025%，图6）。该图显示了来自测试孔（一式四份孔，两个独立实验）的平均值（pg/mL）。pHCEC和iHCEC在接触所有三种化学物质后都显示出IL-6释放的变化。与初级和永生化HCEC的对照组相比，BAK导致IL-6的释放减少，而H2O2导致iHCEC中IL-6的释放增加，pHCEC的释放减少。
图6：细胞因子释放。 pHCEC和iHCEC在暴露于三种眼部毒素5和15分钟后以pg/mL为单位释放细胞因子。定量的四种促炎细胞因子是IL-1β（A），IL-6（B），IL-8（C）和TNF-α（D）。*p <控件的 0.05。误差线表示标准偏差。缩写：iHCEC=永生化的人角膜上皮细胞;pHCEC=原代人角膜上皮细胞;BAK = 苯扎氯铵;H2O2 = 过氧化氢;SDS = 十二烷基硫酸钠;IL = 白细胞介素;TNF-α = 肿瘤坏死因子α。 请点击此处查看此图的大图。
不同浓度的BAK对细胞活力的影响
BAK浓度0.001%，0.005%和0.01%持续5分钟对iHCEC活力的影响如图7所示。BAK对pHCEC和iHCEC均显示0.001%的影响很小。pHCEC和iHCEC均在BAK的0.005%和0.01%处受到显著损害。在0.005%和0.01%的BAK中，iHCEC的乙锭染色程度高于pHCEC。钙黄绿素染成绿色，乙锭染成红色，膜联蛋白V蓝（膜联蛋白V色计算机调整颜色，可更好地可视化荧光信号）
图7：暴露于不同浓度BAK的pHCEC和iHCEC的荧光显微镜图像5分钟。 比例尺 = 200 μm;10倍物镜。缩写：iHCEC=永生化的人角膜上皮细胞;pHCEC=原代人角膜上皮细胞;BAK = 苯扎氯铵。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
评估了使用两种类型的HCEC的潜在差异。将细胞置于相同浓度的细胞的相同培养基（HOEM）中，然后暴露于短时间和长期的紫外线辐射和三种眼部毒素中。根据它们的生理效应选择紫外线辐射和化学物质的剂量，这些效应对细胞的损害足以产生可以比较的中间反应。紫外线辐射的暴露时间为5和20分钟，所选剂量的BAK （0.001%），SDS（0.0025%）和H 2 O2（0.01%）的暴露时间为5和15分钟是理想的暴露时间和浓度，显示出细胞和未处理的对照之间的显着差异反应。
HOEM 是一种无血清培养基，针对 HCEC 培养进行了优化。HOEM支持原代细胞和永生细胞的生长。本研究中使用的永生化细胞系使用SV408永生化。SV40永生化细胞表达癌基因蛋白，该蛋白可以通过干扰Rb，p53和pp2a17来促进细胞周期进程。视网膜母细胞瘤（Rb）结合并抑制E2F转录因子，当不被抑制时，允许细胞在细胞周期中进展并分裂18。分子p53还与转录因子结合以控制细胞周期的进展19。第三种分子pp2a20，21的抑制也促进细胞增殖22。抑制Rb、p53和pp2a17 的SV40癌基因蛋白的表达可能导致iHCEC与pHCEC的反应差异。两种类型的HCEC的细胞大小也不同，这可能是由于这些癌基因抑制蛋白，因为在细胞达到原代细胞的大尺寸之前，永生化的细胞被迫被这些分子分裂。
角膜暴露于紫外线辐射会对角膜上皮细胞造成严重损害。紫外线辐射会在细胞中产生活性氧，破坏DNA和细胞分子，并破坏酶过程23，24。UVB直接破坏DNA，UVA通过在细胞内产生活性氧来破坏DNA和其他细胞分子，然后可以与其他生物分子反应25，26。由于暴露细胞释放炎症细胞因子，这种紫外线损伤会引起细胞毒性和炎症3，27。在这项研究中，永生化细胞对紫外线辐射对细胞代谢活性的影响更敏感，因为永生化细胞的代谢活性下降，但在5分钟后原代细胞系中没有下降。pHCEC和iHCEC之间也存在炎症细胞因子释放的差异。pHCEC在紫外线辐射20分钟后释放的IL-1β、IL-8和TNF-α多于iHCEC。细胞因子释放的这些差异可能与原代细胞培养物和永生化细胞培养物的细胞大小之间的差异有关。在另一项研究中已经注意到原代细胞和永生化细胞之间细胞因子释放的差异影响，该研究检查了香烟烟雾对原代和永生化细胞系的影响28。
为了模拟化学毒素引起眼睛刺激的可能性，已经开发了各种细胞培养模型来评估这些化学物质的细胞毒性。这项研究表明，对HCEC有中等影响的眼部毒素在原发性和永生化HCEC的代谢活性下降百分比大致相同。与未处理的对照组相比，三种眼部毒素没有引起大多数炎性细胞因子的大量释放。然而，本文显示了该方法在检测基线细胞因子水平方面的灵敏度。已经评估了另一种从永生化细胞系中检测细胞因子的方法，发现无法检测基线细胞因子水平29。暴露于BAK的培养物的显微图像显示，在暴露5分钟和恢复20小时后，pHCEC和iHCEC的毒性分别为0.005%和0.01%。
该方案的关键步骤是选择紫外线剂量和眼毒素剂量，导致对细胞产生中等毒性，并确保每种类型的HCEC在同一培养基中生长。这样可以比较每种治疗对pHCEC和iHCEC的影响。在暴露于有毒物质时可以对该方法进行修改。但是，建议将暴露时间保持在接近本协议中测试的时间，因为较短的时间点可能不会对细胞产生毒性。相反，暴露时间过长可能会造成太大的损害，因此眼毒素毒性的微小差异无法与本协议中描述的测试剂的破坏性影响进行比较。
永生化HCEC相对于初级HCEC的优势之一是永生化细胞在暴露于眼毒素后的代谢活性和细胞因子释放的标准偏差低于原代细胞。因此，为了评估暴露后的代谢活性和细胞因子释放，永生化细胞比原代细胞更有可能检测到生理毒性。原代细胞和永生化细胞系均检测出紫外线照射后代谢活性和细胞因子释放的显著影响，均检测出用荧光染料染色细胞后BAK的毒性。
除了本研究中提到的毒性终点外，还可以测试其他终点，包括对紧密连接、细胞增殖、细胞迁移和其他细胞因子释放的影响。该协议使用细胞通透性，酯酶活性和细胞凋亡的测量来评估有毒剂对四种炎性细胞因子，代谢活性和细胞活力释放的影响。此外， 体内o试验，如兔眼刺激试验，应包括在毒性试验电池中，因为i体外 毒性试验适用于评估毒性对HCEC的作用机制。需要在动物中进行 体内 试验，以确定是否存在无法 在体外建模的其他免疫和毒性机制。
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Disclosures
作者Lyndon W. Jones在过去3年中通过CORE获得了以下公司的研究支持或讲师酬金：Alcon，Allergan，Allied Innovations，Aurinia Pharma，BHVI，CooperVision，GL Chemtec，i-Med Pharma，J&J Vision，Lubris，Menicon，Nature's Way，Novartis，Ophtecs，Ote Pharma，PS Therapy，Santen，Shire，SightGlass SightSage和Visioneering。Lyndon Jones还是Alcon，CooperVision，J&J Vision，Novartis和Ophtecs的顾问和/或顾问委员会成员。其他作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者没有获得这项工作的资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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