Summary
Dieser Artikel beschreibt die Verfahren zur Bewertung der Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen auf einer primären und immortalisierten Zelllinie.
Abstract
Dieser Artikel beschreibt die Methoden zur Messung der Toxizität von ultravioletter (UV) Strahlung und Augentoxinen auf primären (pHCEC) und immortalisierten (iHCEC) humanen Hornhautepithelzellkulturen. Die Zellen wurden UV-Strahlung und toxischen Dosen von Benzalkoniumchlorid (BAK), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Natriumdodecylsulfat (SDS) ausgesetzt. Die metabolische Aktivität wurde mit einem metabolischen Assay gemessen. Die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen wurde mit einem Multiplex-Interleukin (IL)-1β-, IL-6-, IL-8- und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α)-Assay gemessen, und die Zellen wurden mit Fluoreszenzfarbstoffen auf ihre Lebensfähigkeit untersucht.
Die schädigenden Auswirkungen von UV-Strahlung auf die Stoffwechselaktivität und die Freisetzung von Zytokinen traten bei 5 min UV-Exposition für iHCEC und 20 min für pHCEC auf. Ähnliche prozentuale Abnahmen der metabolischen Aktivität von iHCEC und pHCEC traten nach Exposition gegenüber BAK,H2O2 oder SDS auf, und die signifikantesten Veränderungen in der Zytokinfreisetzung traten für IL-6 und IL-8 auf. Die Mikroskopie von fluoreszenzgefärbten iHCEC- und pHCEC-BAK-exponierten Zellen zeigte den Zelltod bei 0,005% BAK-Exposition, obwohl der Grad der Ethidiumfärbung bei den iHCECs größer war als bei pHCECs. Unter Verwendung mehrerer Methoden zur Beurteilung toxischer Wirkungen mittels Mikroskopie, Bewertung der Stoffwechselaktivität und Zytokinproduktion konnte die Toxizität von UV-Strahlung und chemischen Toxinen sowohl für primäre als auch für immortalisierte Zelllinien bestimmt werden.
Introduction
In-vitro-toxikologische Studien werden durchgeführt, um die toxischen Wirkungen von Chemikalien und anderen Wirkstoffen vorherzusagen, die Zellen schädigen können. Bei der Bewertung der Toxizität für die Hornhaut wurden humane Hornhautepithelzellen (HCECs) in Modellen zur Bewertung dieser Effekte verwendet 1,2,3,4. Diese Modelle bewerten in der Regel physiologische Effekte wie Veränderungen der Stoffwechselaktivität der Zelle, Zellproliferation und andere Zellfunktionen wie die Produktion und Freisetzung von entzündlichen Zytokinen. Für diese toxikologischen Studien wurden Zellen aus verschiedenen Quellen ausgewählt, um die schädlichen Auswirkungen von Chemikalien und UV-Strahlung auf HCECs zu bewerten 2,3. pHCEC-Linien sind von Unternehmen erhältlich, die diese Zellen aus Spendergewebe von Erwachsenen liefern. Primärzellen können mit Dispase behandelt und für die Kultur schonend von der Hornhaut abgekratzt werden5. Die Zellen werden dann auf Viren und Verunreinigungen getestet und dann kryokonserviert in 10% Dimethylsulfoxid verschickt.
Der Vorteil von primären Zelllinien besteht darin, dass die Zellen genetisch identisch mit den Zellen des Spenders sind. Dies ist ideal, da ein In-vitro-Modell das In-vivo-Gewebe so weit wie möglich nachahmen sollte. Der Nachteil von primären Zelllinien besteht darin, dass sie eine begrenzte Anzahl von Zellteilungen oder -passagenaufweisen 6. Die begrenzte Anzahl der verfügbaren Zellen schränkt die Anzahl der Experimente ein, die mit einer einzigen Primärkultur durchgeführt werden können, was die Kosten der Experimente erhöht.
Immortalisierte Zelllinien wurden auch in Toxizitätsmodellen für Zellkulturen verwendet. Im Gegensatz zur primären Zelllinie, die aus In-vivo-Gewebe gewonnen wird, wurde die immortalisierte Zelllinie jedoch genetisch verändert. Immortalisierte Zellen entstehen, indem die Gene eines Virus in die DNA von Primärzellen eingebautwerden 6,7,8. Zellen mit erfolgreicher viraler Geninkorporation werden für die immortalisierte Zelllinie ausgewählt. Der Vorteil der Immortalisierung besteht darin, dass sie eine unbegrenzte schnelle Proliferation ermöglicht und eine unbegrenzte Anzahl von Zellen zur Verfügung stellt, um mehrere Experimente mit derselben Zelllinie durchzuführen. Dies ermöglicht Konsistenz zwischen den Experimenten und senkt die Kosten.
Zusätzlich zu den Veränderungen in den Genen, die die Zellproliferation einschränken, können auch Veränderungen in der Expression von Genen mit kritischer Funktionalität auftreten9. Der Nachteil der Verwendung von immortalisierten Zellen besteht daher darin, dass sie in Bezug auf ihre Reaktion auf verschiedene äußere Reize möglicherweise nicht mehr die ursprünglichen In-vivo-Zellen darstellen10. Bei den Vergleichen wurden die toxischen Wirkungen von Chemikalien auf primäre und immortalisierte menschliche Hornhautkeratozyten11 sowie auf immortalisierte HCECs und Kaninchen-Hornhautepithel-Primärzellen12 beobachtet. Der Vergleich zwischen den Effekten von Toxinen auf primäre humane Keratozyten und immortalisierte Keratozyten zeigte keine signifikanten Unterschiede11. Mit den in diesem Artikel beschriebenen Methoden wird die Wirksamkeit dieser Assays zur Beurteilung der Toxizität von UV-Strahlung und Augentoxinen auf pHCECs und iHCECs bestimmt.
Es wurden drei okuläre Toxine ausgewählt, die üblicherweise in In-vitro-Assays verwendet werden: BAK,H2O2und SDS. BAK ist ein kationisches Konservierungsmittel, das häufig in ophthalmologischen Lösungen verwendet wird 13,14,H2O2wird häufig zur Desinfektion von Kontaktlinsen 15 verwendet, und SDS ist ein anionisches Tensid, das in Waschmitteln und Shampoos 14 vorkommt. Ähnlich wie Augentoxine kann auch UV-Strahlung HCECs erheblich schädigen3. Darüber hinaus kann eine übermäßige UV-Strahlung eine Augenerkrankung verursachen, die als Photokeratitis bekannt ist und durch Symptome wie Tränenfluss, Lichtempfindlichkeit und ein Gefühl der Körnigkeit gekennzeichnet ist16.
Es gibt eine unbegrenzte Anzahl von primären Zellkulturen, die verwendet werden können, und verschiedene immortalisierte Zelllinien, die entwickelt wurden. Daher wurde eine Untersuchung durchgeführt, um primäre HCECs mit einer immortalisierten HCEC-Linie zu vergleichen, um Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen Modellen zu ermitteln, die diese Zelltypen enthalten.
Diese Untersuchung nutzte die Mikroskopie, um mögliche Unterschiede zwischen pHCECs und iHCECs in Bezug auf die physiologische Reaktion der Zellen auf UV-Strahlung und Toxine zu bewerten. Die Auswirkungen von UV-Strahlung und Chemikalien auf die Zellstoffwechselaktivität und die inflammatorische Zytokinfreisetzung für die beiden Zelllinien wurden ebenfalls untersucht. Die Bedeutung der Bestimmung der Unterschiede zwischen den beiden Zelllinien besteht darin, die optimale Verwendung dieser Zelllinien für die Bewertung zu verstehen: 1) die Wirkung von UV-Strahlung auf Zellen, 2) die Auswirkungen von Toxinen auf Zellen und 3) die daraus resultierenden Veränderungen des Stoffwechsels, der Zelllebensfähigkeit und der Zellzytokinfreisetzung für zukünftige Studien.
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Protocol
1. Kultivierung von pHCECs und iHCECs
- Züchten Sie die pHCECs und iHCECs in humanem okulärem Epithelmedium (HOEM) mit den folgenden Nahrungsergänzungsmitteln: 6 mM L-Glutamin, 0,002 % Zellmedienergänzung O (Materialtabelle), 1,0 μM Epinephrin, 0,4 % Zellmedienergänzung P (Materialtabelle), 5 μg/ml rh Insulin, 5 μg/ml Apotransferrin und 100 ng/ml Hydrocortisonhemisuccinat in Kollagen-1-beschichteten Kulturflaschen (18 ml in einem 75 cm2 Kulturkolben).
- Wechseln Sie das Medium in den Kolben alle 2-3 Tage, indem Sie das Medium entfernen, nachdem die Zellen auf ~80% Konfluenz gewachsen sind. Dissoziationslösung ohne Phenolrot zugeben und den Kolben bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen vollständig gelöst haben. Neutralisieren Sie die Dissoziationslösung mit DMEM/F12 mit Serum und zentrifugieren Sie die Zellen anschließend bei 500 × g. Entfernen Sie das überstehende Medium und resuspendieren Sie die Zellen in HOEM-Medium.
2. Bestimmung der Zellgröße mittels konfokaler Mikroskopie
- Säen Sie sowohl pHCECs als auch iHCECs auf kollagenbeschichtete Petrischalen mit Glasbodendeckgläsern in einer Konzentration von 1 × 105 mit 1 ml HOEM. Kultivieren Sie pHCECs und iHCECs, einen Satz Kulturen für 24 Stunden und einen anderen Satz Kulturen für 48 Stunden, in einem Inkubator bei 37 °C mit 5% CO2.
- Nach der Inkubationszeit werden die Zellen mit 500 μl Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein (4 μM), Ethidiumhomodimer-1 (8 μM) und Annexin V (5 μl in 500 μl Puffer-Alexa Fluor 647-Konjugat) enthält, für 20 min bei 37 °C gefärbt. Nach der Färbung der Zellen ist das Mikroskop so einzustellen, dass es die Anregungs-/Emissionswellenlängen von 488/515 nm für Calcein-AM, 543/600 nm für Ethidiumhomodimer-1 und 633/665 nm für Annexin V mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop erfasst.
- Erhalten Sie die Bilder und nehmen Sie Z-Stapel auf, um die Zellgröße in drei Dimensionen zu bestimmen.
- Um die zweidimensionalen (2D) und dreidimensionalen (3D) Bilder aufzunehmen, suchen Sie den abzubildenden Bereich mit einem apochromatischen 40x/1,2-Wasserobjektiv. Scannen Sie mit den Lasern Argon (488) (erster Scan), HeNe1 (543) (zweiter Scan) und HeNe2 (633) (dritter Scan) in drei separaten Kanälen mit den Strahlteilern HFT 488/543/633, NFT 635 Vis und NFT 545 LP560, LP505.
- Verwenden Sie mehrspuriges sequenzielles Scannen, um Übersprechen zu reduzieren.
HINWEIS: LP505 wird für Kanal 2 mit dem 488-Laser verwendet, um die Emission des Calcine-Farbstoffs zu erfassen. LP560 wird in Kanal 3 mit dem Laser 543 verwendet, um die Emission des Ethidium-Homodimers 1 zu erfassen. NFT 635 wird mit dem Laser 633 verwendet, um die Emission des Annexins V zu erfassen. Der Zweck des HFT ist es, das Anregungs- und Emissionslicht zu trennen. NFT spaltet Licht, indem es Licht < bestimmten Wellenlänge in einen separaten Kanal reflektiert, während Licht > einer bestimmten Wellenlänge zu einem zweiten Kanal durchgelassen wird. LP-Filter blockieren kürzere Wellenlängen als die angegebene Wellenlänge und lassen die längeren Wellenlängen durch. - Um in 3D zu fotografieren, stellen Sie den Konfokal auf Z-Stapel ein und scannen Sie mindestens 20 Bilder.
3. Exposition der Zellen gegenüber UV-Strahlung
- Die Zellen werden mit 5 × 104/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte ausgesät und bei 37 °C mit 5 % CO2 für 3 h inkubiert. Nach der Inkubationszeit ist das Volumen des Mediums in den Vertiefungen auf 300 μl zu reduzieren. Als nächstes werden die Zellen in einem 37 °C-Inkubator in separaten Experimenten 5 und 20 Minuten lang UV-Strahlung ausgesetzt (sowohl UVA bei 6,48 W/m2 als auch UVB bei 1,82 W/m2, da sowohl UVA- als auch UVB-Röhren gleichzeitig im Inkubator eingeschaltet sind).
- Nach der UV-Bestrahlung werden 200 μl frisches HOEM in jede Vertiefung gegeben und 20 h bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert.
- Nach der Inkubation wird der Zellüberstand in jeder Vertiefung gesammelt und in sterile 2-ml-Polypropylenröhrchen überführt. Bei -80 °C einfrieren. Um die Zytokinspiegel zu bestimmen, die von den pHCECs und iHCECs nach UV-Exposition freigesetzt werden, verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Kits zur Quantifizierung der folgenden vier Zytokine: IL-6, IL-8, IL-1β und TNF-α.
- Fügen Sie den Zellen in den Vertiefungen ein metabolisches Assay-Reagenz hinzu.
- Bereiten Sie ein 10%iges metabolisches Assay-Reagenz in DMEM/F12 vor. Ersetzen Sie das Nährmedium in jeder Vertiefung durch 1 ml der 10%igen metabolischen Assay-Lösung und inkubieren Sie es bei 37 °C mit 5 % CO2 für 4 h.
- Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 530/590 nm.
4. Exposition der Zellen gegenüber chemischen Toxinen
- Die Keimzellen werden mit 5 × 104/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte gegeben und bei 37 °C mit 5 % CO2 3 h lang inkubiert. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit das Medium und setzen Sie die Zellen 5 und 15 Minuten lang 1 ml chemischen Toxinen (BAK 0,001 %, H2O2 0,01 % und SDS 0,0025 % in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)) aus.
- Entfernen Sie nach dem Kontakt mit den chemischen Toxinen die Toxine aus den Vertiefungen, spülen Sie sie mit 1 ml PBS und geben Sie 1 ml HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 h Inkubation wird ein metabolischer Assay durchgeführt, indem das Medium durch 1 ml einer 10%igen metabolischen Assay-Lösung ersetzt und 4 h lang bei 37 °C mit 5 % CO2 inkubiert wird. Messen Sie die Fluoreszenz mit einem Fluoreszenz-Multiwell-Plattenlesegerät bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 530/590 nm.
- Die Zellüberstände werden nach der 20-stündigen Inkubation aus den Vertiefungen in separate sterile 2-ml-Polypropylenröhrchen überführt und bei -80 °C eingefroren. Quantifizierung der Zytokine, die von den pHCECs und iHCECs nach Exposition gegenüber den Chemikalien freigesetzt werden. Verwenden Sie die gleiche Multiplex-Plattform, die auch zur Beurteilung der Zytokine der UV-behandelten Zellen verwendet wird. Verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay gemäß den Anweisungen des Kits, um die folgenden vier Zytokine zu quantifizieren: IL-6, IL-8, IL-1β und TNF-α.
5. Untersuchung von Zellen, die verschiedenen Konzentrationen von BAK ausgesetzt waren
- Die Keimzellen werden mit 1 × 10 5/ml HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte gegeben und bei 37 °C mit5 % CO2 für 24 h inkubiert. Entfernen Sie nach der Inkubationszeit das Medium und setzen Sie die Zellen 5 Minuten lang 1 ml chemischen Toxinen (BAK 0,001 %, BAK 0,005 % und BAK 0,01 % in PBS) aus.
- Entfernen Sie nach der Exposition die chemischen Toxine, spülen Sie die Vertiefungen mit 1 ml PBS aus und geben Sie 1 ml HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 h Inkubation werden die Zellen mit 500 μl Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein (4 μM), Ethidiumhomodimer-1 (8 μM) und Annexin V (5 μL in 500 μL Puffer-Alexa Fluor 647-Konjugat) enthält, für 20 min bei 37 °C gefärbt. Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass die Intensitäten der Annexin-V-, Calcinein-AM- und Ethidium-1-Färbung bei Anregungs-/Emissionswellenlängen von 630/675 nm, 495/515 nm bzw. 528/617 nm gemessen werden. Bildgebung der Zellen mit dem Fluoreszenzmikroskop
6. Datenanalyse
- Führen Sie einen Normalitätstest und einen Test auf gleiche Varianzen durch, bevor Sie eine Varianzanalyse (ANOVA), eine Welch-ANOVA oder einen Kruskal-Wallis-Test durchführen. Verwenden Sie den entsprechenden Post-hoc-Test , um jede getestete Gruppe zu vergleichen. Legen Sie p < 0,05 fest.
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Representative Results
Zellengröße
Die primären und immortalisierten HCECs wurden mit drei Fluoreszenzfarbstoffen visualisiert, die drei verschiedene Stadien der Zellviabilität widerspiegeln. Lebende Zellen sind grün (Calcein-AM), tote Zellen rot (Ethidium-Homodimer-1) und apoptotische Zellen gelb (Annexin-V-Computer-angepasste Farbe zur besseren Visualisierung des Fluoreszenzsignals). Lebende Zellen enthalten Esterasen im Zellzytoplasma und wandeln Calcein-AM in Calcein um. Tote Zellen haben Zellmembranen, die für Ethidiumhomodimer-1 durchlässig sind. Apoptotische Zellen haben eine Färbung an der Zellmembran, da Phosphatidylserin in die äußere Membran transloziert wird.
Ein Vergleich der Zellgröße für die beiden Arten von HCECs nach 24 und 48 h Wachstum wurde mittels konfokaler Mikroskopie durchgeführt, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die iHCECs (Abbildung 1A) sind kleinere Zellen im Bereich von 10 μm bis 20 μm, und die pHCECs (Abbildung 1B) haben eine Größe von 20 μm bis 50 μm nach 24 h Wachstum. Ähnliche Unterschiede im Größenbereich wurden für iHCECs (Abbildung 1C) und pHCECs (Abbildung 1D) nach 48 h Wachstum beobachtet. 3D-Bilder der beiden HCEC-Typen wurden mittels konfokaler Mikroskopie angefertigt (Abbildung 2A zeigt pHCECs; Abbildung 2B zeigt iHCECs).
Abbildung 1: Vergleich der Zellgröße mittels konfokaler Mikroskopie . iHCECs nach 24 (A) und 48 (C) h Wachstum mit Zellen mit einer Größe von 10 bis 20 μm. pHCECs nach 24 (B) und 48 (D) h Wachstum mit Zellen mit einer Größe von 20 bis 50 μm. 40x Wasserobjektiv. Maßstabsbalken = 10 und 20 μm (A); 25 und 50 μm (B); 10 und 20 μm (C); 50 μm (D). Abkürzungen: iHCECs = immortalisierte humane Hornhautepithelzellen; pHCECs = primäre humane Hornhautepithelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Konfokale 3D-Bilder. Konfokale 3D-Bilder von pHCECs nach 48 h Wachstum (A) und iHCECs nach 24 h (B). 40-faches Wasserobjektiv. Abkürzungen: iHCECs = immortalisierte humane Hornhautepithelzellen; pHCECs = primäre humane Hornhautepithelzellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Wirkung von UV-Strahlung auf primäre und immortalisierte HCECs
Die metabolische Aktivität sowohl von primären als auch von immortalisierten HCECs nach UV-Exposition ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Abbildung zeigt normierte Mittelwerte aus Testbohrungen (vierfache Vertiefungen, zwei getrennte Experimente). Im Vergleich zu den nicht UV-exponierten Zellen war die Stoffwechselaktivität der bestrahlten pHCECs nach 20 min Exposition signifikant reduziert. Bei iHCECs nahm die metabolische Aktivität für Zellen, die sowohl nach 5 als auch nach 20 min bestrahlt wurden, ab. Daher dauerte es eine längere Expositionszeit, um die metabolische Aktivität der pHCECs zu reduzieren als die der iHCECs.
Abbildung 3: Die metabolische Aktivität von pHCECs und iHCECs nach Exposition bei 5 und 20 min UV-Strahlung ( *p < 0,05 der nicht UV-exponierten Kontrolle. Bei der nicht UV-exponierten Kontrolle handelt es sich um Zellen in Vertiefungen, die mit den Testproben inkubiert, aber nicht UV-exponiert sind. Die Y-Achse ist prozentual relativ zur Stoffwechselaktivität der Zellen, die nicht der UV-Strahlung ausgesetzt sind. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Abkürzungen: iHCECs = immortalisierte humane Hornhautepithelzellen; pHCECs = primäre humane Hornhautepithelzellen; UV = ultraviolett. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Wirkung der UV-Exposition auf die Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen aus den HCECs ist in Abbildung 4 dargestellt. Die maximale Zytokinfreisetzung erfolgte zu unterschiedlichen Zeitpunkten der UV-Exposition für die primären und immortalisierten HCECs. Die maximale Zytokinfreisetzung durch die iHCECs lag bei 5 min UV-Belichtung. Die Zellen setzten signifikante Mengen (p < 0,05) von IL-1β, IL-6 und IL-8 im Vergleich zu den nicht UV-exponierten Zellen frei. Darüber hinaus kam es bei 20 min UV-Exposition für die iHCECs zu keiner signifikanten Zytokinfreisetzung. Die maximale Zytokinfreisetzung für pHCECs erfolgte jedoch bei 20 min UV-Exposition. Alle vier Zytokine (IL-1β, IL-6, IL-8 und TNF-α) wurden im Vergleich zu den nicht UV-exponierten Zellen signifikant freigesetzt. In Bezug auf die Gesamtmenge der freigesetzten inflammatorischen Zytokine (pg/ml) setzten die pHCECs wesentlich mehr IL-1β-, IL-8- und TNF-α frei als die iHCECs, während die iHCECs mehr IL-6 freisetzten.
Abbildung 4: Zytokinfreisetzung durch die pHCECs und iHCECs nach Exposition mit UV-Strahlung in pg/ml. Die vier quantifizierten proinflammatorischen Zytokine sind IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) und TNF-α (D). *p < 0,05 der nicht UV-exponierten Kontrolle. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Abkürzungen: iHCECs = immortalisierte humane Hornhautepithelzellen; pHCECs = primäre humane Hornhautepithelzellen; UV = ultraviolett; IL = Interleukin; TNF-α = Tumornekrosefaktor alpha. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Auswirkungen chemischer Toxine auf primäre und immortalisierte HCECs
Die prozentuale Verringerung der Stoffwechselaktivität nach Exposition gegenüber den drei okulären Toxinen war zwischen den pHCECs und den iHCECs ähnlich, wie in Abbildung 5 dargestellt. Die Abbildung zeigt normierte Mittelwerte aus Testbohrungen (vierfache Vertiefungen, zwei getrennte Experimente).
Abbildung 5: Die metabolische Aktivität von pHCECs und iHCECs nach Exposition bei drei okulären Toxinen für 5 und 15 min. *p < 0,05 der Kontrolle. Die nicht-toxinexponierte Kontrolle sind Zellen in Vertiefungen, die mit den Testproben inkubiert, aber nicht chemischen Toxinen ausgesetzt sind. Die Y-Achse ist prozentual relativ zur Stoffwechselaktivität der Zellen, die keinen chemischen Toxinen ausgesetzt sind. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Abkürzungen: iHCECs = immortalisierte humane Hornhautepithelzellen; pHCECs = primäre humane Hornhautepithelzellen; BAK = Benzalkoniumchlorid; H2O2= Wasserstoffperoxid; SDS = Natriumdodecylsulfat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Die Mengen an Zytokinen, die von den pHCECs freigesetzt wurden, waren größer als die Mengen, die von den iHCECs freigesetzt wurden. Die Freisetzung des Zytokins IL-6 wurde am stärksten durch die Exposition gegenüber den drei Chemikalien beeinflusst (BAK 0,001 %, H2O20,01 %, SDS 0,0025 %, Abbildung 6). Die Abbildung zeigt Mittelwerte (pg/ml) aus Testvertiefungen (vierfache Vertiefungen, zwei getrennte Experimente). Sowohl pHCECs als auch iHCECs zeigten eine Veränderung in der Freisetzung von IL-6 nach Exposition gegenüber allen drei Chemikalien. BAK verursachte eine Abnahme der Freisetzung von IL-6 im Vergleich zur Kontrollgruppe sowohl für primäre als auch für immortalisierte HCECs, während H2O2 eine Zunahme der Freisetzung von IL-6 aus iHCECs und eine Abnahme der Freisetzung aus pHCECs verursachte.
Abbildung 6: Freisetzung von Zytokinen. Zytokinfreisetzung durch die pHCECs und iHCECs nach Exposition bei drei okulären Toxinen für 5 und 15 min in pg/ml. Die vier quantifizierten proinflammatorischen Zytokine sind IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) und TNF-α (D). *p < 0,05 des Steuerelements. Fehlerbalken geben die Standardabweichung an. Abkürzungen: iHCECs = immortalisierte humane Hornhautepithelzellen; pHCECs = primäre humane Hornhautepithelzellen; BAK = Benzalkoniumchlorid; H2O2= Wasserstoffperoxid; SDS = Natriumdodecylsulfat; IL = Interleukin; TNF-α = Tumornekrosefaktor alpha. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von BAK auf die Lebensfähigkeit von Zellen
Die Auswirkungen der BAK-Konzentrationen 0,001 %, 0,005 % und 0,01 % für 5 min auf die iHCEC-Viabilität sind in Abbildung 7 dargestellt. BAK zeigte mit 0,001 % sowohl für pHCECs als auch für iHCECs nur einen geringen Effekt. Sowohl die pHCECs als auch die iHCECs waren bei 0,005 % und 0,01 % des BAK signifikant geschädigt. Mit 0,005 % und 0,01 % des BAK war der Grad der Ethidiumfärbung bei iHCECs größer als bei pHCECs. Calcein färbt grün, Ethidium färbt rot und Annexin V blau (Annexin V-Farbe computerangepasste Farbe zur besseren Visualisierung des Fluoreszenzsignals)
Abbildung 7: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von pHCECs und iHCECs, die 5 min lang unterschiedlichen Konzentrationen von BAK ausgesetzt waren. Maßstabsbalken = 200 μm; 10-faches Objektiv. Abkürzungen: iHCECs = immortalisierte humane Hornhautepithelzellen; pHCECs = primäre humane Hornhautepithelzellen; BAK = Benzalkoniumchlorid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Mögliche Unterschiede in der Verwendung von zwei Arten von HCECs wurden bewertet. Die Zellen wurden in das gleiche Medium (HOEM) mit identischen Zellkonzentrationen eingebracht und dann kurzen und langen Perioden von UV-Strahlung und drei Augentoxinen ausgesetzt. Die Dosen von UV-Strahlung und Chemikalien wurden auf der Grundlage ihrer physiologischen Wirkungen ausgewählt, die für die Zellen schädlich genug waren, um Zwischenreaktionen hervorzurufen, die verglichen werden konnten. Expositionszeiten von 5 und 20 min für UV-Strahlung und 5 und 15 min für die ausgewählten Dosen von BAK (0,001 %), SDS (0,0025 %) und H2O2(0,01 %) waren ideale Expositionszeiten und -konzentrationen, die signifikant unterschiedliche Reaktionen zwischen den Zellen und den unbehandelten Kontrollen zeigten.
HOEM ist ein serumfreies Medium, das für die Kultivierung von HCECs optimiert ist. HOEM unterstützt das Wachstum sowohl von primären als auch von immortalisierten Zellen. Die in dieser Untersuchung verwendete immortalisierte Zelllinie wurde mit SV408 immortalisiert. SV40-immortalisierte Zellen exprimieren Onkogenproteine, die die Progression des Zellzyklus fördern können, indem sie Rb, p53 und pp2a interferieren17. Das Retinoblastom (Rb) bindet an E2F-Transkriptionsfaktoren und hemmt diese, die, wenn sie nicht gehemmt werden, es einer Zelle ermöglichen, im Zellzyklus fortzuschreiten und sich zu teilen18. Das Molekül p53 bindet auch an Transkriptionsfaktoren, um den Verlauf des Zellzykluszu kontrollieren 19. Die Hemmung eines dritten Moleküls, pp2a 20,21, fördert ebenfalls die Zellproliferation22. Die Expression von SV40-Onkogenproteinen, die Rb, p53 und pp2a17 hemmen, könnte zu den Unterschieden in der Reaktion von iHCECs und pHCECs beitragen. Die Zellgrößen der beiden Arten von HCECs waren ebenfalls unterschiedlich, was möglicherweise auf diese onkogenhemmenden Proteine zurückzuführen ist, da die immortalisierten Zellen durch diese Moleküle gezwungen werden, sich zu teilen, bevor die Zellen die Größe der primären Zellen erreichen.
Die UV-Strahlung der Hornhaut kann die Epithelzellen der Hornhaut stark schädigen. UV-Strahlung kann reaktive Sauerstoffspezies in der Zelle erzeugen, DNA und Zellmoleküle schädigen und Enzymprozesse stören23,24. UVB schädigt direkt die DNA, und UVA schädigt DNA und andere zelluläre Moleküle durch die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies in der Zelle, die dann mit anderen Biomolekülen reagieren können25,26. Diese UV-Schäden können aufgrund der Freisetzung von entzündlichen Zytokinen aus den exponierten Zellen zu Zytotoxizität und Entzündungen führen 3,27. In dieser Studie reagierten die immortalisierten Zellen empfindlicher auf die Auswirkungen der UV-Strahlung auf die Stoffwechselaktivität der Zellen, da die Stoffwechselaktivität der immortalisierten Zellen, aber nicht der primären Zelllinie nach 5 Minuten abnahm. Unterschiede in der Freisetzung von inflammatorischen Zytokinen traten auch zwischen den pHCECs und den iHCECs auf. pHCECs setzten nach 20 min UV-Strahlung mehr IL-1β, IL-8 und TNF-α frei als iHCECs. Diese Unterschiede in der Zytokinfreisetzung könnten mit den Unterschieden zwischen der Zellgröße von primären und immortalisierten Zellkulturen zusammenhängen. In einer anderen Studie, in der die Auswirkungen von Zigarettenrauch auf primäre und immortalisierte Zelllinien untersucht wurden, wurden unterschiedliche Effekte bei der Zytokinfreisetzung zwischen primären und immortalisierten Zellen festgestellt28.
Um das Potenzial chemischer Toxine, Augenreizungen zu verursachen, zu modellieren, wurden verschiedene Zellkulturmodelle entwickelt, um die Zytotoxizität dieser Chemikalien zu bewerten. Diese Studie zeigte, dass Augentoxine, die eine mittlere Wirkung auf HCECs haben, sowohl für primäre als auch für immortalisierte HCECs ungefähr die gleiche prozentuale Abnahme der Stoffwechselaktivität aufweisen. Die drei okulären Toxine verursachten im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe keine nennenswerte Freisetzung der meisten inflammatorischen Zytokine. Diese Arbeit zeigt jedoch die Sensitivität dieser Methode bei der Bestimmung von Zytokinspiegeln zu Beginn der Linie. Eine andere Methode zum Nachweis von Zytokinen aus immortalisierten Zelllinien wurde evaluiert und es wurde festgestellt, dass sie nicht in der Lage war, die Zytokinspiegel zu Beginn der Zytokinlinie zu bestimmen29. Die mikroskopischen Aufnahmen von BAK-exponierten Kulturen zeigten eine Toxizität sowohl in pHCECs als auch in iHCECs bei den Konzentrationen von 0,005 % und 0,01 % nach 5-minütiger Exposition und 20-stündiger Erholung.
Die entscheidenden Schritte in diesem Protokoll waren die Auswahl von UV-Dosen und Augentoxindosen, die zu einer mittleren Toxizität für die Zellen führten, und die Sicherstellung, dass jede Art von HCECs im selben Medium wuchs. Dies ermöglichte Vergleiche zwischen den Auswirkungen der einzelnen Behandlungen auf die pHCECs und iHCECs. Modifikationen dieser Methode können in der Zeit der Exposition gegenüber den toxischen Stoffen vorgenommen werden. Es wird jedoch empfohlen, die Expositionszeit nahe an den in diesem Protokoll getesteten Zeiten beizubehalten, da kürzere Zeitpunkte möglicherweise keine Toxizität auf den Zellen zeigen. Im Gegensatz dazu kann eine zu lange Exposition zu großen Schäden verursachen, so dass geringfügige Unterschiede in der Toxizität von Augentoxinen nicht mit den schädigenden Wirkungen der in diesem Protokoll beschriebenen Prüfmittel verglichen werden können.
Einer der Vorteile der immortalisierten HCECs gegenüber den primären HCECs besteht darin, dass die immortalisierten Zellen geringere Standardabweichungen als die primären Zellen in Bezug auf Stoffwechselaktivität und Zytokinfreisetzung nach Exposition gegenüber okulären Toxinen aufwiesen. Für die Beurteilung der Stoffwechselaktivität und der Zytokinfreisetzung nach Exposition ist es daher wahrscheinlicher, dass die immortalisierten Zellen eine physiologische Toxizität nachweisen als die Primärzellen. Sowohl die Primärzellen als auch die immortalisierte Zelllinie zeigten signifikante Effekte auf die Stoffwechselaktivität und die Zytokinfreisetzung nach UV-Exposition, und beide wiesen die Toxizität von BAK nach Färbung der Zellen mit Fluoreszenzfarbstoffen nach.
Zusätzlich zu den in dieser Untersuchung erwähnten Toxizitätsendpunkten konnten weitere Endpunkte getestet werden, darunter Auswirkungen auf Tight Junctions, Zellproliferation, Zellmigration und die Freisetzung zusätzlicher Zytokine. In diesem Protokoll wurden die Auswirkungen von toxischen Wirkstoffen auf die Freisetzung von vier entzündlichen Zytokinen, die metabolische Aktivität und die Zellviabilität anhand von Messungen der Zellpermeabilität, Esteraseaktivität und Apoptose bewertet. Darüber hinaus sollten In-viv-o-Tests, wie z. B. Tests auf Augenreizungen bei Kaninchen, in eine Toxizitätstestbatterie aufgenommen werden, da In-vitro-Toxizitätstestsgeeignet sind, um den Wirkmechanismus der Toxizität auf HCEC zu bewerten. In-vivo-Tests an Tieren sind erforderlich, um festzustellen, ob andere Immun- und Toxizitätsmechanismen existieren, die in vitro nicht modelliert werden können.
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Disclosures
Der Autor, Lyndon W. Jones, hat in den letzten 3 Jahren über CORE Forschungsunterstützung oder Lehraufträge von den folgenden Unternehmen erhalten: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage und Visioneering. Lyndon Jones ist außerdem Berater und/oder Mitglied eines Beirats für Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis und Ophtecs. Die anderen Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren erhielten für diese Arbeit keine Förderung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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