Summary
Denna artikel beskriver de förfaranden som används för att utvärdera toxiciteten hos UV-strålning och kemiska toxiner på en primär och odödliggjord cellinje.
Abstract
Denna artikel beskriver metoderna för att mäta toxiciteten hos ultraviolett (UV) strålning och okulära toxiner på primära (pHCEC) och odödliggjorda (iHCEC) humana hornhinneepitelcellkulturer. Cellerna utsattes för UV-strålning och toxiska doser av bensalkoniumklorid (BAK), väteperoxid (H2O2) och natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolisk aktivitet mättes med hjälp av en metabolisk analys. Frisättningen av inflammatoriska cytokiner mättes med användning av en multiplex interleukin (IL) -1β, IL-6, IL-8 och tumörnekrosfaktor-alfa (TNF-α) analys, och celler utvärderades för livskraft med användning av fluorescerande färgämnen.
De skadliga effekterna av UV på cellmetabolisk aktivitet och cytokinfrisättning inträffade vid 5 minuters UV-exponering för iHCEC och 20 min för pHCEC. Liknande procentuella minskningar av metabolisk aktivitet hos iHCEC och pHCEC inträffade efter exponering för BAK,H2O2eller SDS, och de mest signifikanta förändringarna i cytokinfrisättning inträffade för IL-6 och IL-8. Mikroskopi av fluorescerande färgade iHCEC- och pHCEC BAK-exponerade celler visade celldöd vid 0,005% BAK-exponering, även om graden av etidiumfärgning var större i iHCECs än pHCEC. Genom att använda flera metoder för att bedöma toxiska effekter med hjälp av mikroskopi, bedömningar av metabolisk aktivitet och cytokinproduktion kunde toxiciteten hos UV-strålning och kemiska toxiner bestämmas för både primära och odödliga cellinjer.
Introduction
In vitro toxikologiska studier utförs för att förutsäga de toxiska effekterna av kemikalier och andra medel som kan orsaka skador på celler. Vid bedömning av toxicitet för hornhinnan har humana hornhinneepitelceller (HCEC) använts i modeller för utvärdering av dessa effekter 1,2,3,4. Dessa modeller utvärderar typiskt fysiologiska effekter såsom förändringar i cellens metaboliska aktivitet, cellproliferation och andra cellfunktioner såsom produktion och frisättning av inflammatoriska cytokiner. För dessa toxikologiska studier har celler från olika källor valts ut för att bedöma de skadliga effekterna av kemikalier och UV-strålning på HCECs 2,3. pHCEC-linjer är tillgängliga från företag som tillhandahåller dessa celler från donatorvävnader hos vuxna. Primära celler kan behandlas med dispase och försiktigt skrapas av hornhinnan för odling5. Cellerna testas sedan för virus och kontaminering och skickas sedan kryokonserverade i 10% dimetylsulfoxid.
Fördelen med primära cellinjer är att cellerna är genetiskt identiska med donatorns celler. Detta är idealiskt, eftersom en in vitro-modell bör efterlikna in vivo-vävnaden så mycket som möjligt. Nackdelen med primära cellinjer är att de har ett begränsat antal celldelningar eller passager6. Det begränsade antalet tillgängliga celler begränsar antalet experiment som kan utföras med en enda primärkultur, vilket ökar kostnaden för experimenten.
Odödliga cellinjer har också använts i cellodlingstoxicitetsmodeller. Men till skillnad från den primära cellinjen erhållen från in vivo-vävnad har den odödliga cellinjen förändrats genetiskt. Odödliga celler skapas genom att införliva generna av ett virus i DNA av primära celler 6,7,8. Celler med framgångsrik viral geninkorporering väljs ut för den odödliga cellinjen. Fördelen med odödliggörande är att det möjliggör obestämd snabb spridning, vilket ger ett obegränsat antal celler att utföra flera experiment med samma cellinje. Detta möjliggör konsekvens mellan experiment och minskar kostnaden.
Förutom förändringar i generna som begränsade cellproliferation kan förändringar i uttrycket av gener med kritisk funktionalitet också inträffa9. Därför är nackdelen med att använda odödliga celler att de kanske inte längre representerar de ursprungliga in vivo-cellerna när det gäller deras svar på olika yttre stimuli10. Jämförelser har involverat observation av de toxiska effekterna av kemikalier på primära och odödliga humana hornhinnekeratocyter11, liksom odödliga HCECs och kaninhornhinnans epiteliala primära celler12. Jämförelsen mellan effekterna av toxiner på primära humana keratocyter och odödliga keratocyter visade inga signifikanta skillnader11. Med hjälp av de metoder som beskrivs i denna artikel kommer effektiviteten av dessa analyser för att bedöma toxiciteten hos UV-strålning och okulära toxiner på pHCECs och iHCECs att bestämmas.
Tre okulära toxiner som vanligen används i in vitro-analyser valdes: BAK,H2O2och SDS. BAK är ett katjoniskt konserveringsmedel som vanligtvis används i oftalmiska lösningar 13,14, H2O2används vanligtvis för att desinficera kontaktlinser 15 och SDS är ett anjoniskt ytaktivt medel som finns i tvättmedel och schampon 14. I likhet med ögontoxiner kan UV-strålning också orsaka betydande skador på HCECs3. Dessutom kan överexponering för UV orsaka ett okulärt tillstånd som kallas fotokeratit som kännetecknas av symtom på rivning, ljuskänslighet och en känsla av grusighet16.
Det finns ett obegränsat antal primära cellkulturer som kan användas och olika odödliga cellinjer som har utvecklats. Därför genomfördes en undersökning för att jämföra primära HCECs med en odödlig HCEC-linje för att bestämma likheter och skillnader mellan modeller som innehåller dessa typer av celler.
Denna undersökning använde mikroskopi för att bedöma möjliga skillnader mellan pHCECs och iHCECs på cellfysiologiskt svar på UV och toxiner. Effekterna av UV-strålning och kemikalier på cellmetabolisk aktivitet och inflammatorisk cytokinfrisättning för de två cellinjerna utvärderades också. Vikten av att bestämma skillnaderna mellan de två cellinjerna är att förstå den optimala användningen av dessa cellinjer för att utvärdera: 1) effekten av UV-strålning på celler, 2) effekterna av toxiner på celler och 3) de resulterande förändringarna i metabolism, cellviabilitet och cellcytokinfrisättning för framtida studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Odling av pHCEC och iHCEC
- Odla pHCECs och iHCECs i humant okulärt epitelmedium (HOEM) med följande tillskott: 6 mM L-glutamin, 0,002% cellmediatillskott O (Materialförteckning), 1,0 μM epinefrin, 0,4% cellmediatillskott P (Materialförteckning), 5 μg / ml rh insulin, 5 μg / ml apo-transferrin och 100 ng / ml hydrokortisonhemisuccinat i kollagen-1-belagda odlingskolvar (18 ml i en 75 cm2 kulturkolv).
- Byt medium i kolvarna var 2-3: e dag genom att ta bort mediet efter att cellerna växer till ~ 80% sammanflöde. Tillsätt dissociationslösning utan fenolrött och inkubera kolven vid 37 °C tills cellerna är helt löstagna. Neutralisera dissociationslösningen med DMEM/F12 med serum och centrifugera sedan cellerna vid 500 × g. Ta bort supernatantmediet och suspendera cellerna i HEM-mediet igen.
2. Bestämning av cellstorlek med hjälp av konfokalmikroskopi
- Frö både pHCECs och iHCECs på kollagenbelagda petriskålar med glasbottentäckglas i en koncentration av 1 × 105 med 1 ml HOEM. Odla pHCECs och iHCEC, en uppsättning kulturer i 24 timmar och en annan uppsättning kulturer i 48 timmar, i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
- Efter inkubationsperioden färgas cellerna med 500 μL annexinfärgningsbuffertlösning innehållande kalcein (4 μM), etidiumhomodimer-1 (8 μM) och annexin V (5 μL i 500 μL buffert-Alexa Fluor 647-konjugat) i 20 minuter vid 37 °C. Efter färgning av cellerna, justera mikroskopet för att fånga excitations-/emissionsvåglängderna 488/515 nm för calcein-AM, 543/600 nm för etidiumhomodimer-1 och 633/665 nm för annexin V med hjälp av ett konfokalt laserskanningsmikroskop.
- Hämta bilderna och ta Z-staplar för att bedöma cellstorlek i tre dimensioner.
- För att hämta tvådimensionella (2D) och tredimensionella (3D) bilder, hitta området att avbilda med ett apokromat 40x/1.2 vattenmål. Med lasrarna Argon (488) (första skanning), HeNe1 (543) (andra skanning och HeNe2 (633) (tredje skanning) skannar du i tre separata kanaler med hjälp av stråldelarna, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis och NFT 545 LP560, LP505.
- Använd sekventiell skanning med flera spår för att minska överhörningen.
LP505 används för kanal 2 med 488-lasern för att fånga upp emissionen av kalceinfärgämnet. LP560 används i kanal 3 med 543-lasern för att fånga emissionen av etidiumhomodimeren 1. NFT 635 används med 633-lasern för att fånga utsläppen från annexin V. Syftet med HFT är att separera excitations- och emissionsljuset. NFT delar upp ljus genom att reflektera ljus < angiven våglängd till en separat kanal samtidigt som ljuset > en viss våglängd till en andra kanal. LP-filter blockerar kortare våglängder än den angivna våglängden och släpper igenom de längre våglängderna. - För att avbilda i 3D, ställ in konfokalen på Z-stack och skanna minst 20 bilder.
3. Exponering av celler för UV-strålning
- Ympa cellerna vid 5 × 104/ml HOEM i varje brunn på en 24-brunns kollagen-1-belagd odlingsplatta och inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 i 3 timmar. Efter inkubationsperioden, minska volymen av mediet i brunnarna till 300 μL. Utsätt sedan cellerna för UV-strålning (både UVA vid 6,48 W/m 2 och UVB vid 1,82 W/m2 eftersom både UVA- och UVB-rör slås på i inkubatorn samtidigt) i en 37 °C inkubator i 5 och 20 minuter i separata experiment.
- Efter UV-strålningen tillsätts 200 μl färsk HOEM till varje brunn och inkuberas i 20 timmar vid 37 °C med 5 %CO2.
- Efter inkubation, samla cellsupernatanten i varje brunn och överför den till sterila 2 ml polypropenrör. Frys vid -80 °C. För att bestämma cytokinnivåerna som frigörs av pHCEC och iHCEC efter UV-exponering, använd en multiplexcytokinanalys och följ satsens instruktioner för att kvantifiera följande fyra cytokiner: IL-6, IL-8, IL-1β och TNF-α.
- Tillsätt metaboliskt analysreagens till cellerna i brunnarna.
- Bered 10% metaboliskt analysreagens i DMEM / F12. Ersätt odlingsmediet i varje brunn med 1 ml av den metaboliska analyslösningen på 10 % och inkubera vid 37 °C med 5 %CO2 i 4 timmar.
- Mät fluorescensen för varje lösning med hjälp av en fluorescerande plattläsare vid 530/590 nm excitations-/emissionsvåglängder.
4. Exponering av celler för kemiska toxiner
- Fröceller vid 5 × 104/ml HOEM i varje brunn på en 24-brunns kollagen-1-belagd odlingsplatta och inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 i 3 timmar. Efter inkubationsperioden, avlägsna mediet och exponera cellerna för 1 ml kemiska toxiner (BAK 0,001%,H2O20,01% och SDS 0,0025% i fosfatbuffrad saltlösning (PBS)) i 5 och 15 minuter.
- Efter exponering för de kemiska toxinerna, ta bort gifterna från brunnarna, skölj med 1 ml PBS och tillsätt 1 ml HOEM till varje brunn. Efter 20 timmars inkubation utförs en metabolisk analys genom att ersätta mediet med 1 ml av en 10 % metabolisk analyslösning och inkubera vid 37 °C med 5 %CO2 under 4 timmar. Mät fluorescensen med hjälp av en fluorescensplattläsare med flera brunnar vid 530/590 nm excitations-/emissionsvåglängder.
- Överför cellsupernatanterna från brunnarna efter 20 timmars inkubation till separata sterila 2 ml polypropenrör och frys vid -80 °C. Kvantifiera cytokiner som frigörs av pHCEC och iHCEC efter exponering för kemikalierna. Använd samma multiplexplattform som används för att bedöma cytokinerna från de UV-behandlade cellerna. Använd en multiplexcytokinanalys enligt satsens instruktioner för att kvantifiera följande fyra cytokiner: IL-6, IL-8, IL-1β och TNF-α.
5. Undersökning av celler som exponerats för olika koncentrationer av BAK
- Fröceller vid 1 × 10 5/ml HOEM i varje brunn på en 24-brunns kollagen-1-belagd odlingsplatta och inkubera vid 37 °C med5 %CO2 i 24 timmar. Efter inkubationsperioden, ta bort mediet och exponera cellerna för 1 ml kemiska toxiner (BAK 0,001%, BAK 0,005% och BAK 0,01% i PBS) i 5 minuter.
- Efter exponering, avlägsna de kemiska toxinerna, skölj brunnarna med 1 ml PBS och tillsätt 1 ml HOEM till varje brunn. Efter 20 timmars inkubation färgas cellerna med 500 μl annexinfärgningsbuffertlösning innehållande kalcein (4 μM), etidiumhomodimer-1 (8 μM) och annexin V (5 μl i 500 μL buffert-Alexa Fluor 647-konjugat) i 20 minuter vid 37 °C. Justera mikroskopet för att mäta intensiteten hos annexin V, kalcein AM och etidium-1-färgning vid excitations-/emissionsvåglängder på 630/675 nm, 495/515 nm respektive 528/617 nm. Avbilda cellerna med hjälp av fluorescensmikroskopet
6. Analys av data
- Utför ett normalitetstest och ett test för lika varianser innan du utför en variansanalys (ANOVA), Welch ANOVA eller Kruskal-Wallis-test. Använd lämpligt post-hoc-test för att jämföra varje testad grupp. Ställ in p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellstorlek
De primära och odödliga HCECs visualiserades med tre fluorescerande färgämnen, som återspeglar tre olika stadier av cellviabilitet. Levande celler är gröna (calcein-AM), döda celler är röda (etidium homodimer-1) och apoptotiska celler är gula (annexin V-datorjusterad färg för bättre visualisering av fluorescenssignalen). Levande celler innehåller esteraser i cellcytoplasman och omvandlar kalcein-AM till kalcein. Döda celler har cellmembran som är permeabla för etidiumhomodimer-1. Apoptotiska celler har färgning vid cellmembranet eftersom fosfatidylserin translokeras till det yttre membranet.
En jämförelse av cellstorleken för de två typerna av HCECs efter 24 och 48 timmars tillväxt gjordes med hjälp av konfokalmikroskopi, som visas i figur 1. iHCECs (figur 1A) är mindre celler som sträcker sig från 10 μm till 20 μm, och pHCECs (figur 1B) varierar i storlek från 20 μm till 50 μm efter 24 timmars tillväxt. Liknande skillnader i storleksintervall observerades för iHCECs (figur 1C) och pHCECs (Figur 1D) efter 48 timmars tillväxt. 3D-bilder av de två typerna av HCECs gjordes med konfokalmikroskopi (figur 2A visar pHCEC; Figur 2B visar iHCEC).
Figur 1: En jämförelse av cellstorlek med konfokalmikroskopi . iHCEC efter 24 (A) och 48 (C) h tillväxt med celler som varierar i storlek från 10 till 20 μm. pHCEC efter 24 (B) och 48 (D) h tillväxt med celler som varierar i storlek från 20 till 50 μm. 40x vattenmål. Skalstänger = 10 och 20 μm (A); 25 och 50 μm (B), 10 och 20 μm (C), 50 μm (D). Förkortningar: iHCECs = odödliga humana hornhinneepitelceller; pHCECs = primära humana hornhinneepitelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: 3D-konfokala bilder. 3D-konfokala bilder av pHCEC efter 48 timmars tillväxt (A) och iHCECs efter 24 timmar (B). 40x vattenmål. Förkortningar: iHCECs = odödliga humana hornhinneepitelceller; pHCECs = primära humana hornhinneepitelceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Effekt av UV på primära och odödliggjorda HCECs
Den metaboliska aktiviteten hos både primära och odödliggjorda HCECs efter exponering för UV visas i figur 3. Figuren visar normaliserade medel från testbrunnar (fyrdubbla brunnar, två separata experiment). Jämfört med de icke-UV-exponerade cellerna minskade den metaboliska aktiviteten hos bestrålade pHCECs signifikant vid 20 minuters exponering. För iHCECs minskade den metaboliska aktiviteten för celler som bestrålades vid både 5 och 20 minuter. Därför tog det längre exponeringstid att minska den metaboliska aktiviteten hos pHCECs än iHCEC.
Figur 3: Den metaboliska aktiviteten hos pHCEC och iHCEC efter exponering för 5 och 20 minuter av UV-strålning . *p < 0,05 för den icke-UV-exponerade kontrollgruppen. Den icke-UV-exponerade kontrollen är celler i brunnar som inkuberats med testproverna men inte utsatts för UV. Y-axeln är procent i förhållande till den metaboliska aktiviteten hos cellerna som inte utsätts för UV. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: iHCECs = odödliga humana hornhinneepitelceller; pHCECs = primära humana hornhinneepitelceller; UV = ultraviolett. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Effekten av UV-exponering på frisättningen av inflammatoriska cytokiner från HCECs visas i figur 4. Den maximala cytokinfrisättningen inträffade vid olika tidpunkter av UV-exponering för de primära och odödliga HCEC. Den maximala cytokinfrisättningen av iHCECs var vid 5 minuters UV-exponering. Cellerna släppte signifikanta nivåer (p < 0,05) av IL-1β, IL-6 och IL-8 jämfört med de icke-UV-exponerade cellerna. Dessutom inträffade ingen signifikant cytokinfrisättning vid 20 minuters UV-exponering för iHCEC. Den maximala cytokinfrisättningen för pHCECs inträffade dock vid 20 minuters UV-exponering. Alla fyra cytokiner (IL-1β, IL-6, IL-8 och TNF-α) frisattes vid signifikanta nivåer jämfört med de icke-UV-exponerade cellerna. När det gäller totala mängder frisatta inflammatoriska cytokiner (pg / ml) släppte pHCECs betydligt mer IL-1β, IL-8 och TNF-α än iHCEC, medan iHCECs släppte mer IL-6.
Figur 4: Cytokinfrisättning av pHCEC och iHCEC efter exponering för UV-strålning i pg/ml. De fyra proinflammatoriska cytokinerna som kvantifieras är IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) och TNF-α (D). *p < 0,05 för den icke-UV-exponerade kontrollen. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: iHCECs = odödliga humana hornhinneepitelceller; pHCECs = primära humana hornhinneepitelceller; UV = ultraviolett; IL = interleukin; TNF-α = tumörnekrosfaktor alfa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Effekter av kemiska toxiner på primära och odödliggjorda HCECs
Den procentuella minskningen av metabolisk aktivitet efter exponering för de tre okulära toxinerna var likartad mellan pHCEC och iHCEC, vilket visas i figur 5. Figuren visar normaliserade medel från testbrunnar (fyrdubbla brunnar, två separata experiment).
Figur 5: Den metaboliska aktiviteten hos pHCEC och iHCEC efter exponering för tre ögontoxiner i 5 och 15 minuter. *p < 0,05 i kontrollgruppen. Den icke-toxinexponerade kontrollen är celler i brunnar som inkuberas med testproverna men inte utsätts för kemiska toxiner. Y-axeln är procent i förhållande till den metaboliska aktiviteten hos cellerna som inte utsätts för kemiska toxiner. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: iHCECs = odödliga humana hornhinneepitelceller; pHCECs = primära humana hornhinneepitelceller; BAK = bensalkoniumklorid; H2O2= väteperoxid; SDS = natriumdodecylsulfat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Mängden cytokiner som frigjordes av pHCECs var större än de mängder som frigjordes av iHCEC. Frisättningen av cytokin IL-6 påverkades mest av exponering för de tre kemikalierna (BAK 0,001%,H2O2 0,01%, SDS 0,0025%, figur 6). Figuren visar medelvärden (pg/ml) från testbrunnar (fyrdubbla brunnar, två separata experiment). Både pHCEC och iHCECs visade en förändring i frisättningen av IL-6 efter exponering för alla tre kemikalierna. BAK orsakade en minskning av frisättningen av IL-6 jämfört med kontrollen för både primära och odödliga HCEC, medanH2O2orsakade en ökning av frisättningen av IL-6 från iHCECs och en minskning av frisättningen från pHCEC.
Figur 6: Frisättning av cytokin. Cytokinfrisättning av pHCEC och iHCEC efter exponering för tre okulära toxiner i 5 och 15 minuter i pg / ml. De fyra proinflammatoriska cytokinerna som kvantifieras är IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) och TNF-α (D). *p < 0,05 av kontrollen. Felstaplar indikerar standardavvikelse. Förkortningar: iHCECs = odödliga humana hornhinneepitelceller; pHCECs = primära humana hornhinneepitelceller; BAK = bensalkoniumklorid; H2O2= väteperoxid; SDS = natriumdodecylsulfat; IL = interleukin; TNF-α = tumörnekrosfaktor alfa. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Effekter av olika koncentrationer av BAK på cellviabilitet
Effekterna av BAK-koncentrationerna 0,001 %, 0,005 % och 0,01 % under 5 minuter på iHCEC-viabiliteten visas i figur 7. BAK visade liten effekt vid 0,001% för både pHCECs och iHCEC. Både pHCECs och iHCECs skadades signifikant vid 0,005% och 0,01% av BAK. Vid 0,005 % och 0,01 % av BAK var graden av etidiumfärgning större i iHCECs än pHCEC. Calcein fläckar grönt, etidium fläckar rött och annexin V blått (annexin V-färg datorjusterad färg för bättre visualisering av fluorescenssignalen)
Figur 7: Fluorescensmikroskopiska bilder av pHCEC och iHCEC som exponerats för olika koncentrationer av BAK i 5 minuter. Skalstänger = 200 μm; 10x mål. Förkortningar: iHCECs = odödliga humana hornhinneepitelceller; pHCECs = primära humana hornhinneepitelceller; BAK = bensalkoniumklorid. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Potentiella skillnader i användningen av två typer av HCECs bedömdes. Cellerna placerades i samma medium (HOEM) vid identiska koncentrationer av celler och utsattes sedan för korta och långa perioder av UV-strålning och tre okulära toxiner. Doser av UV-strålning och kemikalier valdes utifrån deras fysiologiska effekter, som var tillräckligt skadliga för cellerna för att producera mellanliggande svar som kunde jämföras. Exponeringstider på 5 och 20 min för UV-strålning och 5 och 15 minuter för de valda doserna av BAK (0,001%), SDS (0,0025%) ochH2O2(0,01%) var idealiska exponeringstider och koncentrationer som visade signifikant olika svar mellan cellerna och de obehandlade kontrollerna.
HOEM är ett serumfritt medium som är optimerat för odling av HCEC. HOEM stöder tillväxten av både primära och odödliga celler. Den odödliga cellinjen som användes i denna undersökning förevigades med SV408. SV40-odödliga celler uttrycker onkogenproteiner som kan främja cellcykelprogression genom att störa Rb, p53 och pp2a17. Retinoblastom (Rb) binder till och hämmar E2F-transkriptionsfaktorer, som, när de inte hämmas, tillåter en cell att utvecklas i cellcykeln och dela18. Molekylen p53 binder också till transkriptionsfaktorer för att styra utvecklingen av cellcykeln19. Hämningen av en tredje molekyl, pp2a 20,21, främjar också cellulär proliferation22. Uttrycket av SV40-onkogenproteiner som hämmar Rb, p53 och pp2a17 kan bidra till skillnaderna i svaret mellan iHCEC och pHCEC. Cellstorlekarna för de två typerna av HCECs var också olika, vilket kan bero på dessa onkogenhämmande proteiner eftersom de odödliga cellerna tvingas dela sig med dessa molekyler innan cellerna uppnår den stora storleken på de primära cellerna.
Hornhinnans exponering för UV-strålning kan orsaka allvarliga skador på hornhinnans epitelceller. UV-strålning kan producera reaktiva syreradikaler i cellen, skada DNA och cellmolekyler och störa enzymprocesser23,24. UVB skadar direkt DNA, och UVA skadar DNA och andra cellulära molekyler via produktion av reaktiva syrearter i cellen som sedan kan reagera med andra biomolekyler25,26. Denna UV-skada kan orsaka cytotoxicitet och inflammation på grund av frisättning av inflammatoriska cytokiner från de exponerade cellerna 3,27. I denna studie var odödliga celler mer känsliga för UV-strålningseffekter på cellmetabolisk aktivitet, eftersom det fanns en minskning av den metaboliska aktiviteten hos de odödliga cellerna men inte i den primära cellinjen efter 5 minuter. Skillnader i frisättning av inflammatoriska cytokiner förekom också mellan pHCEC och iHCEC. pHCECs släppte mer IL-1β, IL-8 och TNF-α än iHCECs efter 20 minuters UV-strålning. Dessa skillnader i cytokinfrisättning kan relateras till skillnaderna mellan cellstorleken hos primära och odödliga cellkulturer. Differentiella effekter i cytokinfrisättning mellan primära och odödliga celler har noterats i en annan studie som undersökte effekterna av cigarettrök på primära och odödliga cellinjer28.
För att modellera potentialen hos kemiska toxiner att orsaka okulär irritation har olika cellodlingsmodeller utvecklats för att bedöma cytotoxiciteten hos dessa kemikalier. Denna studie visade att okulära toxiner som har intermediära effekter på HCECs har ungefär samma procentuella minskning av metabolisk aktivitet för både primära och odödliga HCEC. De tre okulära toxinerna orsakade inte en betydande frisättning av de flesta inflammatoriska cytokinerna jämfört med den obehandlade kontrollen. Detta dokument visar emellertid känsligheten hos denna metod för att detektera cytokinnivåer vid baslinjen. En annan metod för att detektera cytokiner från odödliga cellinjer har utvärderats och visade sig inte kunna detektera cytokinnivåer29 vid baslinjen. De mikroskopiska bilderna av BAK-exponerade kulturer visade toxicitet i både pHCECs och iHCECs vid koncentrationerna 0,005% och 0,01% efter 5 minuters exponering och 20 timmars återhämtning.
De kritiska stegen i detta protokoll var att välja UV-doser och okulära toxindoser som resulterade i intermediär toxicitet för cellerna och se till att varje typ av HCECs växte i samma medium. Detta gjorde det möjligt att göra jämförelser mellan effekterna av varje behandling på pHCEC och iHCEC. Modifieringar av denna metod kan göras vid exponering för de giftiga ämnena. Det rekommenderas dock att hålla exponeringstiden nära de tider som testas i detta protokoll eftersom kortare tidpunkter kanske inte visar toxicitet på cellerna. Däremot kan en alltför lång exponering orsaka alltför stor skada så att mindre skillnader i ögontoxiners toxicitet inte kan jämföras med de skadliga effekterna av de testämnen som beskrivs i detta protokoll.
En av fördelarna med de odödliggjorda HCECs jämfört med de primära HCECs är att de odödliga cellerna hade lägre standardavvikelser än de primära cellerna för metabolisk aktivitet och cytokinfrisättning efter exponering för okulära toxiner. Således, för att bedöma metabolisk aktivitet och cytokinfrisättning efter exponering, är de odödliga cellerna mer benägna att detektera fysiologisk toxicitet än primära celler. Både de primära cellerna och den odödliga cellinjen detekterade signifikanta effekter på metabolisk aktivitet och cytokinfrisättning efter UV-exponering, och båda detekterade toxiciteten hos BAK efter färgning av cellerna med fluorescensfärger.
Utöver de endpoints för toxicitet som nämns i denna undersökning kan andra endpoints testas, inklusive effekter på trånga korsningar, cellproliferation, cellmigration och frisättning av ytterligare cytokiner. Detta protokoll utvärderade effekterna av toxiska ämnen på frisättningen av fyra inflammatoriska cytokiner, metabolisk aktivitet och cellviabilitet med hjälp av mätningar för cellpermeabilitet, esterasaktivitet och apoptos. Dessutom bör in vivo-tester, t.ex. ögonirritationstest på kanin, ingå i ett toxicitetstestbatteri, eftersom in vitro-toxicitetstester är lämpliga för att bedöma verkningsmekanismen för toxicitet för HCEC. In vivo-tester på djur behövs för att avgöra om det finns andra immun- och toxicitetsmekanismer som inte kan modelleras in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren, Lyndon W. Jones, har under de senaste 3 åren, genom CORE, fått forskningsstöd eller föreläsningshonoraria från följande företag: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J & J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage och Visioneering. Lyndon Jones är också konsult och/eller sitter i en rådgivande styrelse för Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis och Ophtecs. De andra författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna fick ingen finansiering för detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H.
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
