Summary
Questo articolo descrive le procedure utilizzate per valutare la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche su una linea cellulare primaria e immortalata.
Abstract
Questo articolo descrive i metodi per misurare la tossicità delle radiazioni ultraviolette (UV) e delle tossine oculari su colture di cellule epiteliali corneali umane primarie (pHCEC) e immortalizzate (iHCEC). Le cellule sono state esposte a radiazioni UV e dosi tossiche di benzalconio cloruro (BAK), perossido di idrogeno(H 2 O2) e sodio dodecilsolfato (SDS). L'attività metabolica è stata misurata utilizzando un test metabolico. Il rilascio di citochine infiammatorie è stato misurato utilizzando un test multi-plex di interleuchina (IL)-1β, IL-6, IL-8 e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α) e le cellule sono state valutate per la vitalità utilizzando coloranti fluorescenti.
Gli effetti dannosi dei raggi UV sull'attività metabolica cellulare e sul rilascio di citochine si sono verificati a 5 minuti di esposizione ai raggi UV per iHCEC e 20 minuti per pHCEC. Simili cali percentuali nell'attività metabolica di iHCEC e pHCEC si sono verificati dopo l'esposizione a BAK, H 2 O2o SDS e i cambiamenti più significativi nel rilascio di citochine si sono verificati per IL-6 e IL-8. La microscopia delle cellule esposte a iHCEC e pHCEC BAK colorate con fluorescenza ha mostrato la morte cellulare con un'esposizione BAK dello 0,005%, sebbene il grado di colorazione dell'etidio fosse maggiore negli iHCEC rispetto ai pHCEC. Utilizzando molteplici metodi di valutazione degli effetti tossici mediante microscopia, valutazioni dell'attività metabolica e produzione di citochine, la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine chimiche potrebbe essere determinata sia per le linee cellulari primarie che per quelle immortalate.
Introduction
Gli studi tossicologici in vitro vengono eseguiti per prevedere gli effetti tossici di sostanze chimiche e altri agenti che possono causare danni alle cellule. Nella valutazione della tossicità per la cornea, le cellule epiteliali corneali umane (HCEC) sono state utilizzate in modelli per valutare questi effetti 1,2,3,4. Questi modelli valutano tipicamente gli effetti fisiologici come i cambiamenti nell'attività metabolica della cellula, la proliferazione cellulare e altre funzioni cellulari come la produzione e il rilascio di citochine infiammatorie. Per questi studi tossicologici, sono state selezionate cellule provenienti da varie fonti per valutare gli effetti dannosi delle sostanze chimiche e delle radiazioni UV sugli HCEC 2,3. Le linee pHCEC sono disponibili presso aziende che forniscono queste cellule da tessuti donatori di adulti. Le cellule primarie possono essere trattate con dispase e raschiate delicatamente dalla cornea per la coltura5. Le cellule vengono quindi testate per virus e contaminazione e quindi spedite crioconservate in dimetilsolfossido al 10%.
Il vantaggio delle linee cellulari primarie è che le cellule sono geneticamente identiche alle cellule del donatore. Questo è l'ideale, poiché un modello in vitro dovrebbe imitare il tessuto in vivo il più possibile. Lo svantaggio delle linee cellulari primarie è che hanno un numero limitato di divisioni o passaggi cellulari6. Il numero limitato di cellule disponibili limita il numero di esperimenti che possono essere condotti con una singola coltura primaria, aumentando il costo degli esperimenti.
Linee cellulari immortalizzate sono state utilizzate anche in modelli di tossicità per colture cellulari. Tuttavia, a differenza della linea cellulare primaria ottenuta da tessuto in vivo, la linea cellulare immortalizzata è stata geneticamente modificata. Le cellule immortalizzate sono create incorporando i geni di un virus nel DNA delle cellule primarie 6,7,8. Le cellule con incorporazione genica virale di successo sono selezionate per la linea cellulare immortalata. Il vantaggio dell'immortalizzazione è che consente una rapida proliferazione indefinita, fornendo un numero illimitato di cellule per eseguire più esperimenti utilizzando la stessa linea cellulare. Ciò consente la coerenza tra gli esperimenti e riduce i costi.
Oltre ai cambiamenti nei geni che limitano la proliferazione cellulare, potrebbero verificarsi anche cambiamenti nell'espressione di geni di funzionalità critica9. Pertanto, lo svantaggio di utilizzare cellule immortalizzate è che potrebbero non rappresentare più le cellule originali in vivo in termini di risposta a vari stimoli esterni10. I confronti hanno comportato l'osservazione degli effetti tossici delle sostanze chimiche sui cheratociti corneali umani primari e immortalizzati11, nonché sugli HCEC immortalizzati e sulle cellule primarie epiteliali corneali di coniglio12. Il confronto tra gli effetti delle tossine sui cheratociti umani primari e sui cheratociti immortalizzati non ha mostrato differenze significative11. Utilizzando i metodi descritti in questo articolo, verrà determinata l'efficacia di questi test per valutare la tossicità delle radiazioni UV e delle tossine oculari su pHCEC e iHCEC.
Sono state selezionate tre tossine oculari comunemente utilizzate nei saggi in vitro: BAK,H 2 O2 e SDS. Il BAK è un conservante cationico comunemente usato nelle soluzioni oftalmiche 13,14, H 2O2 è comunemente usato per disinfettare le lenti a contatto 15 e SDS è un tensioattivo anionico presente in detergenti e shampoo 14. Analogamente alle tossine oculari, le radiazioni UV possono anche causare danni significativi agli HCEC3. Inoltre, la sovraesposizione ai raggi UV può causare una condizione oculare nota come fotocheratite caratterizzata da sintomi di lacrimazione, sensibilità alla luce e sensazione di granulosità16.
C'è un numero illimitato di colture cellulari primarie che possono essere utilizzate e varie linee cellulari immortalizzate che sono state sviluppate. Pertanto, è stata intrapresa un'indagine per confrontare gli HCEC primari con una linea HCEC immortalata per determinare somiglianze e differenze tra i modelli che incorporano questi tipi di cellule.
Questa indagine ha utilizzato la microscopia per valutare le possibili differenze tra pHCEC e iHCEC sulla risposta fisiologica delle cellule ai raggi UV e alle tossine. Sono stati valutati anche gli effetti delle radiazioni UV e delle sostanze chimiche sull'attività metabolica cellulare e sul rilascio di citochine infiammatorie per le due linee cellulari. L'importanza di determinare le differenze tra le due linee cellulari è comprendere l'uso ottimale di queste linee cellulari per valutare: 1) l'effetto delle radiazioni UV sulle cellule, 2) gli effetti delle tossine sulle cellule e 3) i cambiamenti risultanti al metabolismo, alla vitalità cellulare e al rilascio di citochine cellulari per studi futuri.
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Protocol
1. Coltura di pHCEC e iHCEC
- Coltivare i pHCEC e gli iHCEC nel mezzo epiteliale oculare umano (HOEM) con i seguenti integratori: 6 mM di L-glutammina, 0,002% di integratore di terreni cellulari O (Tabella dei materiali), 1,0 μM di epinefrina, 0,4% di integratore di terreni cellulari P (Tabella dei materiali), 5 μg/mL di insulina rh, 5 μg/mL di apo-transferrina e 100 ng/mL di idrocortisone emisuccinato in palloni rivestiti di collagene-1 (18 mL in un matraccio di coltura da 75 cm2 ).
- Cambiare il mezzo nei palloni ogni 2-3 giorni rimuovendo il mezzo dopo che le cellule crescono fino a ~ 80% di confluenza. Aggiungere la soluzione di dissociazione senza rosso fenolo e incubare il matraccio a 37 °C fino al completo distacco delle cellule. Neutralizzare la soluzione di dissociazione con DMEM/F12 con siero e quindi centrifugare le cellule a 500 × g. Rimuovere il mezzo surnatante e risospendere le cellule nel mezzo HOEM.
2. Determinazione della dimensione della cellula mediante microscopia confocale
- Seminare sia i pHCEC che gli iHCEC su piastre di Petri rivestite di collagene con vetrini di copertura a una concentrazione di 1 × 105 con 1 mL di HOEM. Coltivare pHCEC e iHCEC, un set di colture per 24 ore e un altro set di colture per 48 ore, in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2.
- Dopo il periodo di incubazione, colorare le cellule con 500 μL di soluzione tampone colorante di annessina contenente calceina (4 μM), omodimero di etidio-1 (8 μM) e annessina V (5 μL in tampone da 500 μL-coniugato Alexa Fluor 647) per 20 minuti a 37 °C. Dopo aver colorato le cellule, regolare il microscopio per catturare le lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488/515 nm per calcein-AM, 543/600 nm per l'omodimero-1 di etidio e 633/665 nm per l'annessina V utilizzando un microscopio a scansione laser confocale.
- Ottieni le immagini e prendi Z-stack per valutare le dimensioni delle celle in tre dimensioni.
- Per acquisire le immagini bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D), trovare l'area da visualizzare con un obiettivo d'acqua apocromato 40x/1.2. Con i laser Argon (488) (prima scansione), HeNe1 (543) (seconda scansione) e HeNe2 (633) (terza scansione), eseguire la scansione in tre canali separati utilizzando i beam splitter, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis e NFT 545 LP560, LP505.
- Utilizza la scansione sequenziale multitraccia per ridurre la diafonia.
NOTA: LP505 viene utilizzato per il canale 2 con il laser 488 per catturare l'emissione del colorante calceina. LP560 viene utilizzato nel canale 3 con il laser 543 per catturare l'emissione dell'omodimero di etidio 1. NFT 635 viene utilizzato con il laser 633 per catturare l'emissione dell'annessina V. Lo scopo dell'HFT è quello di separare la luce di eccitazione e quella di emissione. NFT divide la luce riflettendo la luce < lunghezza d'onda specificata su un canale separato, lasciando che la luce > una lunghezza d'onda specificata attraverso un secondo canale. I filtri LP bloccano lunghezze d'onda più corte rispetto alla lunghezza d'onda specificata e lasciano passare le lunghezze d'onda più lunghe. - Per visualizzare l'immagine in 3D, impostare la confocale su Z-stack e scansionare almeno 20 fotogrammi.
3. Esposizione delle cellule alle radiazioni UV
- Seminare le cellule a 5 × 104/mL di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene-1 a 24 pozzetti e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 3 ore. Dopo il periodo di incubazione, ridurre il volume del mezzo nei pozzetti a 300 μL. Successivamente, esporre le cellule alle radiazioni UV (sia UVA a 6,48 W / m 2 che UVB a 1,82 W / m2 poiché entrambi i tubi UVA e UVB sono accesi nell'incubatore allo stesso tempo) in un incubatore a 37 ° C per 5 e 20 minuti in esperimenti separati.
- Dopo la radiazione UV, aggiungere 200 μL di HOEM fresco in ciascun pozzetto e incubare per 20 ore a 37 °C con il 5% di CO2.
- Dopo l'incubazione, raccogliere il surnatante cellulare in ciascun pozzetto e trasferirlo in tubi sterili di polipropilene da 2 ml. Congelare a -80 °C. Per determinare i livelli di citochine rilasciati dai pHCEC e iHCEC dopo l'esposizione ai raggi UV, utilizzare un test multiplex delle citochine e seguire le istruzioni del kit per quantificare le seguenti quattro citochine: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.
- Aggiungere il reagente del saggio metabolico alle cellule nei pozzetti.
- Preparare il reagente di dosaggio metabolico al 10% in DMEM/F12. Sostituire il terreno di coltura in ciascun pozzetto con 1 mL della soluzione di dosaggio metabolico al 10% e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 4 ore.
- Misurare la fluorescenza di ciascuna soluzione utilizzando un lettore di piastre fluorescenti a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 530/590 nm.
4. Esposizione delle cellule a tossine chimiche
- Cellule di seme a 5 × 104/mL di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene-1 a 24 pozzetti e incubare a 37 °C con il 5% di CO2 per 3 ore. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il mezzo ed esporre le cellule a 1 ml di tossine chimiche (BAK 0,001%, H 2 O20,01% e SDS 0,0025% in soluzione salina tamponata fosfato (PBS)) per 5 e 15 minuti.
- Dopo l'esposizione alle tossine chimiche, rimuovere le tossine dai pozzetti, risciacquare con 1 mL di PBS e aggiungere 1 mL di HOEM a ciascun pozzetto. Dopo 20 ore di incubazione, eseguire un test metabolico sostituendo il terreno con 1 mL di una soluzione di dosaggio metabolico al 10% e incubando a 37 °C con CO 2 al 5% per 4 ore. Misurare la fluorescenza utilizzando un lettore di piastre multipozzetto a fluorescenza a lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 530/590 nm.
- Trasferire i surnatanti cellulari dai pozzetti dopo l'incubazione di 20 ore in provette sterili separate di polipropilene da 2 mL e congelare a -80 °C. Quantificare le citochine rilasciate dai pHCEC e dagli iHCEC dopo l'esposizione alle sostanze chimiche. Utilizzare la stessa piattaforma multiplex utilizzata per valutare le citochine dalle cellule trattate con raggi UV. Utilizzare un test di citochine multiplex seguendo le istruzioni del kit per quantificare le seguenti quattro citochine: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.
5. Esame delle cellule esposte a varie concentrazioni di BAK
- Le cellule seme a 1 × 10 5/mL di HOEM in ciascun pozzetto di una piastra di coltura rivestita di collagene-1 a 24 pozzetti e incubano a 37 °C con il5% di CO2 per 24 ore. Dopo il periodo di incubazione, rimuovere il mezzo ed esporre le cellule a 1 ml di tossine chimiche (BAK 0,001%, BAK 0,005% e BAK 0,01% in PBS) per 5 minuti.
- Dopo l'esposizione, rimuovere le tossine chimiche, sciacquare i pozzetti con 1 ml di PBS e aggiungere 1 ml di HOEM a ciascun pozzetto. Dopo 20 ore di incubazione, colorare le cellule con 500 μL di soluzione tampone colorante di annessina contenente calceina (4 μM), omodimero-1 di etidio (8 μM) e annessina V (5 μL in tampone da 500 μL-coniugato Alexa Fluor 647) per 20 minuti a 37 °C. Regolare il microscopio per misurare le intensità della colorazione dell'annessina V, della calceina AM e dell'etidio-1 a lunghezze d'onda di eccitazione / emissione rispettivamente di 630/675 nm, 495/515 nm e 528/617 nm. Immagini delle cellule usando il microscopio a fluorescenza
6. Analisi dei dati
- Eseguire un test di normalità e un test per varianze uguali prima di eseguire un'analisi della varianza (ANOVA), Welch ANOVA o Kruskal-Wallis. Utilizzare il test post-hoc appropriato per confrontare ciascun gruppo testato. Impostare p < 0.05.
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Representative Results
Dimensioni della cella
Gli HCEC primari e immortalati sono stati visualizzati con tre coloranti fluorescenti, che riflettono tre diversi stadi di vitalità cellulare. Le cellule vive sono verdi (calceina-AM), le cellule morte sono rosse (omodimero di etidio-1) e le cellule apoptotiche sono gialle (colore regolato dal computer V-annessina per una migliore visualizzazione del segnale di fluorescenza). Le cellule vive contengono esterasi nel citoplasma cellulare e convertono calcein-AM in calceina. Le cellule morte hanno membrane cellulari permeabili all'omodimero di etidio-1. Le cellule apoptotiche hanno colorazione sulla membrana cellulare mentre la fosfatidilserina viene traslocata alla membrana esterna.
Un confronto delle dimensioni delle cellule per i due tipi di HCEC dopo 24 e 48 ore di crescita è stato effettuato utilizzando la microscopia confocale, come mostrato nella Figura 1. Gli iHCEC (Figura 1A) sono celle più piccole che vanno da 10 μm a 20 μm, e i pHCEC (Figura 1B) variano in dimensioni da 20 μm a 50 μm dopo 24 ore di crescita. Differenze simili nell'intervallo di dimensioni sono state osservate per iHCEC (Figura 1C) e pHCEC (Figura 1D) dopo 48 ore di crescita. Le immagini 3D dei due tipi di HCEC sono state realizzate utilizzando la microscopia confocale (la Figura 2A mostra i pHCEC; La Figura 2B mostra gli iHCEC).
Figura 1: Un confronto delle dimensioni delle cellule mediante microscopia confocale . iHCEC dopo 24 (A) e 48 (C) h di crescita con cellule di dimensioni comprese tra 10 e 20 μm. pHCEC dopo 24 (B) e 48 (D) h di crescita con cellule di dimensioni comprese tra 20 e 50 μm. Obiettivo acqua 40x. Barre della scala = 10 e 20 μm (A); 25 e 50 μm (B); 10 e 20 μm (C); 50 μm (D). Abbreviazioni: iHCECs = cellule epiteliali corneali umane immortalizzate; pHCECs = cellule epiteliali corneali umane primarie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini confocali 3D. Immagini confocali 3D di pHCEC dopo 48 ore di crescita (A) e iHCEC dopo 24 ore (B). Obiettivo d'acqua 40x. Abbreviazioni: iHCECs = cellule epiteliali corneali umane immortalizzate; pHCECs = cellule epiteliali corneali umane primarie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Effetto dei raggi UV sugli HCEC primari e immortalizzati
L'attività metabolica degli HCEC primari e immortalizzati dopo l'esposizione ai raggi UV è mostrata nella Figura 3. La figura mostra i mezzi normalizzati dai pozzi di prova (pozzi quadruplicati, due esperimenti separati). Rispetto alle cellule non esposte ai raggi UV, l'attività metabolica dei pHCEC irradiati è stata significativamente ridotta a 20 minuti di esposizione. Per gli iHCEC, l'attività metabolica è diminuita per le cellule irradiate sia a 5 che a 20 minuti. Pertanto, ci è voluto un tempo di esposizione più lungo per ridurre l'attività metabolica dei pHCEC rispetto agli iHCEC.
Figura 3: L'attività metabolica di pHCEC e iHCEC dopo esposizione a 5 e 20 minuti di radiazioni UV. *p < 0,05 del controllo non esposto ai raggi UV. Il controllo non esposto ai raggi UV sono cellule in pozzetti incubati con i campioni di prova ma non esposti ai raggi UV. L'asse Y è percentuale relativa all'attività metabolica delle cellule non esposte ai raggi UV. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: iHCECs = cellule epiteliali corneali umane immortalizzate; pHCECs = cellule epiteliali corneali umane primarie; UV = ultravioletto. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'effetto dell'esposizione ai raggi UV sul rilascio di citochine infiammatorie dagli HCEC è mostrato nella Figura 4. Il massimo rilascio di citochine si è verificato in diversi momenti di esposizione ai raggi UV per gli HCEC primari e immortalizzati. Il massimo rilascio di citochine da parte degli iHCEC è stato di 5 minuti di esposizione ai raggi UV. Le cellule hanno rilasciato livelli significativi (p < 0,05) di IL-1β, IL-6 e IL-8 rispetto alle cellule non esposte ai raggi UV. Inoltre, non si è verificato alcun rilascio significativo di citochine a 20 minuti di esposizione ai raggi UV per gli iHCEC. Tuttavia, il massimo rilascio di citochine per i pHCEC si è verificato a 20 minuti di esposizione ai raggi UV. Tutte e quattro le citochine (IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α) sono state rilasciate a livelli significativi rispetto alle cellule non esposte ai raggi UV. In termini di quantità totale di citochine infiammatorie rilasciate (pg / mL), i pHCEC hanno rilasciato sostanzialmente più IL-1β, IL-8 e TNF-α rispetto agli iHCEC, mentre gli iHCEC hanno rilasciato più IL-6.
Figura 4: Rilascio di citochine da parte dei pHCEC e degli iHCEC dopo esposizione a radiazioni UV in pg/mL. Le quattro citochine proinfiammatorie quantificate sono IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) e TNF-α (D). *p < 0,05 del controllo non esposto ai raggi UV. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: iHCECs = cellule epiteliali corneali umane immortalizzate; pHCECs = cellule epiteliali corneali umane primarie; UV = ultravioletto; IL = interleuchina; TNF-α = fattore di necrosi tumorale alfa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Effetti delle tossine chimiche sugli HCEC primari e immortalizzati
La riduzione percentuale dell'attività metabolica dopo l'esposizione alle tre tossine oculari era simile tra i pHCEC e gli iHCEC, come mostrato nella Figura 5. La figura mostra i mezzi normalizzati dai pozzi di prova (pozzi quadruplicati, due esperimenti separati).
Figura 5: L'attività metabolica di pHCEC e iHCEC dopo esposizione a tre tossine oculari per 5 e 15 min. *p < 0,05 del controllo. Il controllo non esposto alle tossine sono cellule in pozzetti incubati con i campioni di prova ma non esposti a tossine chimiche. L'asse Y è percentuale relativa all'attività metabolica delle cellule non esposte a tossine chimiche. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: iHCECs = cellule epiteliali corneali umane immortalizzate; pHCECs = cellule epiteliali corneali umane primarie; BAK = benzalconio cloruro; H2 O2 = perossido di idrogeno; SDS = sodio dodecilsolfato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Le quantità di citochine rilasciate dai pHCEC erano maggiori delle quantità rilasciate dagli iHCEC. Il rilascio di citochina IL-6 è stato maggiormente influenzato dall'esposizione alle tre sostanze chimiche (BAK 0,001%, H 2 O20,01%, SDS 0,0025%, Figura 6). La figura mostra le medie (pg/mL) dei pozzi di prova (pozzi quadruplicati, due esperimenti separati). Sia i pHCEC che gli iHCEC hanno mostrato un cambiamento nel rilascio di IL-6 dopo l'esposizione a tutte e tre le sostanze chimiche. BAK ha causato una diminuzione del rilascio di IL-6 rispetto al controllo sia per gli HCEC primari che per quelli immortalizzati, mentre H 2O2 ha causato un aumento del rilascio di IL-6 dagli iHCEC e una diminuzione del rilascio dai pHCEC.
Figura 6: Rilascio di citochine. Rilascio di citochine da parte dei pHCEC e iHCEC dopo esposizione a tre tossine oculari per 5 e 15 minuti in pg/mL. Le quattro citochine proinfiammatorie quantificate sono IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) e TNF-α (D). *p < 0,05 del controllo. Le barre di errore indicano una deviazione standard. Abbreviazioni: iHCECs = cellule epiteliali corneali umane immortalizzate; pHCECs = cellule epiteliali corneali umane primarie; BAK = benzalconio cloruro; H2 O2 = perossido di idrogeno; SDS = sodio dodecilsolfato; IL = interleuchina; TNF-α = fattore di necrosi tumorale alfa. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Effetti di varie concentrazioni di BAK sulla vitalità cellulare
Gli effetti delle concentrazioni di BAK 0,001%, 0,005% e 0,01% per 5 minuti sulla vitalità di iHCEC sono mostrati nella Figura 7. Il BAK ha mostrato scarso effetto allo 0,001% sia per i pHCEC che per gli iHCEC. Sia i pHCEC che gli iHCEC sono stati significativamente danneggiati allo 0,005% e allo 0,01% di BAK. Allo 0,005% e allo 0,01% di BAK, il grado di colorazione dell'etidio era maggiore negli iHCEC rispetto ai pHCEC. Coloranti di calceina di verde, macchie di etidio rosse e annessina V blu (colore regolato al computer a colori V-color annessina per una migliore visualizzazione del segnale di fluorescenza)
Figura 7: Immagini microscopiche a fluorescenza di pHCEC e iHCEC esposti a diverse concentrazioni di BAK per 5 minuti. Barre della scala = 200 μm; Obiettivo 10x. Abbreviazioni: iHCECs = cellule epiteliali corneali umane immortalizzate; pHCECs = cellule epiteliali corneali umane primarie; BAK = benzalconio cloruro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Sono state valutate le potenziali differenze nell'uso di due tipi di HCEC. Le cellule sono state collocate nello stesso mezzo (HOEM) a concentrazioni identiche di cellule e quindi esposte a brevi e lunghi periodi di radiazioni UV e tre tossine oculari. Le dosi di radiazioni UV e sostanze chimiche sono state selezionate in base ai loro effetti fisiologici, che erano abbastanza dannosi per le cellule da produrre risposte intermedie che potevano essere confrontate. I tempi di esposizione di 5 e 20 minuti per le radiazioni UV e di 5 e 15 minuti per le dosi selezionate di BAK (0,001%), SDS (0,0025%) e H 2 O2(0,01%) sono stati tempi di esposizione e concentrazioni ideali che hanno mostrato risposte significativamente diverse tra le cellule e i controlli non trattati.
HOEM è un mezzo privo di siero ottimizzato per la coltura degli HCEC. HOEM supporta la crescita di cellule primarie e immortalate. La linea cellulare immortalata utilizzata in questa indagine è stata immortalata utilizzando SV408. Le cellule immortalizzate da SV40 esprimono proteine oncogene che possono promuovere la progressione del ciclo cellulare interferendo con Rb, p53 e pp2a17. Il retinoblastoma (Rb) si lega e inibisce i fattori di trascrizione E2F che, quando non inibiti, consentono a una cellula di progredire nel ciclo cellulare e dividersi18. La molecola p53 si lega anche ai fattori di trascrizione per controllare la progressione del ciclo cellulare19. L'inibizione di una terza molecola, pp2a 20,21, promuove anche la proliferazione cellulare22. L'espressione delle proteine oncogene SV40 che inibiscono Rb, p53 e pp2a17 può contribuire alle differenze nella risposta degli iHCEC rispetto ai pHCEC. Anche le dimensioni delle cellule dei due tipi di HCEC erano diverse, il che potrebbe essere dovuto a queste proteine che inibiscono l'oncogene perché le cellule immortalizzate sono costrette a dividersi da queste molecole prima che le cellule raggiungano le grandi dimensioni delle cellule primarie.
L'esposizione corneale alle radiazioni UV può causare gravi danni alle cellule epiteliali corneali. Le radiazioni UV possono produrre specie reattive dell'ossigeno nella cellula, danneggiare il DNA e le molecole cellulari e interrompere i processi enzimatici23,24. UVB danneggia direttamente il DNA e UVA danneggia il DNA e altre molecole cellulari attraverso la produzione di specie reattive dell'ossigeno all'interno della cellula che possono quindi reagire con altre biomolecole25,26. Questo danno UV può causare citotossicità e infiammazione a causa del rilascio di citochine infiammatorie dalle cellule esposte 3,27. In questo studio, le cellule immortalizzate erano più sensibili agli effetti delle radiazioni UV sull'attività metabolica cellulare, poiché vi era un calo dell'attività metabolica delle cellule immortalizzate ma non nella linea cellulare primaria dopo 5 minuti. Differenze nel rilascio di citochine infiammatorie si sono verificate anche tra i pHCEC e gli iHCEC. I pHCEC hanno rilasciato più IL-1β, IL-8 e TNF-α rispetto agli iHCEC dopo 20 minuti di radiazione UV. Queste differenze nel rilascio di citochine potrebbero essere correlate alle differenze tra la dimensione cellulare delle colture cellulari primarie e immortalizzate. Effetti differenziali nel rilascio di citochine tra cellule primarie e immortalizzate sono stati notati in un altro studio che ha esaminato gli effetti del fumo di sigaretta sulle linee cellulari primarie e immortalizzate28.
Per modellare il potenziale delle tossine chimiche di causare irritazione oculare, sono stati sviluppati vari modelli di coltura cellulare per valutare la citotossicità di queste sostanze chimiche. Questo studio ha dimostrato che le tossine oculari che hanno effetti intermedi sugli HCEC hanno approssimativamente la stessa diminuzione percentuale dell'attività metabolica sia per gli HCEC primari che per quelli immortalizzati. Le tre tossine oculari non hanno causato un rilascio sostanziale della maggior parte delle citochine infiammatorie rispetto al controllo non trattato. Tuttavia, questo documento mostra la sensibilità di questo metodo nel rilevare i livelli basali di citochine. Un altro metodo per rilevare le citochine da linee cellulari immortalizzate è stato valutato ed è risultato incapace di rilevare i livelli di citochine al basale29. Le immagini microscopiche delle colture esposte a BAK hanno mostrato tossicità sia nei pHCEC che negli iHCEC alle concentrazioni dello 0,005% e dello 0,01% dopo 5 minuti di esposizione e 20 ore di recupero.
I passaggi critici di questo protocollo sono stati la selezione delle dosi UV e delle dosi di tossine oculari che hanno determinato una tossicità intermedia per le cellule e la garanzia che ogni tipo di HCEC crescesse nello stesso mezzo. Ciò ha permesso di effettuare confronti tra gli effetti di ciascun trattamento sui pHCEC e sugli iHCEC. Le modifiche di questo metodo possono essere apportate nel tempo di esposizione agli agenti tossici. Tuttavia, si raccomanda di mantenere il tempo di esposizione vicino ai tempi testati in questo protocollo poiché i punti temporali più brevi potrebbero non mostrare tossicità sulle cellule. Al contrario, un'esposizione troppo lunga può causare troppi danni in modo che piccole differenze nella tossicità delle tossine oculari non possano essere paragonate agli effetti dannosi degli agenti di prova descritti in questo protocollo.
Uno dei vantaggi degli HCEC immortalizzati rispetto agli HCEC primari è che le cellule immortalizzate avevano deviazioni standard inferiori rispetto alle cellule primarie per l'attività metabolica e il rilascio di citochine dopo l'esposizione alle tossine oculari. Pertanto, per valutare l'attività metabolica e il rilascio di citochine dopo l'esposizione, le cellule immortalizzate hanno maggiori probabilità di rilevare tossicità fisiologica rispetto alle cellule primarie. Sia le cellule primarie che la linea cellulare immortalizzata hanno rilevato effetti significativi sull'attività metabolica e sul rilascio di citochine dopo l'esposizione ai raggi UV, ed entrambe hanno rilevato la tossicità del BAK dopo aver colorato le cellule con coloranti a fluorescenza.
Oltre agli endpoint di tossicità menzionati in questa indagine, potrebbero essere testati altri endpoint, compresi gli effetti sulle giunzioni strette, la proliferazione cellulare, la migrazione cellulare e il rilascio di ulteriori citochine. Questo protocollo ha valutato gli effetti degli agenti tossici sul rilascio di quattro citochine infiammatorie, l'attività metabolica e la vitalità cellulare utilizzando misurazioni per la permeabilità cellulare, l'attività dell'esterasi e l'apoptosi. Inoltre, i test vivi, come i test di irritazione oculare del coniglio, dovrebbero essere inclusi in una batteria di test di tossicità, in quanto itest di tossicitàin vitro sono adatti per valutare il meccanismo d'azione della tossicità per gli HCEC. Sono necessari test in vivo sugli animali per determinare se esistono altri meccanismi immunitari e di tossicità che non possono essere modellati in vitro.
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Disclosures
L'autore, Lyndon W. Jones, negli ultimi 3 anni, attraverso CORE, ha ricevuto supporto alla ricerca o onorari di conferenze dalle seguenti società: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J & J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage e Visioneering. Lyndon Jones è anche consulente e/o fa parte di un comitato consultivo per Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis e Ophtecs. Gli altri autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori non hanno ricevuto alcun finanziamento per questo lavoro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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