Summary
Dit artikel beschrijft de procedures die worden gebruikt om de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines op een primaire en onsterfelijke cellijn te evalueren.
Abstract
Dit artikel beschrijft de methoden voor het meten van de toxiciteit van ultraviolette (UV) straling en oculaire toxines op primaire (pHCEC) en vereeuwigde (iHCEC) menselijke cornea-epitheelcelculturen. Cellen werden blootgesteld aan UV-straling en toxische doses benzalkoniumchloride (BAK), waterstofperoxide (H 2 O2) en natriumdodecylsulfaat (SDS). De metabole activiteit werd gemeten met behulp van een metabole test. De afgifte van inflammatoire cytokines werd gemeten met behulp van een multi-plex interleukine (IL)-1β, IL-6, IL-8 en tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) assay, en cellen werden geëvalueerd op levensvatbaarheid met behulp van fluorescerende kleurstoffen.
De schadelijke effecten van UV op de metabole activiteit van cellen en de afgifte van cytokines traden op bij 5 minuten UV-blootstelling voor iHCEC en 20 minuten voor pHCEC. Vergelijkbare procentuele dalingen in metabole activiteit van de iHCEC en pHCEC traden op na blootstelling aan BAK, H 2 O2of SDS, en de meest significante veranderingen in cytokineafgifte traden op voor IL-6 en IL-8. Microscopie van fluorescerend gekleurde iHCEC- en pHCEC BAK-blootgestelde cellen toonde celdood bij 0,005% BAK-blootstelling, hoewel de mate van ethidiumkleuring groter was in de iHCECs dan pHCECs. Met behulp van meerdere methoden voor het beoordelen van toxische effecten met behulp van microscopie, beoordelingen van metabole activiteit en cytokineproductie, kon de toxiciteit van UV-straling en chemische toxines worden bepaald voor zowel primaire als onsterfelijke cellijnen.
Introduction
In vitro toxicologische studies worden uitgevoerd om de toxische effecten van chemicaliën en andere agentia te voorspellen die schade aan cellen kunnen veroorzaken. Bij de beoordeling van de toxiciteit voor het hoornvlies zijn menselijke cornea-epitheelcellen (HCEC's) gebruikt in modellen voor het evalueren van deze effecten 1,2,3,4. Deze modellen evalueren meestal fysiologische effecten zoals veranderingen in de metabole activiteit van de cel, celproliferatie en andere celfuncties zoals de productie en afgifte van inflammatoire cytokines. Voor deze toxicologische studies zijn cellen uit verschillende bronnen geselecteerd om de schadelijke effecten van chemicaliën en UV-straling op HCECs 2,3 te beoordelen. pHCEC-lijnen zijn verkrijgbaar bij bedrijven die deze cellen leveren uit donorweefsels van volwassenen. Primaire cellen kunnen worden behandeld met dispase en voorzichtig van het hoornvlies worden geschraapt voor kweek5. De cellen worden vervolgens getest op virussen en besmetting en vervolgens gecryopreserveerd in 10% dimethylsulfoxide.
Het voordeel van primaire cellijnen is dat de cellen genetisch identiek zijn aan de cellen van de donor. Dit is ideaal, omdat een in vitro model het in vivo weefsel zoveel mogelijk moet nabootsen. Het nadeel van primaire cellijnen is dat ze een beperkt aantal celdelingen of passages hebben6. Het beperkte aantal beschikbare cellen beperkt het aantal experimenten dat kan worden uitgevoerd met een enkele primaire cultuur, waardoor de kosten van de experimenten stijgen.
Vereeuwigde cellijnen zijn ook gebruikt in celkweektoxiciteitsmodellen. In tegenstelling tot de primaire cellijn verkregen uit in vivo weefsel, is de vereeuwigde cellijn echter genetisch veranderd. Vereeuwigde cellen worden gemaakt door de genen van een virus op te nemen in het DNA van primaire cellen 6,7,8. Cellen met succesvolle virale genintegratie worden geselecteerd voor de vereeuwigde cellijn. Het voordeel van onsterfelijkheid is dat het onbeperkte snelle proliferatie mogelijk maakt, waardoor een onbeperkt aantal cellen meerdere experimenten kan uitvoeren met dezelfde cellijn. Dit zorgt voor consistentie tussen experimenten en verlaagt de kosten.
Naast veranderingen in de genen die de celproliferatie beperkten, konden ook veranderingen in de expressie van genen met kritische functionaliteit optreden9. Daarom is het nadeel van het gebruik van onsterfelijke cellen dat ze mogelijk niet langer de oorspronkelijke in vivo cellen vertegenwoordigen in termen van hun reactie op verschillende externe stimuli10. Vergelijkingen hebben betrekking op het observeren van de toxische effecten van chemicaliën op primaire en onsterfelijke menselijke corneale keratocyten11, evenals onsterfelijke HCECs en primaire cellen van konijnenhoornvliesepitheel12. De vergelijking tussen de effecten van toxines op primaire menselijke keratocyten en vereeuwigde keratocyten toonde geen significante verschillen11. Met behulp van de methoden die in dit artikel worden beschreven, zal de effectiviteit van deze testen om de toxiciteit van UV-straling en oculaire toxines op pHCECs en iHCECs te beoordelen, worden bepaald.
Drie oculaire toxines die vaak worden gebruikt in in vitro assays werden geselecteerd: BAK, H 2 O2en SDS. BAK is een kationisch conserveermiddel dat vaak wordt gebruikt in oogheelkundige oplossingen 13,14, H 2 O2wordt vaak gebruikt om contactlenzen te desinfecteren 15 en SDS is een anionogene oppervlakteactieve stof die wordt aangetroffen in detergentia en shampoos 14. Net als oculaire toxines kan UV-straling ook aanzienlijke schade aan HCECs3 veroorzaken. Bovendien kan overmatige blootstelling aan UV een oculaire aandoening veroorzaken die bekend staat als fotokeratitis en wordt gekenmerkt door symptomen van scheuren, lichtgevoeligheid en een gevoel van korreligheid16.
Er is een onbeperkt aantal primaire celculturen die kunnen worden gebruikt en verschillende vereeuwigde cellijnen die zijn ontwikkeld. Daarom werd een onderzoek uitgevoerd om primaire HCEC's te vergelijken met een vereeuwigde HCEC-lijn om overeenkomsten en verschillen te bepalen tussen modellen die dit soort cellen bevatten.
Dit onderzoek gebruikte microscopie om mogelijke verschillen tussen pHCECs en iHCECs op celfysiologische respons op UV en toxines te beoordelen. De effecten van UV-straling en chemicaliën op de metabole activiteit van cellen en de inflammatoire cytokine-afgifte voor de twee cellijnen werden ook geëvalueerd. Het belang van het bepalen van de verschillen tussen de twee cellijnen is om het optimale gebruik van deze cellijnen te begrijpen voor het evalueren van: 1) het effect van UV-straling op cellen, 2) de effecten van toxines op cellen en 3) de resulterende veranderingen in metabolisme, levensvatbaarheid van cellen en celcytokine-afgifte voor toekomstige studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kweek van pHCECs en iHCECs
- Kweek de pHCECs en iHCECs in humaan oculair epitheelmedium (HOEM) met de volgende supplementen: 6 mM L-glutamine, 0,002% celmediasupplement O (materiaaltabel), 1,0 μM epinefrine, 0,4% celmediasupplement P (materiaaltabel), 5 μg/ml rh insuline, 5 μg/ml apo-transferrine en 100 ng/ml hydrocortisonhemisuccinaat in collageen-1 gecoate cultuurkolven (18 ml in een 75 cm2 kweekkolf).
- Verander het medium in de kolven om de 2-3 dagen door het medium te verwijderen nadat de cellen zijn gegroeid tot ~ 80% samenvloeiing. Voeg dissociatieoplossing zonder fenolrood toe en incubeer de kolf bij 37 °C totdat de cellen volledig zijn losgemaakt. Neutraliseer de dissociatieoplossing met DMEM/F12 met serum en centrifugeer de cellen vervolgens op 500 × g. Verwijder het bovennatuurlijke medium en resuspensie van de cellen in het HOEM-medium.
2. Bepaling van de celgrootte met behulp van confocale microscopie
- Zaai zowel pHCEC's als iHCECs op met collageen bedekte petrischalen met glazen bodembedekkingen in een concentratie van 1 × 105 met 1 ml HOEM. Kweek pHCECs en iHCECs, één set culturen gedurende 24 uur en een andere set culturen gedurende 48 uur, in een incubator van 37 °C met 5% CO2.
- Na de incubatietijd kleurt u de cellen met 500 μL annexinekleuringsbufferoplossing die calceïne (4 μM), ethidiumhomodimeer-1 (8 μM) en annexine V (5 μL in 500 μL buffer-Alexa Fluor 647-conjugaat) bevat gedurende 20 minuten bij 37 °C. Na het kleuren van de cellen, stel de microscoop in voor het vastleggen van de excitatie/ emissiegolflengten van 488/515 nm voor calceïne-AM, 543/600 nm voor ethidium homodimeer-1 en 633/665 nm voor annexine V met behulp van een confocale laserscanmicroscoop.
- Verkrijg de afbeeldingen en neem Z-stacks om de celgrootte in drie dimensies te beoordelen.
- Om de tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) beelden te verkrijgen, zoekt u het gebied om af te beelden met een apochromaat 40x/1.2 waterobjectief. Met de Argon (488) (eerste scan), HeNe1 (543) (tweede scan) en HeNe2 (633) (derde scan) lasers, scant u in drie afzonderlijke kanalen met behulp van de bundelsplitters, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis en NFT 545 LP560, LP505.
- Gebruik sequentiële scans met meerdere sporen om overspraak te verminderen.
OPMERKING: LP505 wordt gebruikt voor kanaal 2 met de 488-laser om de emissie van de calceïnekleurstof vast te leggen. LP560 wordt gebruikt in kanaal 3 met de 543 laser om de emissie van het ethidicum homodimeer 1 vast te leggen. NFT 635 wordt gebruikt met de 633-laser om de emissie van de annexine V vast te leggen. Het doel van de HFT is om de excitatie en het emissielicht te scheiden. NFT splitst licht door licht < opgegeven golflengte naar een apart kanaal te reflecteren, terwijl licht een bepaalde golflengte > naar een tweede kanaal. LP-filters blokkeren kortere golflengten dan de opgegeven golflengte en laten de langere golflengten door. - Als u een afbeelding in 3D wilt maken, stelt u de confocale in op Z-stack en scant u ten minste 20 frames.
3. Blootstelling van cellen aan UV-straling
- Zaai de cellen op 5 × 104/ml HOEM in elk putje van een 24-well collageen-1 gecoate kweekplaat en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 uur. Verminder na de incubatietijd het volume van het medium in de putten tot 300 μL. Stel vervolgens de cellen bloot aan UV-straling (zowel UVA bij 6,48 W/m 2 als UVB bij 1,82 W/m2 omdat zowel UVA- als UVB-buizen tegelijkertijd in de couveuse worden ingeschakeld) in een 37 °C-incubator gedurende 5 en 20 minuten in afzonderlijke experimenten.
- Voeg na de UV-straling 200 μL verse HOEM toe aan elke put en incubeer gedurende 20 uur bij 37 °C met 5% CO2.
- Verzamel na incubatie het celsupernatant in elke put en breng het over in steriele polypropyleenbuizen van 2 ml. Invriezen bij -80 °C. Om de cytokineniveaus te bepalen die vrijkomen door de pHCECs en iHCECs na UV-blootstelling, gebruikt u een multiplex cytokine-assay en volgt u de instructies van de kit om de volgende vier cytokines te kwantificeren: IL-6, IL-8, IL-1β en TNF-α.
- Voeg metabolisch testreagens toe aan de cellen in de putten.
- Bereid 10% metabolisch assay-reagens in DMEM/F12. Vervang het kweekmedium in elk putje door 1 ml van de 10% metabole testoplossing en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 4 uur.
- Meet de fluorescentie van elke oplossing met behulp van een fluorescentieplaatlezer op 530/590 nm excitatie/emissiegolflengten.
4. Blootstelling van cellen aan chemische toxines
- Zaadcellen bij 5 × 104/ml HOEM in elk putje van een 24-well collageen-1 gecoate kweekplaat en incubeer bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 3 uur. Verwijder na de incubatietijd het medium en stel de cellen gedurende 5 en 15 minuten bloot aan 1 ml chemische toxines (BAK 0,001%, H 2 O2 0,01% en SDS 0,0025% in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)).
- Verwijder na blootstelling aan de chemische toxines de gifstoffen uit de putten, spoel af met 1 ml PBS en voeg 1 ml HOEM toe aan elke put. Voer na 20 uur incubatie een metabole test uit door het medium te vervangen door 1 ml van een 10% metabole testoplossing en gedurende 4 uur te incuberen bij 37 °C met 5% CO2 . Meet de fluorescentie met behulp van een fluorescentie multi-well plaatlezer op 530/590 nm excitatie/emissiegolflengten.
- Breng de celsupernatanten uit de putten na de incubatie van 20 uur over in afzonderlijke steriele polypropyleenbuizen van 2 ml en vries in bij -80 °C. Kwantificeer cytokines die vrijkomen door de pHCECs en iHCECs na blootstelling aan de chemicaliën. Gebruik hetzelfde multiplexplatform dat wordt gebruikt om de cytokines van de UV-behandelde cellen te beoordelen. Gebruik een multiplex cytokinetest volgens de instructies van de kit om de volgende vier cytokines te kwantificeren: IL-6, IL-8, IL-1β en TNF-α.
5. Onderzoek van cellen die zijn blootgesteld aan verschillende concentraties BAK
- Zaadcellen bij 1 × 10 5/ml HOEM in elk putje van een 24-well collageen-1 gecoate kweekplaat en incubeer bij 37 °C met5% CO2 gedurende 24 uur. Verwijder na de incubatietijd het medium en stel de cellen gedurende 5 minuten bloot aan 1 ml chemische toxines (BAK 0,001%, BAK 0,005% en BAK 0,01% in PBS).
- Verwijder na blootstelling de chemische toxines, spoel de putten met 1 ml PBS en voeg 1 ml HOEM toe aan elke put. Na 20 uur incubatie kleurt u de cellen gedurende 20 minuten bij 37 °C met 500 μL annexinekleuringsbufferoplossing die calceïne (4 μM), ethidiumhomodimeer-1 (8 μM) en annexine V (5 μL buffer-Alexa Fluor 647-conjugaat) bevat. Stel de microscoop in om de intensiteiten van annexine V, calceïne AM en ethidium-1-kleuring te meten bij excitatie/ emissiegolflengten van respectievelijk 630/675 nm, 495/515 nm en 528/617 nm. Stel de cellen voor met behulp van de fluorescentiemicroscoop
6. Data-analyse
- Voer een normaliteitstest en een test voor gelijke varianties uit voordat u een variantieanalyse (ANOVA), Welch ANOVA of Kruskal-Wallis-test uitvoert. Gebruik de juiste post-hoc test om elke geteste groep te vergelijken. Stel p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celgrootte
De primaire en vereeuwigde HCEC's werden gevisualiseerd met drie fluorescerende kleurstoffen, die drie verschillende stadia van levensvatbaarheid van cellen weerspiegelen. Levende cellen zijn groen (calceïne-AM), dode cellen zijn rood (ethidium homodimeer-1) en apoptotische cellen zijn geel (annexine V-computer-aangepaste kleur voor een betere visualisatie van het fluorescentiesignaal). Levende cellen bevatten esterasen in het celcytoplasma en zetten calceïne-AM om in calceïne. Dode cellen hebben celmembranen die doorlaatbaar zijn voor ethidium homodimeer-1. Apoptotische cellen hebben kleuring op het celmembraan als fosfatidylserine wordt getransloceerd naar het buitenmembraan.
Een vergelijking van de celgrootte voor de twee soorten HCEC's na 24 en 48 uur groei werd gemaakt met behulp van confocale microscopie, zoals weergegeven in figuur 1. De iHCECs (figuur 1A) zijn kleinere cellen die variëren van 10 μm tot 20 μm, en de pHCECs (figuur 1B) variëren in grootte van 20 μm tot 50 μm na 24 uur groei. Vergelijkbare verschillen in groottebereik werden waargenomen voor iHCECs (Figuur 1C) en pHCECs (Figuur 1D) na 48 h groei. 3D-beelden van de twee soorten HCEC's werden gemaakt met behulp van confocale microscopie (figuur 2A toont pHCECs; Figuur 2B toont iHCECs).
Figuur 1: Een vergelijking van de celgrootte met behulp van confocale microscopie . iHCECs na 24 (A) en 48 (C) h groei met cellen variërend in grootte van 10 tot 20 μm. pHCECs na 24 (B) en 48 (D) h groei met cellen variërend in grootte van 20 tot 50 μm. 40x waterdoelstelling. Schaalstaven = 10 en 20 μm (A); 25 en 50 μm (B); 10 en 20 μm (C); 50 μm (D). Afkortingen: iHCECs = vereeuwigde menselijke cornea-epitheelcellen; pHCECs = primaire menselijke cornea-epitheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: 3D confocale beelden. 3D confocale beelden van pHCECs na 48 h groei (A) en iHCECs na 24 h (B). 40x water objectief. Afkortingen: iHCECs = vereeuwigde menselijke cornea-epitheelcellen; pHCECs = primaire menselijke cornea-epitheelcellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Effect van UV op primaire en vereeuwigde HCEC's
De metabole activiteit van zowel primaire als vereeuwigde HCEC's na blootstelling aan UV wordt weergegeven in figuur 3. De figuur toont genormaliseerde middelen uit testputten (quadruplicate putten, twee afzonderlijke experimenten). Vergeleken met de niet-UV-blootgestelde cellen was de metabole activiteit van bestraalde pHCECs significant verminderd bij 20 minuten blootstelling. Voor iHCECs nam de metabole activiteit af voor cellen die zowel na 5 als 20 minuten werden bestraald. Daarom duurde het langer voordat de blootstelling de metabole activiteit van de pHCECs verminderde dan de iHCECs.
Figuur 3: De metabole activiteit van pHCECs en iHCECs na blootstelling aan 5 en 20 min UV-straling . *p < 0,05 van de niet-UV-blootgestelde controle. De niet-UV-blootgestelde controle zijn cellen in putten die met de testmonsters zijn geïncubeerd, maar niet aan UV zijn blootgesteld. Y-as is procent ten opzichte van de metabole activiteit van de cellen die niet aan UV worden blootgesteld. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: iHCECs = vereeuwigde menselijke cornea-epitheelcellen; pHCECs = primaire menselijke cornea-epitheelcellen; UV = ultraviolet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het effect van UV-blootstelling op de afgifte van inflammatoire cytokines uit de HCEC's is weergegeven in figuur 4. De maximale cytokine-afgifte vond plaats op verschillende tijdstippen van UV-blootstelling voor de primaire en vereeuwigde HCEC's. De maximale cytokineafgifte door de iHCECs was bij 5 min UV-blootstelling. De cellen gaven significante niveaus (p < 0,05) van IL-1β, IL-6 en IL-8 vrij in vergelijking met de niet-UV-blootgestelde cellen. Bovendien trad er geen significante cytokine-afgifte op bij 20 min UV-blootstelling voor de iHCECs. De maximale cytokineafgifte voor pHCECs vond echter plaats na 20 minuten UV-blootstelling. Alle vier de cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8 en TNF-α) werden vrijgegeven op significante niveaus in vergelijking met de niet-UV-blootgestelde cellen. In termen van totale hoeveelheden vrijgegeven inflammatoire cytokines (pg / ml), gaven de pHCECs aanzienlijk meer IL-1β, IL-8 en TNF-α vrij dan de iHCECs, terwijl de iHCECs meer IL-6 vrijgaven.
Figuur 4: Cytokineafgifte door de pHCECs en iHCECs na blootstelling aan UV-straling in pg/ml. De vier gekwantificeerde pro-inflammatoire cytokines zijn IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) en TNF-α (D). *p < 0,05 van de niet-UV-blootgestelde controle. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: iHCECs = vereeuwigde menselijke cornea-epitheelcellen; pHCECs = primaire menselijke cornea-epitheelcellen; UV = ultraviolet; IL = interleukine; TNF-α = tumornecrosefactor alfa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Effecten van chemische toxines op primaire en vereeuwigde HCEC's
De procentuele vermindering van de metabole activiteit na blootstelling aan de drie oculaire toxines was vergelijkbaar tussen de pHCECs en iHCECs, zoals weergegeven in figuur 5. De figuur toont genormaliseerde middelen uit testputten (quadruplicate putten, twee afzonderlijke experimenten).
Figuur 5: De metabole activiteit van pHCECs en iHCECs na blootstelling aan drie oculaire toxines gedurende 5 en 15 min. *p < 0,05 van de controle. De niet-toxine-blootgestelde controle zijn cellen in putten geïncubeerd met de testmonsters, maar niet blootgesteld aan chemische toxines. Y-as is procent ten opzichte van de metabole activiteit van de cellen die niet zijn blootgesteld aan chemische toxines. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: iHCECs = vereeuwigde menselijke cornea-epitheelcellen; pHCECs = primaire menselijke cornea-epitheelcellen; BAK = benzalkoniumchloride; H2 O2 = waterstofperoxide; SDS = natriumdodecylsulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De hoeveelheden cytokines die door de pHCECs werden vrijgegeven, waren groter dan de hoeveelheden die door de iHCECs werden vrijgegeven. De afgifte van cytokine IL-6 werd het meest beïnvloed door blootstelling aan de drie chemicaliën (BAK 0,001%, H 2O2 0,01%, SDS 0,0025%, figuur 6). De figuur toont middelen (pg/ml) uit testputten (quadruplicate putten, twee afzonderlijke experimenten). Zowel pHCECs als iHCECs vertoonden een verandering in de afgifte van IL-6 na blootstelling aan alle drie de chemicaliën. BAK veroorzaakte een afname van de afgifte van IL-6 in vergelijking met de controle voor zowel primaire als onsterfelijke HCEC's, terwijl H 2 O2een toename veroorzaakte in de afgifte van IL-6 uit iHCECs en een afname in de afgifte van pHCECs.
Figuur 6: Cytokine release. Cytokineafgifte door de pHCECs en iHCECs na blootstelling aan drie oculaire toxines gedurende 5 en 15 minuten in pg/ml. De vier gekwantificeerde pro-inflammatoire cytokines zijn IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) en TNF-α (D). *p < 0,05 van het besturingselement. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Afkortingen: iHCECs = vereeuwigde menselijke cornea-epitheelcellen; pHCECs = primaire menselijke cornea-epitheelcellen; BAK = benzalkoniumchloride; H2 O2 = waterstofperoxide; SDS = natriumdodecylsulfaat; IL = interleukine; TNF-α = tumornecrosefactor alfa. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Effecten van verschillende concentraties BAK op de levensvatbaarheid van cellen
De effecten van de BAK-concentraties 0,001%, 0,005% en 0,01% gedurende 5 minuten op de levensvatbaarheid van iHCEC zijn weergegeven in figuur 7. BAK vertoonde weinig effect bij 0,001% voor zowel pHCECs als iHCECs. Zowel pHCECs als iHCECs waren significant beschadigd bij 0,005% en 0,01% van BAK. Bij 0,005% en 0,01% van BAK was de mate van ethidiumkleuring groter in iHCECs dan in pHCECs. Calceïne kleurt groen, ethidium kleurt rood en annexine V blauw (annexine V-kleur computer-aangepaste kleur voor betere visualisatie van het fluorescentiesignaal)
Figuur 7: Fluorescentiemicroscopische beelden van pHCECs en iHCECs blootgesteld aan verschillende concentraties BAK gedurende 5 min. Schaalstaven = 200 μm; 10x objectief. Afkortingen: iHCECs = vereeuwigde menselijke cornea-epitheelcellen; pHCECs = primaire menselijke cornea-epitheelcellen; BAK = benzalkoniumchloride. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Potentiële verschillen in het gebruik van twee soorten HCEC's werden beoordeeld. Cellen werden in hetzelfde medium (HOEM) geplaatst bij identieke concentraties cellen en vervolgens blootgesteld aan korte en lange perioden van UV-straling en drie oculaire toxines. Doses UV-straling en chemicaliën werden geselecteerd op basis van hun fysiologische effecten, die schadelijk genoeg waren voor de cellen om tussenliggende reacties te produceren die konden worden vergeleken. Blootstellingstijden van 5 en 20 min voor UV-straling en 5 en 15 min voor de geselecteerde doses BAK (0,001%), SDS (0,0025%) en H 2 O2(0,01%) waren ideale blootstellingstijden en concentraties die significant verschillende reacties vertoonden tussen de cellen en de onbehandelde controles.
HOEM is een serumvrij medium dat is geoptimaliseerd voor de kweek van HCEC's. HOEM ondersteunt de groei van zowel primaire als vereeuwigde cellen. De vereeuwigde cellijn die in dit onderzoek werd gebruikt, werd vereeuwigd met SV408. SV40-onsterfelijke cellen brengen oncogeneiwitten tot expressie die de progressie van de celcyclus kunnen bevorderen door te interfereren met Rb, p53 en pp2a17. Retinoblastoom (Rb) bindt aan en remt E2F-transcriptiefactoren, die, wanneer ze niet worden geremd, een cel in staat stellen vooruitgang te boeken in de celcyclus en18 te delen. Het molecuul p53 bindt ook aan transcriptiefactoren om de progressie van de celcyclus19 te regelen. De remming van een derde molecuul, pp2a20,21, bevordert ook cellulaire proliferatie 22. De expressie van SV40-oncogeneiwitten die Rb, p53 en pp2a17 remmen, kan bijdragen aan de verschillen in de respons van iHCECs versus pHCECs. De celgroottes van de twee soorten HCEC's waren ook verschillend, wat te wijten kan zijn aan deze oncogenremmende eiwitten omdat de vereeuwigde cellen worden gedwongen zich door deze moleculen te delen voordat de cellen de grote omvang van de primaire cellen bereiken.
Blootstelling van het hoornvlies aan UV-straling kan ernstige schade aan cornea-epitheelcellen veroorzaken. UV-straling kan reactieve zuurstofsoorten in de cel produceren, DNA en celmoleculen beschadigen en enzymprocessen verstoren23,24. UVB beschadigt direct DNA en UVA beschadigt DNA en andere cellulaire moleculen via de productie van reactieve zuurstofsoorten in de cel die vervolgens kunnen reageren met andere biomoleculen25,26. Deze UV-schade kan cytotoxiciteit en ontsteking veroorzaken als gevolg van de afgifte van inflammatoire cytokines uit de blootgestelde cellen 3,27. In deze studie waren vereeuwigde cellen gevoeliger voor UV-stralingseffecten op de metabole activiteit van cellen, omdat er na 5 minuten een daling was in de metabole activiteit van de vereeuwigde cellen, maar niet in de primaire cellijn. Verschillen in de afgifte van inflammatoire cytokines traden ook op tussen de pHCECs en iHCECs. pHCECs gaven meer IL-1β, IL-8 en TNF-α af dan iHCECs na 20 minuten UV-straling. Deze verschillen in cytokineafgifte kunnen verband houden met de verschillen tussen de celgrootte van primaire en vereeuwigde celculturen. Differentiële effecten in cytokineafgifte tussen primaire en onsterfelijke cellen zijn opgemerkt in een andere studie die de effecten van sigarettenrook op primaire en onsterfelijke cellijnen onderzocht28.
Om het potentieel van chemische toxines om oogirritatie te veroorzaken te modelleren, zijn verschillende celkweekmodellen ontwikkeld om de cytotoxiciteit van deze chemicaliën te beoordelen. Deze studie toonde aan dat oculaire toxines die intermediaire effecten hebben op HCEC's ongeveer dezelfde procentuele afname van metabole activiteit hebben voor zowel primaire als onsterfelijke HCEC's. De drie oculaire toxines veroorzaakten geen substantiële afgifte van de meeste inflammatoire cytokines in vergelijking met de onbehandelde controle. Dit artikel toont echter de gevoeligheid van deze methode bij het detecteren van baseline cytokineniveaus. Een andere methode voor het detecteren van cytokines uit onsterfelijke cellijnen is geëvalueerd en bleek niet in staat om baseline cytokineniveaus29 te detecteren. De microscopische beelden van bak-blootgestelde culturen toonden toxiciteit in zowel pHCECs als iHCECs bij de concentraties van 0,005% en 0,01% na 5 minuten blootstelling en 20 h herstel.
De kritieke stappen in dit protocol waren het selecteren van UV-doses en oculaire toxinedoses die resulteerden in intermediaire toxiciteit voor de cellen en ervoor zorgen dat elk type HCEC's in hetzelfde medium groeide. Hierdoor konden vergelijkingen worden gemaakt tussen de effecten van elke behandeling op de pHCECs en iHCECs. Wijzigingen van deze methode kunnen worden aangebracht in de tijd van blootstelling aan de toxische agentia. Het wordt echter aanbevolen om de blootstellingstijd dicht bij de in dit protocol geteste tijden te houden, omdat kortere tijdspunten mogelijk geen toxiciteit op de cellen vertonen. Een te lange blootstelling kan daarentegen te veel schade veroorzaken, zodat kleine verschillen in de toxiciteit van oculaire toxinen niet kunnen worden vergeleken met de schadelijke effecten van de in dit protocol beschreven testmiddelen.
Een van de voordelen van de vereeuwigde HCEC's ten opzichte van de primaire HCEC's is dat de onsterfelijke cellen lagere standaardafwijkingen hadden dan de primaire cellen voor metabole activiteit en cytokine-afgifte na blootstelling aan oculaire toxines. Dus, voor het beoordelen van de metabole activiteit en cytokine-afgifte na blootstelling, hebben de onsterfelijke cellen meer kans om fysiologische toxiciteit te detecteren dan primaire cellen. Zowel de primaire cellen als de onsterfelijke cellijn detecteerden significante effecten op metabole activiteit en cytokine-afgifte na UV-blootstelling, en beide detecteerden de toxiciteit van BAK na het kleuren van de cellen met fluorescentiekleurstoffen.
Naast de toxiciteitseindpunten die in dit onderzoek worden genoemd, kunnen andere eindpunten worden getest, waaronder effecten op tight junctions, celproliferatie, celmigratie en de afgifte van extra cytokines. Dit protocol evalueerde de effecten van toxische stoffen op de afgifte van vier inflammatoire cytokines, metabole activiteit en levensvatbaarheid van cellen met behulp van metingen voor celpermeabiliteit, esterase-activiteit en apoptose. Bovendien moeten in-vivotests, zoals oculaire irritatietests bij konijnen, worden opgenomen in een toxiciteitstestbatterij, aangezien in vitro toxiciteitstests geschikt zijn voor het beoordelen van het werkingsmechanisme van toxiciteit voor HCEC's. In vivo tests bij dieren zijn nodig om te bepalen of er andere immuun- en toxiciteitsmechanismen bestaan die niet in vitro kunnen worden gemodelleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur, Lyndon W. Jones, heeft de afgelopen 3 jaar, via CORE, onderzoeksondersteuning of lectoraat honoraria ontvangen van de volgende bedrijven: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J &J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage en Visioneering. Lyndon Jones is ook consultant en/of zit in een adviesraad voor Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis en Ophtecs. De andere auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs ontvingen geen financiering voor dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H.
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
