Summary
מאמר זה מתאר את ההליכים המשמשים להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים בקו תאים ראשוני ואימורטלי.
Abstract
מאמר זה מתאר את השיטות למדידת הרעילות של קרינה אולטרה סגולה (UV) ורעלנים עיניים על תרביות תאי אפיתל ראשוניים (pHCEC) ומונצחים (iHCEC). התאים נחשפו לקרינת UV ולמינונים רעילים של בנזלקוניום כלוריד (BAK), מי חמצן (H 2 O2) וסודיום דודציל סולפט (SDS). הפעילות המטבולית נמדדה באמצעות בדיקה מטבולית. שחרור ציטוקינים דלקתיים נמדד באמצעות אינטרלוקין רב-תכליתי (IL)-1β, IL-6, IL-8 ובדיקת גורם נמק גידולי אלפא (TNF-α), והתאים הוערכו לכדאיות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים.
ההשפעות המזיקות של UV על פעילות מטבולית של תאים ושחרור ציטוקינים התרחשו ב -5 דקות של חשיפה לקרינת UV עבור iHCEC ו -20 דקות עבור pHCEC. ירידות באחוזים דומים בפעילות המטבולית של iHCEC ו-pHCEC התרחשו לאחר חשיפה ל-BAK, H 2O2 או SDS, והשינויים המשמעותיים ביותר בשחרור ציטוקינים התרחשו עבור IL-6 ו-IL-8. מיקרוסקופיה של תאים שנחשפו ל-iHCEC ו-pHCEC שנחשפו ל-BAK עם כתמים פלואורסצנטיים הראתה מוות תאי בחשיפה של 0.005% ל-BAK, אם כי מידת צביעת האתידיום הייתה גדולה יותר ב-iHCEC מאשר ב-pHCECs. באמצעות שיטות מרובות להערכת השפעות רעילות באמצעות מיקרוסקופיה, הערכות של פעילות מטבולית וייצור ציטוקינים, ניתן לקבוע את הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים הן עבור קווי תאים ראשוניים והן עבור קווי תאים אימורטליים.
Introduction
מחקרי טוקסיקולוגיה חוץ גופית מבוצעים כדי לחזות את ההשפעות הרעילות של כימיקלים וחומרים אחרים שיכולים לגרום נזק לתאים. בהערכת רעילות לקרנית, תאי אפיתל של הקרנית האנושית (HCECs) שימשו במודלים להערכת השפעות אלה 1,2,3,4. מודלים אלה בדרך כלל מעריכים השפעות פיזיולוגיות כגון שינויים בפעילות המטבולית של התא, התפשטות תאים, ותפקודי תאים אחרים כגון ייצור ושחרור של ציטוקינים דלקתיים. עבור מחקרים טוקסיקולוגיים אלה, תאים ממקורות שונים נבחרו כדי להעריך את ההשפעות המזיקות של כימיקלים וקרינת UV על HCECs 2,3. קווי pHCEC זמינים מחברות המספקות תאים אלה מרקמות תורם של מבוגרים. תאים ראשוניים ניתן לטפל עם dispase בעדינות לגרד את הקרנית עבור תרבית5. התאים נבדקים לאחר מכן עבור וירוסים וזיהום ולאחר מכן נשלח cryopreserved ב 10% dimethyl sulfoxide.
היתרון של קווי תאים ראשוניים הוא שהתאים זהים גנטית לתאי התורם. זה אידיאלי, כמו מודל in vitro צריך לחקות את רקמת in vivo ככל האפשר. החיסרון של קווי תאים ראשוניים הוא שיש להם מספר מוגבל של חלוקות תאים או מעברים6. מספר התאים המוגבל הזמין מגביל את מספר הניסויים שניתן לבצע בתרבית ראשונית אחת, ומייקר את עלות הניסויים.
קווי תאים אימורטליים שימשו גם במודלים של רעילות תרביות תאים. עם זאת, בניגוד לקו התאים הראשוני המתקבל מרקמת in vivo, קו התאים האימורטלי השתנה גנטית. תאים אימורטליים נוצרים על ידי שילוב גנים של וירוס בדנ"א של תאים ראשוניים 6,7,8. תאים עם שילוב מוצלח של גנים נגיפיים נבחרים לקו התאים האימורטלי. היתרון של אימורטליזציה הוא שהיא מאפשרת התפשטות מהירה ללא הגבלת זמן, ומספקת מספר בלתי מוגבל של תאים לביצוע ניסויים מרובים באמצעות אותו קו תאים. זה מאפשר עקביות בין ניסויים ומפחית את העלות.
בנוסף לשינויים בגנים שהגבילו את התפשטות התאים, שינויים בביטוי גנים בעלי פונקציונליות קריטית יכולים להתרחש גם9. לכן, החיסרון בשימוש בתאים אימורטליים הוא שהם עשויים כבר לא לייצג את תאי in vivo המקוריים מבחינת התגובה שלהם לגירויים חיצוניים שונים10. ההשוואות כללו התבוננות בהשפעות הרעילות של כימיקלים על קרטוציטים ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית11, כמו גם HCECs אימורטליים ותאים ראשוניים של אפיתל קרנית ארנבת12. ההשוואה בין ההשפעות של רעלים על קרטוציטים אנושיים ראשוניים לבין קרטוציטים אלמותיים לא הראתה הבדלים משמעותיים11. באמצעות השיטות המפורטות במאמר זה, תיקבע היעילות של בדיקות אלה להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלני עיניים על pHCECs ו- iHCECs.
נבחרו שלושה רעלנים עיניים הנפוצים בבדיקות מבחנה: BAK, H 2 O2ו- SDS. BAK הוא חומר משמר קטיוני הנפוץ בתמיסות עיניים 13,14, H 2 O2משמש בדרך כלל לחיטוי עדשות מגע 15, ו-SDS הוא חומר פעילי שטח אניוני המצוי בדטרגנטים ושמפו 14. בדומה לרעלני עיניים, קרינת UV יכולה גם לגרום נזק משמעותי ל- HCECs3. בנוסף, חשיפת יתר לקרינת UV עלולה לגרום למצב עיני המכונה פוטוקרטיטיס המאופיין בתסמינים של קריעה, רגישות לאור ותחושת גרגריות16.
יש מספר בלתי מוגבל של תרביות תאים ראשוניות שניתן להשתמש בהן וקווי תאים אימורטליים שונים שפותחו. לכן, נערך מחקר כדי להשוות HCEC ראשוניים לקו HCEC אימורטלי כדי לקבוע דמיון והבדלים בין מודלים המשלבים סוגים אלה של תאים.
מחקר זה השתמש במיקרוסקופ כדי להעריך הבדלים אפשריים בין pHCECs ו- iHCECs על התגובה הפיזיולוגית של התא לקרינת UV ורעלנים. כמו כן נבדקו ההשפעות של קרינת UV וכימיקלים על הפעילות המטבולית של התא ושחרור ציטוקינים דלקתיים עבור שני קווי התא. החשיבות של קביעת ההבדלים בין שני קווי התאים היא להבין את השימוש המיטבי בקווי תאים אלה להערכה: 1) ההשפעה של קרינת UV על תאים, 2) ההשפעות של רעלים על תאים, 3) השינויים הנובעים מכך בחילוף החומרים, בכדאיות התא ובשחרור ציטוקינים בתאים למחקרים עתידיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תרבות של pHCECs ו- iHCECs
- לגדל את pHCECs ו- iHCECs בתווך אפיתל עיני אנושי (HOEM) עם התוספים הבאים: 6 mM L-גלוטמין, 0.002% תוסף מדיה התאית O (טבלה של חומרים), 1.0 μM אפינפרין, 0.4% תוסף מדיה התאית P (טבלה של חומרים), 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין rh, 5 מיקרוגרם / מ"ל apo-transferrin, ו 100 ng / mL הידרוקורטיזון hemisuccinate ב collagen-1 מצופה צלוחיות תרבית (18 מ"ל ב 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית).
- שנה את התווך בצלוחיות כל 2-3 ימים על ידי הסרת התווך לאחר שהתאים גדלים ל~ 80% מפגש. מוסיפים תמיסת דיסוציאציה ללא פנול אדום ודוגרים על הבקבוק בטמפרטורה של 37°C עד לניתוק מלא של התאים. נטרל את תמיסת הדיסוציאציה עם DMEM/F12 עם סרום ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים ב 500 × גרם. הסר את המדיום supernatant והשהה מחדש את התאים בתווך HOEM.
2. קביעת גודל התא באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
- זרעו הן pHCEC והן iHCECs על צלחות פטרי מצופות קולגן עם כיסויים בתחתית זכוכית בריכוז של 1 × 105 עם 1 מ"ל של HOEM. לגדל pHCECs ו- iHCECs, קבוצה אחת של תרבויות במשך 24 שעות וקבוצה אחרת של תרבויות במשך 48 שעות, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- לאחר תקופת הדגירה, יש להכתים את התאים בתמיסת חיץ צביעה של 500 μL המכילה קלצאין (4 מיקרומטר), אתידיום הומדימר-1 (8 מיקרומטר) ואקספין V (5 מיקרוליטר ב-500 מיקרוליטר חיץ אלקסה פלואור 647 מצומד) למשך 20 דקות ב-37°C. לאחר צביעת התאים, התאימו את המיקרוסקופ ללכידת אורכי גל עירור/פליטה של 488/515 ננומטר עבור calcein-AM, 543/600 ננומטר עבור ethidium homodimer-1, ו-633/665 ננומטר עבור annexin V באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
- השג את התמונות וצלם ערימות Z כדי להעריך את גודל התא בשלושה ממדים.
- כדי לקבל את התמונות הדו-ממדיות (2D) והתלת-ממדיות (3D), מצא את האזור לתמונה עם מטרת מים apochromat 40x/1.2. באמצעות לייזרים Argon (488) (סריקה ראשונה), HeNe1 (543) (סריקה שנייה ו-HeNe2 (633) (סריקה שלישית), סרוק בשלושה ערוצים נפרדים באמצעות מפצלי האלומה, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis ו-NFT 545 LP560, LP505.
- השתמש בסריקה רציפה מרובת רצועות כדי להפחית את הדיבור הצולב.
הערה: LP505 משמש עבור ערוץ 2 עם לייזר 488 כדי ללכוד את הפליטה של צבע calcein. LP560 משמש בערוץ 3 עם לייזר 543 כדי ללכוד את הפליטה של אתידיום הומודימר 1. NFT 635 משמש עם לייזר 633 כדי ללכוד את הפליטה של נספח V. מטרת ה- HFT היא להפריד את אור העירור והפליטה. NFT מפצל אור על ידי החזרת אור < אורך גל מסוים לערוץ נפרד, תוך מתן אפשרות לאור > אורך גל מסוים עד לערוץ שני. מסנני LP חוסמים אורכי גל קצרים יותר מאורך הגל שצוין ומאפשרים לאורכי הגל הארוכים יותר לעבור. - לתמונה בתלת-ממד, הגדירו את הקונפוקל ל-Z-stack וסרקו לפחות 20 מסגרות.
3. חשיפת תאים לקרינת UV
- זרעו את התאים ב 5 × 104/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות ודגרו ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 3 שעות. לאחר תקופת הדגירה, להפחית את נפח המדיום בבארות ל 300 μL. לאחר מכן, חשוף את התאים לקרינת UV (הן UVA ב 6.48 W/m 2 והן UVB ב 1.82 W/m2 כאשר צינורות UVA ו- UVB מופעלים באינקובטור בו זמנית) באינקובטור 37 ° C למשך 5 ו -20 דקות בניסויים נפרדים.
- לאחר קרינת UV, להוסיף 200 μL של HOEM טרי לכל באר לדגור במשך 20 שעות ב 37 ° C עם 5% CO2.
- לאחר הדגירה, לאסוף את התא supernatant בכל באר ולהעביר אותו לתוך סטרילי 2 מ"ל צינורות פוליפרופילן. להקפיא ב -80 ° C. כדי לקבוע את רמות הציטוקינים המשתחררים על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לקרינת על-סגול, השתמשו בבדיקת ציטוקינים מרובים ועקבו אחר הוראות הערכה כדי לכמת את ארבעת הציטוקינים הבאים: IL-6, IL-8, IL-1β ו-TNF-α.
- הוסף מגיב בדיקה מטבולית לתאים בבארות.
- הכן מגיב בדיקה מטבולית 10% ב- DMEM/F12. החלף את מדיום התרבית בכל באר עם 1 מ"ל של תמיסת הבדיקה המטבולית 10% ודגר ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 4 שעות.
- מדוד את הפלואורסצנטיות של כל תמיסה באמצעות קורא לוחות פלואורסצנטי באורכי גל עירור/פליטה של 530/590 ננומטר.
4. חשיפה של תאים לרעלים כימיים
- תאי זרע ב 5 × 104/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות לדגור ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 3 שעות. לאחר תקופת הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים ל -1 מ"ל של רעלים כימיים (BAK 0.001%, H 2 O20.01%, ו- SDS 0.0025% במי מלח חוצצי פוספט (PBS)) למשך 5 ו -15 דקות.
- לאחר חשיפה לרעלים הכימיים, להסיר את הרעלים מן הבארות, לשטוף עם 1 מ"ל של PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, בצע בדיקה מטבולית על ידי החלפת המדיום עם 1 מ"ל של תמיסת בדיקה מטבולית 10% ודגרה ב 37 ° C עם 5% CO2 במשך 4 שעות. מדוד את הפלואורסצנטיות באמצעות קורא לוחות רב-באר פלואורסצנטי באורכי גל עירור/פליטה של 530/590 ננומטר.
- מעבירים את הסופרנאטנטים של התא מהבארות לאחר הדגירה של 20 שעות לצינורות פוליפרופילן סטריליים נפרדים של 2 מ"ל ומקפיאים ב -80 מעלות צלזיוס. כמת ציטוקינים ששוחררו על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לכימיקלים. השתמש באותה פלטפורמת מולטיפלקס המשמשת להערכת הציטוקינים מהתאים שטופלו ב- UV. השתמש בבדיקת ציטוקינים מרובים בהתאם להוראות הערכה כדי לכמת את ארבעת הציטוקינים הבאים: IL-6, IL-8, IL-1β ו- TNF-α.
5. בדיקת תאים שנחשפו לריכוזים שונים של BAK
- זרע תאים ב 1 × 10 5/מ"ל של HOEM בכל באר של צלחת תרבית מצופה קולגן-1 24 בארות לדגור ב 37 ° C עם5% CO2 במשך 24 שעות. לאחר תקופת הדגירה, הסר את המדיום וחשף את התאים ל -1 מ"ל של רעלים כימיים (BAK 0.001%, BAK 0.005% ו- BAK 0.01% ב- PBS) למשך 5 דקות.
- לאחר החשיפה, להסיר את הרעלים הכימיים, לשטוף את הבארות עם 1 מ"ל של PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של HOEM לכל באר. לאחר 20 שעות של דגירה, יש לצבוע את התאים ב-500 μL של תמיסת חיץ צביעת אנקסין המכילה קלצאין (4 מיקרומטר), אתידיום הומודימר-1 (8 מיקרומטר) ואקספין V (5 מיקרוליטר ב-500 מיקרוליטר חיץ אלקסה פלואור 647 מצומד) למשך 20 דקות ב-37°C. כוונן את המיקרוסקופ למדידת עוצמות של צביעת נספח V, calcein AM ו-ethidium-1 באורכי גל עירור/פליטה של 630/675 ננומטר, 495/515 ננומטר ו-528/617 ננומטר, בהתאמה. דמיינו את התאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
6. ניתוח נתונים
- בצע בדיקת נורמליות ובדיקה לשונות שווה לפני ביצוע ניתוח שונות (ANOVA), Welch ANOVA או מבחן Kruskal-Wallis. השתמש במבחן הפוסט-הוק המתאים להשוואה בין כל קבוצה שנבדקה. הגדר p < 0.05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
גודל תא
HCECs הראשוניים והמונצחים הודגמו באמצעות שלושה צבעים פלואורסצנטיים, המשקפים שלושה שלבים שונים של קיום התא. תאים חיים הם ירוקים (calcein-AM), תאים מתים הם אדומים (ethidium homodimer-1), ותאים אפופטוטיים הם צהובים (annexin V-מחשב מותאם צבע עבור הדמיה טובה יותר של אות פלואורסצנטי). תאים חיים מכילים אסטראזות בציטופלסמה של התא וממירים קלצאין-AM לקלצאין. לתאים מתים יש קרומי תאים חדירים לאתידיום הומודימר-1. לתאים אפופטוטיים יש כתמים בקרום התא מכיוון שפוספטידיל-סרין מועבר לקרום החיצוני.
השוואה של גודל התאים עבור שני סוגי HCECs לאחר 24 ו-48 שעות של גדילה נעשתה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, כפי שמוצג באיור 1. ה-iHCECs (איור 1A) הם תאים קטנים יותר שגודלם נע בין 10 מיקרומטר ל-20 מיקרומטר, וה-pHCECs (איור 1B) נעים בין 20 מיקרומטר ל-50 מיקרומטר אחרי 24 שעות של גדילה. הבדלים דומים בטווח הגדלים נצפו עבור iHCECs (איור 1C) ו-pHCECs (איור 1D) לאחר 48 שעות של צמיחה. תמונות תלת-ממדיות של שני סוגי HCEC נעשו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 2A מראה pHCECs; איור 2B מראה iHCECs).
איור 1: השוואה של גודל תאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי . iHCECs לאחר 24 (A) ו 48 (C) h של צמיחה עם תאים נע בגודל של 10 עד 20 מיקרומטר. pHCECs לאחר 24 (B) ו 48 (D) h של צמיחה עם תאים בגודל נע בין 20 ל 50 מיקרומטר. 40x מטרת מים. פסי קנה מידה = 10 ו- 20 מיקרומטר (A); 25 ו 50 מיקרומטר (B); 10 ו 20 מיקרומטר (C); 50 מיקרומטר (D). קיצורים: iHCECs = תאי אפיתל קרנית אנושיים אימורטליים; pHCECs = תאי אפיתל ראשוניים של הקרנית האנושית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות. תמונות קונפוקליות תלת-ממדיות של pHCECs לאחר 48 שעות של צמיחה (A) ו-iHCECs לאחר 24 שעות (B). יעד מים פי 40. קיצורים: iHCECs = תאי אפיתל קרנית אנושיים אימורטליים; pHCECs = תאי אפיתל ראשוניים של הקרנית האנושית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
השפעת UV על HCEC ראשוני ומונצח
הפעילות המטבולית של HCEC ראשוניים ומונצחים לאחר חשיפה לקרינת UV מוצגת באיור 3. האיור מציג אמצעים מנורמלים מבארות בדיקה (בארות מרובעות, שני ניסויים נפרדים). בהשוואה לתאים שאינם חשופים לקרינת UV, הפעילות המטבולית של pHCECs מוקרנים הופחתה באופן משמעותי לאחר 20 דקות של חשיפה. עבור iHCECs, הפעילות המטבולית ירדה עבור תאים שהוקרנו הן 5 ו 20 דקות. לכן, לקח זמן חשיפה ארוך יותר כדי להפחית את הפעילות המטבולית של pHCECs מאשר iHCECs.
איור 3: הפעילות המטבולית של pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לקרינת על-סגול במשך 5 ו-20 דקות . *p < 0.05 של הבקרה שאינה חשופה לקרינת UV. הבקרה שאינה חשופה לקרינת UV הם תאים בבארות המודגרות עם דגימות הבדיקה אך אינם חשופים לקרינת UV. ציר Y הוא אחוז ביחס לפעילות המטבולית של התאים שאינם חשופים לקרינת UV. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: iHCECs = תאי אפיתל קרנית אנושיים אימורטליים; pHCECs = תאי אפיתל ראשוניים של הקרנית האנושית; UV = אולטרה סגול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
ההשפעה של חשיפה לקרינת על-סגול על שחרור ציטוקינים דלקתיים מה-HCECs מוצגת באיור 4. שחרור הציטוקינים המרבי התרחש בזמנים שונים של חשיפה לקרינת UV עבור HCEC הראשוניים והמונצחים. שחרור הציטוקינים המרבי על ידי iHCECs היה 5 דקות של חשיפה UV. התאים שחררו רמות משמעותיות (p < 0.05) של IL-1β, IL-6 ו- IL-8 בהשוואה לתאים שאינם חשופים לקרינת UV. יתר על כן, לא התרחש שחרור ציטוקינים משמעותי ב -20 דקות של חשיפה לקרינת UV עבור iHCECs. עם זאת, שחרור הציטוקינים המרבי עבור pHCECs התרחש לאחר 20 דקות של חשיפה לקרינת UV. כל ארבעת הציטוקינים (IL-1β, IL-6, IL-8 ו-TNF-α) שוחררו ברמות משמעותיות בהשוואה לתאים שאינם חשופים לקרינת UV. במונחים של הכמויות הכוללות של ציטוקינים דלקתיים ששוחררו (pg/mL), ה-pHCECs שחררו הרבה יותר IL-1β, IL-8 ו-TNF-α מאשר ה-iHCECs, בעוד שה-iHCECs שחררו יותר IL-6.
איור 4: שחרור ציטוקינים על-ידי pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לקרינת על-סגול ב-pg/mL. ארבעת הציטוקינים מעודדי דלקת שכומתו הם IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) ו-TNF-α (D). *p < 0.05 של הבקרה שאינה חשופה לקרינת UV. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: iHCECs = תאי אפיתל קרנית אנושיים אימורטליים; pHCECs = תאי אפיתל ראשוניים של הקרנית האנושית; UV = אולטרה סגול; IL = אינטרלוקין; TNF-α = גורם נמק הגידול אלפא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
השפעות של רעלים כימיים על HCECs ראשוניים ומונצחים
אחוז הירידה בפעילות המטבולית לאחר חשיפה לשלושת רעלני העין היה דומה בין pHCECs ו- iHCECs, כפי שניתן לראות באיור 5. האיור מציג אמצעים מנורמלים מבארות בדיקה (בארות מרובעות, שני ניסויים נפרדים).
איור 5: הפעילות המטבולית של pHCECs ו-iHCECs לאחר חשיפה לשלושה רעלני עיניים במשך 5 ו-15 דקות. *p < 0.05 של הביקורת. הבקרה שאינה חשופה לרעלים הם תאים בבארות המודגרות עם דגימות הבדיקה אך אינם חשופים לרעלים כימיים. ציר Y הוא אחוז ביחס לפעילות המטבולית של התאים שאינם חשופים לרעלים כימיים. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: iHCECs = תאי אפיתל קרנית אנושיים אימורטליים; pHCECs = תאי אפיתל ראשוניים של הקרנית האנושית; BAK = בנזלקוניום כלוריד; H2O2 = מי חמצן; SDS = סודיום דודציל סולפט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
כמויות הציטוקינים ששוחררו על-ידי ה-pHCECs היו גדולות יותר מהכמויות ששוחררו על-ידי ה-iHCECs. שחרור הציטוקין IL-6 הושפע הכי הרבה מחשיפה לשלושת הכימיקלים (BAK 0.001%, H 2 O20.01%, SDS 0.0025%, איור 6). האיור מציג אמצעים (pg/mL) מבארות בדיקה (בארות מרובעות, שני ניסויים נפרדים). גם pHCECs וגם iHCECs הראו שינוי בשחרור IL-6 לאחר חשיפה לכל שלושת הכימיקלים. BAK גרם לירידה בשחרור IL-6 בהשוואה לבקרה עבור HCECs ראשוניים ומונצחים כאחד, ואילו H 2 O2גרם לעלייה בשחרור IL-6 מ- iHCECs ולירידה בשחרור מ- pHCECs.
איור 6: שחרור ציטוקינים. שחרור ציטוקינים על ידי pHCECs ו- iHCECs לאחר חשיפה לשלושה רעלנים עיניים במשך 5 ו -15 דקות ב- pg/mL. ארבעת הציטוקינים מעודדי דלקת שכומתו הם IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) ו-TNF-α (D). *P < 0.05 של הפקד. קווי שגיאה מציינים סטיית תקן. קיצורים: iHCECs = תאי אפיתל קרנית אנושיים אימורטליים; pHCECs = תאי אפיתל ראשוניים של הקרנית האנושית; BAK = בנזלקוניום כלוריד; H2O2 = מי חמצן; SDS = סודיום דודציל סולפט; IL = אינטרלוקין; TNF-α = גורם נמק הגידול אלפא. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
השפעות ריכוזים שונים של BAK על כדאיות התא
ההשפעות של ריכוזי BAK 0.001%, 0.005% ו-0.01% במשך 5 דקות על כדאיות iHCEC מוצגות באיור 7. BAK הראה השפעה מועטה של 0.001% הן עבור pHCECs והן עבור iHCECs. גם pHCEC וגם iHCECs ניזוקו באופן משמעותי ב-0.005% וב-0.01% מה-BAK. ב-0.005% וב-0.01% מה-BAK, מידת צביעת האתידיום הייתה גדולה יותר ב-iHCEC מאשר ב-pHCEC. כתמי קלצין ירוקים, כתמי אתידיום אדומים וכחול V נספח (צבע מותאם למחשב בצבע V נספח להדמיה טובה יותר של אות הפלואורסצנטי)
איור 7: תמונות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות של pHCECs ו-iHCECs שנחשפו לריכוזים שונים של BAK במשך 5 דקות. פסי קנה מידה = 200 מיקרומטר; פי 10 מטרה. קיצורים: iHCECs = תאי אפיתל קרנית אנושיים אימורטליים; pHCECs = תאי אפיתל ראשוניים של הקרנית האנושית; BAK = בנזלקוניום כלוריד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הוערכו הבדלים פוטנציאליים בשימוש בשני סוגים של HCEC. התאים מוקמו באותו תווך (HOEM) בריכוזים זהים של תאים ולאחר מכן נחשפו לפרקי זמן קצרים וארוכים של קרינת UV ושלושה רעלנים עיניים. מינונים של קרינת UV וכימיקלים נבחרו על סמך ההשפעות הפיזיולוגיות שלהם, שהיו מזיקות מספיק לתאים כדי לייצר תגובות ביניים שניתן להשוות. זמני חשיפה של 5 ו-20 דקות לקרינת UV ו-5 ו-15 דקות למינונים שנבחרו של BAK (0.001%), SDS (0.0025%) ו-H 2 O2(0.01%) היו זמני חשיפה אידיאליים וריכוזים שהראו תגובות שונות באופן משמעותי בין התאים לבין קבוצת הביקורת שלא טופלה.
HOEM הוא מדיום ללא סרום הממוטב לתרבית של HCECs. HOEM תומך בצמיחה של תאים ראשוניים ואימורטליים כאחד. קו התאים המונצח ששימש בחקירה זו הונצח באמצעות SV408. תאים אימורטליים SV40 מבטאים חלבונים אונקוגנים שיכולים לקדם את התקדמות מחזור התא על ידי הפרעה ל-Rb, p53 ו-pp2a17. רטינובלסטומה (Rb) נקשרת ומעכבת גורמי שעתוק E2F, אשר, כאשר אינם מעוכבים, מאפשרים לתא להתקדם במחזור התא ולהתחלק18. המולקולה p53 נקשרת גם לגורמי שעתוק כדי לשלוט בהתקדמות מחזור התא19. עיכוב של מולקולה שלישית, pp2a 20,21, מקדם גם את התפשטות התא22. הביטוי של חלבונים אונקוגנים SV40 המעכבים Rb, p53 ו- pp2a17 עשוי לתרום להבדלים בתגובה של iHCECs לעומת pHCECs. גדלי התאים של שני סוגי HCEC היו גם הם שונים, מה שעשוי לנבוע מהחלבונים מעכבי האונקוגנים האלה מכיוון שהתאים האימורטליים נאלצים להתחלק על ידי מולקולות אלה לפני שהתאים מגיעים לגודל הגדול של התאים הראשוניים.
חשיפה לקרינת UV עלולה לגרום נזק חמור לתאי אפיתל בקרנית. קרינת UV יכולה לייצר מיני חמצן תגובתיים בתא, לפגוע בדנ"א ובמולקולות התא ולשבש תהליכי אנזימים23,24. UVB פוגע ישירות בדנ"א, ו-UVA פוגע בדנ"א ובמולקולות תאיות אחרות באמצעות ייצור מיני חמצן תגובתיים בתוך התא שיכולים להגיב עם ביומולקולות אחרות25,26. נזק UV זה יכול לגרום ציטוטוקסיות ודלקת עקב שחרור ציטוקינים דלקתיים מהתאים החשופים 3,27. במחקר זה, תאים אימורטליים היו רגישים יותר להשפעות קרינת UV על הפעילות המטבולית של התא, שכן חלה ירידה בפעילות המטבולית של התאים האימורטליים, אך לא בקו התאים הראשוני לאחר 5 דקות. הבדלים בשחרור ציטוקינים דלקתיים התרחשו גם בין pHCECs ו- iHCECs. pHCECs שחררו יותר IL-1β, IL-8 ו-TNF-α מאשר iHCECs לאחר 20 דקות של קרינת UV. הבדלים אלה בשחרור ציטוקינים עשויים להיות קשורים להבדלים בין גודל התא של תרביות תאים ראשוניות ואימורטליות. השפעות דיפרנציאליות בשחרור ציטוקינים בין תאים ראשוניים ואימורטליים נצפו במחקר אחר שבדק את ההשפעות של עשן סיגריות על קווי תאים ראשוניים ואימורטליים28.
כדי למדל את הפוטנציאל של רעלים כימיים לגרום לגירוי עיני, פותחו מודלים שונים של תרביות תאים כדי להעריך את ציטוטוקסיות של כימיקלים אלה. מחקר זה הראה כי לרעלנים עיניים שיש להם השפעות ביניים על HCECs יש בערך אותו אחוז ירידה בפעילות המטבולית עבור HCEC ראשוניים ומונצחים. שלושת הרעלנים העינים לא גרמו לשחרור משמעותי של רוב הציטוקינים הדלקתיים בהשוואה לקבוצת הביקורת שלא טופלה. עם זאת, מאמר זה מראה את הרגישות של שיטה זו בזיהוי רמות ציטוקינים בסיסיות. שיטה נוספת לאיתור ציטוקינים משורות תאים אימורטליים נבדקה ונמצאה לא מסוגלת לזהות רמות ציטוקינים בסיסיות29. התמונות המיקרוסקופיות של תרביות שנחשפו ל-BAK הראו רעילות הן ב-pHCEC והן ב-iHCECs בריכוזים של 0.005% ו-0.01% לאחר חשיפה של 5 דקות והתאוששות של 20 שעות.
השלבים הקריטיים בפרוטוקול זה היו בחירת מנות UV ומינונים של רעלן עיני שהביאו לרעילות ביניים לתאים והבטחה שכל סוג של HCEC גדל באותו תווך. זה איפשר לערוך השוואות בין ההשפעות של כל טיפול על pHCECs ו- iHCECs. שינויים בשיטה זו יכולים להתבצע בזמן החשיפה לחומרים הרעילים. עם זאת, מומלץ לשמור על זמן חשיפה קרוב לזמנים שנבדקו בפרוטוקול זה, שכן נקודות זמן קצרות יותר עשויות שלא להראות רעילות על התאים. לעומת זאת, חשיפה ארוכה מדי עלולה לגרום נזק רב מדי, כך שלא ניתן להשוות הבדלים קלים ברעילות של רעלני העין להשפעות המזיקות של גורמי הבדיקה המתוארים בפרוטוקול זה.
אחד היתרונות של HCECs אימורטליים על פני HCECs ראשוניים הוא שלתאים האימורטליים היו סטיות תקן נמוכות יותר מאשר התאים הראשוניים לפעילות מטבולית ושחרור ציטוקינים לאחר חשיפה לרעלני עיניים. לכן, לצורך הערכת הפעילות המטבולית ושחרור הציטוקינים לאחר החשיפה, התאים האימורטליים נוטים יותר לזהות רעילות פיזיולוגית מאשר תאים ראשוניים. הן התאים הראשוניים והן קו התאים האימורטלי זיהו השפעות משמעותיות על הפעילות המטבולית ושחרור ציטוקינים לאחר חשיפה לקרינת UV, ושניהם זיהו את הרעילות של BAK לאחר צביעת התאים בצבעים פלואורסצנטיים.
בנוסף לנקודות קצה רעילות שהוזכרו במחקר זה, ניתן לבדוק נקודות קצה אחרות, כולל השפעות על צמתים הדוקים, התפשטות תאים, נדידת תאים ושחרור ציטוקינים נוספים. פרוטוקול זה העריך את ההשפעות של חומרים רעילים על שחרור ארבעה ציטוקינים דלקתיים, פעילות מטבולית ויכולת קיום התא באמצעות מדידות לחדירות תאים, פעילות אסטראז ואפופטוזיס. בנוסף, בדיקות vivo, כגון בדיקת גירוי עיני ארנבת, צריכות להיכלל בסוללת בדיקת רעילות, שכן בדיקות רעילותi n vitro מתאימות להערכת מנגנון הפעולה של רעילות ל- HCECs. יש צורך בבדיקות In vivo בבעלי חיים כדי לקבוע אם קיימים מנגנוני חיסון ורעילות אחרים שלא ניתן למדל במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר, לינדון ו. ג'ונס, במהלך 3 השנים האחרונות, באמצעות CORE, קיבל תמיכה במחקר או הרצאות כבוד מהחברות הבאות: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage ו- Visioneering. לינדון ג'ונס הוא גם יועץ ו/או מכהן בוועדה מייעצת עבור Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis ו-Ophtecs. למחברים האחרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים לא קיבלו מימון לעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
- Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
- Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
- Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
- Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
- Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
- Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
- Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
- Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
- Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
- Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
- Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
- Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
- Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
- Muller, P. A., Vousden, K. H.
- Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
- Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
- Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
- Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
- Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
- Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
- Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
- Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
- Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
- Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).
