Summary
이 기사에서는 1차 및 불멸화 세포주에서 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 평가하는 데 사용되는 절차를 설명합니다.
Abstract
이 기사에서는 일차(pHCEC) 및 불멸화(iHCEC) 인간 각막 상피 세포 배양에서 자외선(UV) 방사선 및 안구 독소의 독성을 측정하는 방법을 설명합니다. 세포는 UV 방사선 및 독성 용량의 염화벤잘코늄(BAK), 과산화수소(H2O2) 및 황산나트륨(SDS)에 노출되었습니다. 대사 활성은 대사 분석을 이용하여 측정하였다. 염증성 사이토카인의 방출은 multi-plex interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 및 tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) assay를 이용하여 측정하였으며, 형광 염료를 이용하여 세포 생존율을 평가하였다.
세포 대사 활성 및 사이토카인 방출에 대한 UV의 손상 효과는 iHCEC에 대한 UV 노출 5분 및 pHCEC에 대한 UV 노출 20분에서 발생했습니다. iHCEC 및 pHCEC의 대사 활성의 유사한 퍼센트 감소는 BAK,H2O2, 또는 SDS에 노출된 후에 발생하였고, 사이토카인 방출의 가장 유의한 변화는 IL-6 및 IL-8에 대해 발생하였다. 형광으로 염색된 iHCEC 및 pHCEC BAK에 노출된 세포의 현미경은 0.005% BAK 노출에서 세포 사멸을 나타내었지만, 에티듐 염색의 정도는 pHCEC보다 iHCEC에서 더 컸습니다. 현미경을 사용하여 독성 효과를 평가하는 여러 방법, 대사 활성 평가 및 사이토카인 생산을 활용하여 UV 방사선 및 화학 독소의 독성을 1차 및 불멸화 세포주 모두에 대해 측정할 수 있습니다.
Introduction
체외 독성학 연구는 세포에 손상을 줄 수있는 화학 물질 및 기타 물질의 독성 영향을 예측하기 위해 수행됩니다. 각막에 대한 독성의 평가에서, 인간 각막 상피 세포 (HCECs)는 이들 효과를 평가하기 위한 모델에 사용되었다 1,2,3,4. 이러한 모델은 일반적으로 세포의 대사 활동, 세포 증식 및 염증성 사이토카인의 생성 및 방출과 같은 기타 세포 기능의 변화와 같은 생리학적 효과를 평가합니다. 이러한 독성학 연구를 위해 HCEC에 대한 화학 물질 및 UV 방사선의 손상 효과를 평가하기 위해 다양한 출처의 세포가 선택되었습니다 2,3. pHCEC 라인은 성인의 공여자 조직으로부터 이들 세포를 제공하는 회사로부터 입수가능하다. 일차 세포는 디스파아제로 처리하고 배양을 위해 각막을 부드럽게 긁어낼 수 있다5. 그런 다음 세포는 바이러스 및 오염에 대해 테스트한 다음 10% 디메틸 설폭사이드에 냉동 보존된 상태로 배송됩니다.
일차 세포주의 장점은 세포가 기증자의 세포와 유전적으로 동일하다는 것입니다. 이는 시험관내 모델이 생체 내 조직을 가능한 한 많이 모방해야 하기 때문에 이상적입니다. 일차 세포주의 단점은 세포 분열 또는 계대 수가 제한되어 있다는 것이다6. 사용 가능한 세포 수가 제한되어 단일 1차 배양으로 수행할 수 있는 실험 수가 제한되어 실험 비용이 증가합니다.
불멸화된 세포주는 또한 세포 배양 독성 모델에 사용되었습니다. 그러나 생체 내 조직에서 얻은 일차 세포주와 달리 불멸화 된 세포주는 유 전적으로 변형되었습니다. 불멸화 된 세포는 바이러스의 유전자를 일차 세포 6,7,8의 DNA에 통합함으로써 생성됩니다. 바이러스 유전자 결합에 성공한 세포는 불멸화된 세포주를 위해 선택됩니다. 불멸화의 장점은 무기한의 빠른 증식을 허용하여 동일한 세포주를 사용하여 여러 실험을 수행할 수 있는 무제한의 세포를 제공한다는 것입니다. 이를 통해 실험 간의 일관성을 유지하고 비용을 절감할 수 있습니다.
세포 증식을 제한하는 유전자의 변화 외에도 중요한 기능을 가진 유전자의 발현 변화도 발생할 수 있다9. 그러므로, 불멸화된 세포를 사용하는 것의 단점은 다양한 외부 자극에 대한 반응의 관점에서 더 이상 원래의 생체 내 세포를 나타내지 않을 수 있다는 것이다(10). 비교에는 일차 및 불멸화된 인간 각막 각막세포(human corneal keratocytes)11, 불멸화된 HCECs(HCECs)와 토끼 각막 상피 일차 세포(rabbit corneal epithelial primary cell)12에 대한 화학물질의 독성 영향을 관찰하는 것이 포함되었다. 일차 인간 각질세포와 불멸화된 각질세포에 대한 독소의 효과 간의 비교는 유의미한 차이를 나타내지 않았다11. 이 기사에 설명된 방법을 사용하여 pHCEC 및 iHCEC에 대한 UV 방사선 및 안구 독소의 독성을 평가하기 위한 이러한 분석의 효과를 결정할 것입니다.
시험관내 분석에서 통상적으로 사용되는 3개의 안구 독소를 선택하였다: BAK,H2O2, 및 SDS. BAK는 안과용 용액에 통상적으로 사용되는 양이온성 방부제(13,14)이고,H2O2는 콘택트렌즈(15)를 소독하는데 통상적으로 사용되며, SDS는 세제와 샴푸(14)에서 발견되는 음이온성 계면활성제이다. 안구 독소와 마찬가지로 자외선도 HCEC에 심각한 손상을 줄 수 있습니다3. 또한, 자외선에 과다 노출되면 찢어짐, 빛에 대한 민감성, 거친 느낌 등의 증상을 특징으로 하는 광각막염(photokeratitis)으로 알려진 안구 질환이 발생할 수 있다16.
사용할 수 있는 일차 세포 배양액은 무제한이며 다양한 불멸화 세포주가 개발되었습니다. 따라서 이러한 유형의 세포를 통합하는 모델 간의 유사점과 차이점을 결정하기 위해 1차 HCEC를 불멸화된 HCEC 계통과 비교하기 위한 조사가 수행되었습니다.
이 조사는 현미경을 사용하여 UV 및 독소에 대한 세포 생리학적 반응에 대한 pHCEC와 iHCEC 간의 가능한 차이를 평가했습니다. 두 세포주에 대한 세포 대사 활동 및 염증성 사이토카인 방출에 대한 UV 방사선 및 화학 물질의 영향도 평가되었습니다. 두 세포주 간의 차이를 결정하는 것의 중요성은 1) 세포에 대한 UV 방사선의 영향, 2) 세포에 대한 독소의 영향, 3) 향후 연구를 위해 대사, 세포 생존율 및 세포 사이토카인 방출에 대한 결과적인 변화를 평가하기 위해 이러한 세포주의 최적 사용을 이해하는 것입니다.
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Protocol
1. pHCEC 및 iHCEC의 배양
- 다음 보충제를 사용하여 인간 안구 상피 배지(HOEM)에서 pHCEC 및 iHCEC를 성장시킵니다: 6mM L-글루타민, 0.002% 세포 배지 보충제 O(재료 표), 1.0μM 에피네프린, 0.4% 세포 배지 보충제 P(재료 표), 콜라겐-1 코팅 배양 플라스크에서 5μg/mL rh 인슐린, 5μg/mL 아포-트랜스페린 및 100ng/mL 히드로코르티손 헤미숙시네이트(75cm2 배양 플라스크에서 18mL).
- 세포가 ~80% 합류점으로 성장한 후 배지를 제거하여 플라스크의 배지를 2-3일마다 교체합니다. 페놀 레드가 없는 해리 용액을 추가하고 세포가 완전히 분리될 때까지 플라스크를 37°C에서 배양합니다. DMEM/F12로 해리 용액을 혈청으로 중화한 다음 500× g에서 세포를 원심분리합니다. 상청액을 배지를 제거하고 HOEM 배지에서 세포를 재현탁합니다.
2. 컨포칼 현미경을 이용한 세포 크기 측정
- pHCEC와 iHCEC를 1mL의 HOEM과 함께 1 × 105 농도의 유리 바닥 커버슬립이 있는 콜라겐 코팅된 페트리 접시에 시드합니다. pHCECs 및 iHCECs를, 한 세트의 배양물을 24시간 동안 및 다른 세트의 배양물을 5%CO2의 37°C 인큐베이터에서 48시간 동안 성장시킨다.
- 배양 기간 후, 세포를 37°C에서 20분 동안 칼세인(4 μM), 에티듐 호모다이머-1(8 μM) 및 아넥신 V(500 μL 완충액-Alexa Fluor 647 접합체에 5 μL)를 포함하는 500 μL의 아넥신 염색 완충액으로 염색합니다. 세포를 염색한 후 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 칼세인-AM의 경우 488/515nm, 에티듐 호모다이머-1의 경우 543/600nm, 아넥신 V의 경우 633/665nm의 여기/방출 파장을 캡처하기 위해 현미경을 조정합니다.
- 이미지를 얻고 Z 스택을 사용하여 3차원에서 셀 크기를 평가합니다.
- 2차원(2D) 및 3차원(3D) 이미지를 획득하려면 아포크로맷 40x/1.2 물 대물렌즈로 이미징할 영역을 찾습니다. 아르곤 (488) (첫 번째 스캔), HeNe1 (543) (두 번째 스캔 및 HeNe2 (633) (세 번째 스캔) 레이저를 사용하여 빔 스플리터, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis 및 NFT 545 LP560, LP505를 사용하여 세 개의 개별 채널에서 스캔합니다.
- 다중 트랙 순차 스캔을 사용하여 누화를 줄입니다.
참고 : LP505는 칼세인 염료의 방출을 포착하기 위해 488 레이저와 함께 채널 2에 사용됩니다. LP560은 에티듐 호모다이머 1의 방출을 포착하기 위해 543 레이저와 함께 채널 3에서 사용됩니다. NFT 635는 633 레이저와 함께 사용되어 아넥신 V의 방출을 포착합니다. HFT의 목적은 여기광과 발광광을 분리하는 것입니다. NFT는 지정된 파장< 빛을 별도의 채널로 반사하고 지정된 파장> 두 번째 채널로 빛이 통과하도록 하여 빛을 분할합니다. LP 필터는 지정된 파장보다 짧은 파장을 차단하고 긴 파장을 통과시킵니다. - 3D로 이미지화하려면 공초점 렌즈를 Z 스택으로 설정하고 최소 20프레임을 스캔합니다.
3. 자외선에 대한 세포 노출
- 24-웰 콜라겐-1 코팅된 배양 플레이트의 각 웰에 5 × 104/mL의 HOEM에서 세포를 시딩하고 37°C에서 5%CO2 로 3시간 동안 배양합니다. 배양 기간 후, 웰 내의 배지의 부피를 300 μL로 감소시킨다. 다음으로, 세포를 UV 방사선(UVA 및 UVB 튜브가 동시에 인큐베이터에서 켜져 있기 때문에 6.48W/m2 의 UVA 및 1.82W/m2 의 UVB)에 별도의 실험에서 5분 및 20분 동안 37°C 인큐베이터에 노출시킵니다.
- UV 방사선 후, 200 μL의 신선한 HOEM을 각 웰에 첨가하고, 5%CO2와 함께 37°C에서 20시간 동안 인큐베이션한다.
- 배양 후, 각 웰에 세포 상청액을 모으고 멸균 된 2 mL 폴리 프로필렌 튜브로 옮긴다. -80 °C에서 동결. UV 노출 후 pHCEC 및 iHCEC에서 방출되는 사이토카인 수준을 측정하려면 다중 사이토카인 분석을 사용하고 키트의 지침에 따라 IL-6, IL-8, IL-1β 및 TNF-α의 4가지 사이토카인을 정량화합니다.
- 웰의 세포에 대사 분석 시약을 추가합니다.
- DMEM/F12에서 10% 대사 분석 시약을 준비합니다. 각 웰의 배양 배지를 10% 대사 분석 용액 1mL로 교체하고 37°C에서 4시간 동안 5%CO2 와 함께 인큐베이션합니다.
- 530/590 nm 여기/방출 파장에서 형광 플레이트 리더를 사용하여 각 용액의 형광을 측정합니다.
4. 화학 독소에 대한 세포 노출
- 종자 세포를 24-웰 콜라겐-1 코팅된 배양 플레이트의 각 웰에서 5 × 104/mL의 HOEM에서 3시간 동안 5%CO2와 함께 37°C에서 배양합니다. 배양 기간 후, 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 화학 독소 (BAK 0.001%, H2O2 0.01%, 및 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 SDS 0.0025%)에 5 및 15분 동안 노출시킨다.
- 화학 독소에 노출된 후 웰에서 독소를 제거하고 1mL의 PBS로 헹구고 1mL의 HOEM을 각 웰에 추가합니다. 20시간 배양 후, 배지를 10% 대사 분석 용액 1mL로 교체하고 37°C에서 5%CO2 로 4시간 동안 배양하여 대사 분석을 수행합니다. 530/590 nm 여기/방출 파장에서 형광 멀티웰 플레이트 리더를 사용하여 형광을 측정합니다.
- 20시간 인큐베이션한 후 웰에서 세포 상청액을 별도의 멸균 2 mL 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 -80°C에서 동결시킵니다. 화학 물질에 노출된 후 pHCEC 및 iHCEC에서 방출되는 사이토카인을 정량화합니다. UV 처리된 세포에서 사이토카인을 평가하는 데 사용되는 것과 동일한 멀티플렉스 플랫폼을 사용합니다. 키트의 지침에 따라 다중 사이토카인 분석을 사용하여 IL-6, IL-8, IL-1β 및 TNF-α의 4가지 사이토카인을 정량화합니다.
5. 다양한 농도의 BAK에 노출된 세포 검사
- 시드 세포를 24-웰 콜라겐-1 코팅된 배양 플레이트의 각 웰에서 1 × 10 5/mL의 HOEM에서 24시간 동안5%CO2 와 함께 37°C에서 배양합니다. 배양 기간 후, 배지를 제거하고, 세포를 1 mL의 화학 독소(BAK 0.001%, BAK 0.005%, 및 BAK 0.01% in PBS)에 5분 동안 노출시킨다.
- 노출 후 화학 독소를 제거하고 1mL의 PBS로 웰을 헹구고 각 웰에 1mL의 HOEM을 추가합니다. 20시간 배양 후 칼세인(4μM), 에티듐 호모다이머-1(8μM) 및 아넥신 V(500μL 완충액-Alexa Fluor 647 접합체에 5μL)가 포함된 500μL의 아넥신 염색 완충액으로 세포를 37°C에서 20분 동안 염색합니다. 현미경을 조정하여 각각 630/675nm, 495/515nm 및 528/617nm의 여기/방출 파장에서 annexin V, calcein AM 및 ethidium-1 염색의 강도를 측정합니다. 형광 현미경을 사용하여 세포 이미지
6. 데이터 분석
- 분산 분석(ANOVA), Welch ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 검정을 수행하기 전에 정규성 검정과 등분산 검정을 수행합니다. 테스트한 각 그룹을 비교하기 위해 적절한 사후 테스트를 사용합니다. p < 0.05로 설정합니다.
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Representative Results
셀 크기
1차 및 불멸화된 HCEC는 세포 생존력의 세 가지 다른 단계를 반영하는 세 가지 형광 염료로 시각화되었습니다. 살아있는 세포는 녹색(calcein-AM), 죽은 세포는 빨간색(ethidium homodimer-1), 세포사멸 세포는 노란색(형광 신호의 더 나은 시각화를 위해 annexin V-computer-adjusted color)입니다. 살아있는 세포는 세포 세포질에 에스테라아제를 포함하고 칼세인-AM을 칼세인으로 전환합니다. 죽은 세포에는 에티듐 호모다이머-1을 투과할 수 있는 세포막이 있습니다. 세포사멸 세포는 포스파티딜세린이 외막으로 전위됨에 따라 세포막에서 염색됩니다.
두 가지 유형의 HCEC에 대한 세포 크기 비교는 그림 1과 같이 24시간 및 48시간 성장 후 컨포칼 현미경을 사용하여 이루어졌습니다. iHCEC(그림 1A)는 10μm에서 20μm 범위의 더 작은 세포이고, pHCEC(그림 1B)는 24시간 성장 후 크기가 20μm에서 50μm 범위입니다. 48시간의 성장 후 iHCEC(도 1C) 및 pHCEC(도 1D)에 대해 크기 범위의 유사한 차이가 관찰되었다. 두 가지 유형의 HCEC의 3D 이미지는 공초점 현미경을 사용하여 만들어졌습니다(그림 2A 는 pHCEC를 보여줍니다. 도 2B 는 iHCECs)를 나타낸다.
그림 1: 컨포칼 현미경을 사용한 세포 크기 비교 . 24 (A) 및 48 (C) h 후의 iHCEC는 10 내지 20 μm 크기의 세포로 성장한다. 24 (B) 및 48 (D) h 후의 pHCEC는 20 내지 50 μm 크기의 세포로 성장한다. 40x 물 목표. 스케일 바 = 10 및 20 μm (A); 25 및 50 μm (B); 10 및 20 μm (C); 50 μm (D). 약어: iHCECs = 불멸화된 인간 각막 상피 세포; pHCECs = 일차 인간 각막 상피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 3D 컨포칼 이미지. 48시간 성장 후(A) 및 24시간 후 iHCEC의 3D 컨포칼 이미지(B). 40x 물 목표. 약어: iHCECs = 불멸화된 인간 각막 상피 세포; pHCECs = 일차 인간 각막 상피 세포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
UV가 1차 및 불멸화 HCEC에 미치는 영향
UV에 노출된 후 1차 HCEC와 불멸화된 HCEC의 대사 활성이 그림 3에 나와 있습니다. 이 그림은 테스트 웰 (4 중 웰, 2 개의 개별 실험)의 정규화 된 평균을 보여줍니다. 자외선에 노출되지 않은 세포와 비교하여, 조사된 pHCECs의 대사 활성은 노출 20분에 유의하게 감소하였다. iHCEC의 경우, 5분 및 20분 모두에서 조사된 세포에 대해 대사 활성이 감소했습니다. 따라서, iHCECs보다 pHCECs의 대사 활성을 감소시키는데 더 긴 노출 시간이 걸렸다.
그림 3: 자외선에 5분 및 20분 노출된 후 pHCEC 및 iHCEC의 대사 활성. *p< 자외선에 노출되지 않은 대조군의 0.05. UV에 노출되지 않은 대조군은 테스트 샘플과 함께 배양되었지만 UV에 노출되지 않은 웰의 세포입니다. Y축은 UV에 노출되지 않은 세포의 대사 활성에 대한 백분율입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어: iHCECs = 불멸화된 인간 각막 상피 세포; pHCECs = 일차 인간 각막 상피 세포; UV = 자외선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
HCECs로부터의 염증성 사이토카인의 방출에 대한 UV 노출의 영향은 도 4에 제시되어 있다. 최대 사이토카인 방출은 1차 및 불멸화된 HCEC에 대한 UV 노출의 상이한 시간에 발생하였다. iHCECs에 의한 최대 시토카인 방출은 UV 노출 5분이었다. 세포는 자외선에 노출되지 않은 세포에 비해 유의한 수준(p < 0.05)의 IL-1β, IL-6 및 IL-8을 방출하였다. 더욱이, iHCEC에 대한 UV 노출 20분에서 유의한 사이토카인 방출이 발생하지 않았습니다. 그러나, pHCEC에 대한 최대 사이토카인 방출은 UV 노출 20분에서 발생하였다. 모든 4개의 사이토카인(IL-1β, IL-6, IL-8 및 TNF-α)은 UV에 노출되지 않은 세포에 비해 유의한 수준으로 방출되었다. 방출된 염증성 사이토카인의 총량(pg/mL) 측면에서 pHCEC는 iHCEC보다 훨씬 더 많은 IL-1β, IL-8 및 TNF- α를 방출한 반면, iHCEC는 더 많은 IL-6을 방출했습니다.
그림 4: 자외선에 노출된 후 pHCEC 및 iHCEC에 의한 사이토카인 방출(pg/mL). 정량화된 4가지 전염증성 사이토카인은 IL-1β(A), IL-6(B), IL-8(C) 및 TNF-α(D)입니다. *p< 자외선에 노출되지 않은 대조군의 0.05입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어: iHCECs = 불멸화된 인간 각막 상피 세포; pHCECs = 일차 인간 각막 상피 세포; UV = 자외선; IL = 인터루킨; TNF-α = 종양 괴사 인자 알파. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
1차 및 불멸화 HCEC에 대한 화학 독소의 영향
세 가지 안구 독소에 노출된 후 대사 활성의 감소율은 그림 5에서 볼 수 있듯이 pHCEC와 iHCEC 간에 유사했습니다. 이 그림은 테스트 웰 (4 중 웰, 2 개의 개별 실험)의 정규화 된 평균을 보여줍니다.
그림 5: 5분 및 15분 동안 3개의 안구 독소에 노출된 후 pHCEC 및 iHCEC의 대사 활성. *p < 대조군의 0.05. 무독소에 노출된 대조군은 테스트 샘플과 함께 배양된 웰의 세포이지만 화학 독소에 노출되지 않습니다. Y축은 화학 독소에 노출되지 않은 세포의 대사 활성에 대한 백분율입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어: iHCECs = 불멸화된 인간 각막 상피 세포; pHCECs = 일차 인간 각막 상피 세포; BAK = 염화벤잘코늄; H2O2 = 과산화수소; SDS = 소듐 도데 실 설페이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
pHCEC에 의해 방출된 사이토카인의 양은 iHCEC에 의해 방출된 양보다 컸다. 사이토카인 IL-6의 방출은 세 가지 화학물질(BAK 0.001%,H2O2 0.01%, SDS 0.0025%, 도 6)에 대한 노출에 의해 가장 큰 영향을 받았다. 그림은 테스트 웰(4중 웰, 두 개의 개별 실험)의 평균(pg/mL)을 보여줍니다. pHCEC와 iHCEC 모두 세 가지 화학 물질에 모두 노출된 후 IL-6 방출의 변화를 보여주었습니다. BAK는 1차 및 불멸화된 HCEC 둘 다에 대해 대조군에 비해 IL-6의 방출을 감소시킨 반면,H2O2는 iHCEC로부터의 IL-6의 방출을 증가시키고 pHCEC로부터의 방출을 감소시켰다.
그림 6: 사이토카인 방출. pg/mL 단위로 5분 및 15분 동안 3개의 안구 독소에 노출된 후 pHCEC 및 iHCEC에 의한 사이토카인 방출. 정량화된 4가지 전염증성 사이토카인은 IL-1β(A), IL-6(B), IL-8(C) 및 TNF-α(D)입니다. *p< 컨트롤의 0.05입니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 약어: iHCECs = 불멸화된 인간 각막 상피 세포; pHCECs = 일차 인간 각막 상피 세포; BAK = 염화벤잘코늄; H2O2 = 과산화수소; SDS = 소듐 도데실 설페이트; IL = 인터루킨; TNF-α = 종양 괴사 인자 알파. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다양한 농도의 BAK가 세포 생존율에 미치는 영향
5분 동안 BAK 농도 0.001%, 0.005%, 및 0.01%가 iHCEC 생존율에 미치는 영향을 도 7에 나타내었다. BAK는 pHCEC와 iHCEC 모두에서 0.001%로 거의 효과를 나타내지 않았습니다. pHCEC와 iHCEC는 모두 BAK의 0.005%와 0.01%에서 유의하게 손상되었다. BAK의 0.005% 및 0.01%에서, 에티듐 염색의 정도는 pHCEC보다 iHCEC에서 더 컸다. Calcein은 녹색, ethidium은 빨간색, annexin V blue를 염색합니다(형광 신호의 더 나은 시각화를 위해 컴퓨터가 조정한 색상인 annexin V-color)
그림 7: 5분 동안 서로 다른 농도의 BAK에 노출된 pHCEC 및 iHCEC의 형광 현미경 이미지. 스케일 바 = 200 μm; 10배 목표. 약어: iHCECs = 불멸화된 인간 각막 상피 세포; pHCECs = 일차 인간 각막 상피 세포; BAK = 염화 벤잘 코늄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
두 가지 유형의 HCEC 사용의 잠재적 차이를 평가했습니다. 세포를 동일한 농도의 세포로 동일한 배지(HOEM)에 배치한 다음 단기간 및 장기간의 UV 방사선과 3개의 안구 독소에 노출시켰습니다. UV 방사선 및 화학 물질의 선량은 생리학적 효과에 따라 선택되었으며, 이는 비교할 수 있는 중간 반응을 생성하기에 세포에 충분히 손상을 입혔습니다. UV 방사선에 대해 5 및 20 분의 노출 시간 및 BAK (0.001 %), SDS (0.0025 %), 및H2O2(0.01 %)의 선택된 용량에 대해 5 및 15 분의 노출 시간은 세포와 처리되지 않은 대조군 사이에 유의하게 상이한 반응을 나타내는 이상적인 노출 시간 및 농도였다.
HOEM은 HCEC 배양에 최적화된 무혈청 배지입니다. HOEM은 일차 세포와 불멸화 세포의 성장을 지원합니다. 본 조사에 사용된 불멸화 세포주는 SV408을 사용하여 불멸화하였다. SV40-불멸화된 세포는 Rb, p53 및 pp2a를 방해하여 세포 주기 진행을 촉진할 수 있는 종양유전자 단백질을 발현한다17. 망막모세포종(Retinoblastoma, Rb)은 E2F 전사 인자에 결합하여 억제하는데, 억제되지 않을 경우 세포가 세포 주기에서 진행되어 분열할 수 있도록 한다18. 분자 p53은 또한 전사 인자에 결합하여 세포주기19의 진행을 조절합니다. 세 번째 분자인 pp2a(20,21)의 억제는 또한 세포 증식을 촉진한다 22. Rb, p53 및 pp2a를 억제하는 SV40 종양유전자 단백질의 발현17은 iHCEC 대 pHCEC의 반응 차이에 기여할 수 있습니다. 두 가지 유형의 HCEC의 세포 크기도 달랐는데, 이는 세포가 일차 세포의 큰 크기를 달성하기 전에 불멸화 세포가 이러한 분자에 의해 강제로 분열되기 때문에 이러한 종양 유전자 억제 단백질 때문일 수 있습니다.
각막이 자외선에 노출되면 각막 상피 세포에 심각한 손상을 줄 수 있습니다. 자외선은 세포에서 활성 산소 종을 생성하고 DNA와 세포 분자를 손상시키며 효소 과정을 방해할 수 있습니다23,24. UVB는 DNA를 직접 손상시키고, UVA는 세포 내에서 다른 생체 분자와 반응할 수 있는 활성 산소 종의 생성을 통해 DNA 및 기타 세포 분자를 손상시킵니다25,26. 이러한 자외선 손상은 노출된 세포로부터 염증성 사이토카인의 방출로 인해 세포독성 및 염증을 유발할 수 있다 3,27. 이 연구에서, 불멸화 된 세포는 세포 대사 활성에 대한 자외선 효과에 더 민감했는데, 이는 불멸화 된 세포의 대사 활성이 감소했지만 5 분 후에 일차 세포주에서는 감소하지 않았기 때문입니다. 염증성 사이토카인 방출의 차이 또한 pHCECs 및 iHCECs 사이에서 발생하였다. pHCEC는 자외선 20분 후에 iHCEC보다 더 많은 IL-1β, IL-8 및 TNF-α를 방출했습니다. 사이토카인 방출의 이러한 차이는 일차 세포 배양과 불멸화 세포 배양의 세포 크기 간의 차이와 관련이 있을 수 있습니다. 일차 세포와 불멸화 세포 사이의 사이토카인 방출의 차별적 효과는 담배 연기가 일차 세포주와 불멸화 세포주에 미치는 영향을 조사한 또 다른 연구에서 나타났습니다28.
안구 자극을 유발하는 화학 독소의 가능성을 모델링하기 위해 이러한 화학 물질의 세포 독성을 평가하기 위해 다양한 세포 배양 모델이 개발되었습니다. 이 연구는 HCEC에 중간 효과가 있는 안구 독소가 1차 HCEC와 불멸화 HCEC 모두에 대해 대사 활성이 거의 동일한 비율로 감소한다는 것을 보여주었습니다. 3개의 안구 독소는 처리되지 않은 대조군에 비해 대부분의 염증성 사이토카인의 실질적인 방출을 일으키지 않았다. 그러나 이 논문은 기준선 사이토카인 수준을 검출하는 데 있어 이 방법의 민감도를 보여줍니다. 불멸화된 세포주로부터 사이토카인을 검출하기 위한 또 다른 방법이 평가되었으며, 기준선 사이토카인 수준을 검출할 수 없는 것으로 밝혀졌다29. BAK에 노출된 배양액의 현미경 이미지는 5분 노출 및 20시간 회복 후 0.005% 및 0.01% 농도에서 pHCEC 및 iHCEC 모두에서 독성을 나타냈습니다.
이 프로토콜의 중요한 단계는 세포에 중간 독성을 초래하는 UV 선량과 안구 독소 선량을 선택하고 각 유형의 HCEC가 동일한 배지에서 성장하도록 하는 것이었습니다. 이를 통해 pHCEC와 iHCEC에 대한 각 치료의 효과를 비교할 수 있었습니다. 이 방법의 변형은 독성 물질에 노출 될 때 이루어질 수 있습니다. 그러나 노출 시간을 이 프로토콜에서 테스트한 시간에 가깝게 유지하는 것이 좋으며, 더 짧은 시점은 세포에 독성을 나타내지 않을 수 있습니다. 대조적으로, 너무 오래 노출되면 너무 많은 손상이 발생할 수 있으므로 안구 독소 독성의 사소한 차이를 이 프로토콜에 설명된 테스트 에이전트의 손상 효과와 비교할 수 없습니다.
1차 HCEC에 비해 불멸화된 HCEC의 장점 중 하나는 불멸화된 세포가 안구 독소에 노출된 후 대사 활성 및 사이토카인 방출에 대해 1차 세포보다 표준 편차가 낮다는 것입니다. 따라서, 노출 후 대사 활성 및 사이토카인 방출을 평가하기 위해, 불멸화된 세포는 일차 세포보다 생리학적 독성을 검출할 가능성이 더 높다. 일차 세포와 불멸화 세포주 모두 UV 노출 후 대사 활성 및 사이토카인 방출에 유의한 영향을 감지했으며, 형광 염료로 세포를 염색한 후 BAK의 독성을 모두 검출했습니다.
이 조사에서 언급된 독성 종점 외에도 밀착 접합, 세포 증식, 세포 이동 및 추가 사이토카인 방출에 대한 영향을 포함하여 다른 종점을 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 투과성, 에스테라아제 활성 및 세포자멸사에 대한 측정을 사용하여 4가지 염증성 사이토카인의 방출, 대사 활성 및 세포 생존율에 대한 독성 물질의 영향을 평가했습니다. 또한, 체외 독성 시험은 HCEC에 대한 독성의 작용 메커니즘을 평가하는 데 적합하기 때문에 토끼 안구 자극 시험과 같은 생체내 시험은 독성 시험 배터리에 포함되어야 합니다. 시험관 내에서 모델링할 수 없는 다른 면역 및 독성 메커니즘이 존재하는지 확인하기 위해 동물에 대한 생체 내 테스트가 필요합니다.
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Disclosures
저자인 Lyndon W. Jones는 지난 3년 동안 CORE를 통해 Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage 및 Visioneering으로부터 연구 지원 또는 강의 명예를 받았습니다. Lyndon Jones는 Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis 및 Ophtecs의 컨설턴트 및/또는 자문 위원회에서 활동하고 있습니다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 이 작업에 대한 자금을 받지 못했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
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