Summary
Este artigo descreve os procedimentos utilizados para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas em uma linhagem celular primária e imortalizada.
Abstract
Este artigo descreve os métodos de medição da toxicidade da radiação ultravioleta (UV) e toxinas oculares em culturas de células epiteliais primárias (pHCEC) e imortalizadas (iHCEC). As células foram expostas à radiação UV e a doses tóxicas de cloreto de benzalcônio (BAK), peróxido de hidrogênio (H 2O2) e dodecil sulfato de sódio (SDS). A atividade metabólica foi medida por meio de um ensaio metabólico. A liberação de citocinas inflamatórias foi medida usando um ensaio multiplex de interleucina (IL)-1β, IL-6, IL-8 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), e as células foram avaliadas quanto à viabilidade usando corantes fluorescentes.
Os efeitos prejudiciais dos UV sobre a atividade metabólica celular e liberação de citocinas ocorreram em 5 min de exposição UV para iHCEC e 20 min para pHCEC. Quedas percentuais semelhantes na atividade metabólica do iHCEC e pHCEC ocorreram após a exposição a BAK, H 2 O2ou SDS, e as mudanças mais significativas na liberação de citocinas ocorreram para IL-6 e IL-8. A microscopia das células iHCEC e pHCEC expostas a BAK, coradas fluorescentemente, mostrou morte celular com 0,005% de exposição a BAK, embora o grau de coloração de etídio tenha sido maior nos iHCECs do que nos pHCECs. Utilizando múltiplos métodos de avaliação de efeitos tóxicos usando microscopia, avaliações da atividade metabólica e produção de citocinas, a toxicidade da radiação UV e toxinas químicas pôde ser determinada tanto para linhagens celulares primárias quanto imortalizadas.
Introduction
Estudos toxicológicos in vitro são realizados para prever os efeitos tóxicos de produtos químicos e outros agentes que podem causar danos às células. Na avaliação da toxicidade para a córnea, células epiteliais corneanas humanas (HCECs) têm sido utilizadas em modelos para avaliação desses efeitos 1,2,3,4. Esses modelos tipicamente avaliam efeitos fisiológicos, como alterações na atividade metabólica da célula, proliferação celular e outras funções celulares, como a produção e liberação de citocinas inflamatórias. Para esses estudos toxicológicos, células de várias fontes foram selecionadas para avaliar os efeitos nocivos de produtos químicos e radiação UV sobre HCECs 2,3. As linhas pHCEC estão disponíveis em empresas que fornecem essas células a partir de tecidos de doadores de adultos. As células primárias podem ser tratadas com dispase e raspadas suavemente da córnea para cultura5. As células são então testadas para vírus e contaminação e, em seguida, enviadas criopreservadas em 10% de dimetil sulfóxido.
A vantagem das linhagens celulares primárias é que as células são geneticamente idênticas às células do doador. Isso é ideal, pois um modelo in vitro deve mimetizar o tecido in vivo tanto quanto possível. A desvantagem das linhagens celulares primárias é que elas têm um número limitado de divisões ou passagens celulares6. O número limitado de células disponíveis restringe o número de experimentos que podem ser conduzidos com uma única cultura primária, aumentando o custo dos experimentos.
Linhagens celulares imortalizadas também têm sido utilizadas em modelos de toxicidade em cultura celular. No entanto, ao contrário da linhagem celular primária obtida do tecido in vivo, a linhagem celular imortalizada foi geneticamente alterada. As células imortalizadas são criadas pela incorporação dos genes de um vírus ao DNA das células primárias6,7,8. Células com incorporação gênica viral bem-sucedida são selecionadas para a linhagem celular imortalizada. A vantagem da imortalização é que ela permite uma proliferação rápida indefinida, fornecendo um número ilimitado de células para realizar vários experimentos usando a mesma linhagem celular. Isso permite a consistência entre os experimentos e reduz o custo.
Além de alterações nos genes que limitavam a proliferação celular, alterações na expressão de genes de funcionalidade crítica também poderiamocorrer9. Portanto, a desvantagem do uso de células imortalizadas é que elas podem não mais representar as células originais in vivo em termos de resposta a vários estímulos externos10. Comparações envolveram a observação dos efeitos tóxicos de substâncias químicas sobre queratócitos corneanos humanos primários e imortalizados11, bem como HCECs imortalizados e células primárias epiteliais da córnea de coelhos12. A comparação entre os efeitos das toxinas sobre queratócitos humanos primários e queratócitos imortalizados não mostrou diferençassignificativas11. Usando os métodos detalhados neste artigo, a eficácia destes ensaios para avaliar a toxicidade da radiação UV e toxinas oculares sobre pHCECs e iHCECs será determinada.
Três toxinas oculares comumente utilizadas em ensaios in vitro foram selecionadas: BAK, H 2 O2e SDS. O BAK é um conservante catiônico comumente usado em soluções oftálmicas13,14, o H 2 O2 é comumente usado para desinfetar lentes de contato 15 e o SDS é um surfactante aniônico encontrado em detergentes e xampus 14. Assim como as toxinas oculares, a radiação UV também pode causar danos significativos aos HCECs3. Além disso, a superexposição aos raios UV pode causar uma condição ocular conhecida como fotoceratite, caracterizada por sintomas de lacrimejamento, sensibilidade à luz e sensação de arenosidade16.
Há um número ilimitado de culturas de células primárias que podem ser usadas e várias linhagens celulares imortalizadas que foram desenvolvidas. Portanto, uma investigação foi realizada para comparar HCECs primários com uma linhagem imortalizada de HCEC para determinar semelhanças e diferenças entre modelos que incorporam esses tipos de células.
Esta investigação utilizou microscopia para avaliar possíveis diferenças entre pHCECs e iHCECs na resposta fisiológica celular a UV e toxinas. Os efeitos da radiação UV e de produtos químicos sobre a atividade metabólica celular e liberação de citocinas inflamatórias para as duas linhagens celulares também foram avaliados. A importância de determinar as diferenças entre as duas linhagens celulares é entender o uso ideal dessas linhagens celulares para avaliar: 1) o efeito da radiação UV nas células, 2) os efeitos das toxinas nas células e 3) as alterações resultantes no metabolismo, viabilidade celular e liberação de citocinas celulares para estudos futuros.
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Protocol
1. Cultura de pHCECs e iHCECs
- Cultivar os pHCECs e iHCECs em meio epitelial ocular humano (HOEM) com os seguintes suplementos: 6 mM L-glutamina, 0,002% suplemento de meio celular O (Tabela de Materiais), 1,0 μM de epinefrina, 0,4% de suplemento de mídia celular P (Tabela de Materiais), 5 μg/mL de insulina rh, 5 μg/mL de apo-transferrina e 100 ng/mL de hidrocortisona hemisuccinato em frascos de cultura revestidos com colágeno-1 (18 mL em um frasco de cultura de 75 cm2 ).
- Troque o meio nos frascos a cada 2-3 dias, removendo o meio depois que as células crescerem até ~80% de confluência. Adicionar solução de dissociação sem vermelho de fenol e incubar o balão a 37 °C até que as células estejam completamente separadas. Neutralizar a solução de dissociação com DMEM/F12 com soro e, em seguida, centrifugar as células a 500 × g. Remova o meio sobrenadante e ressuspenda as células em meio HOEM.
2. Determinação do tamanho celular por microscopia confocal
- Semeando tanto pHCECs quanto iHCECs em placas de Petri revestidas de colágeno com lamínulas de fundo de vidro na concentração de 1 × 105 com 1 mL de HOEM. Cultivar pHCECs e iHCECs, um conjunto de culturas por 24 horas e outro conjunto de culturas por 48 h, em estufa a 37 °C com 5% de CO2.
- Após o período de incubação, corar as células com 500 μL de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína (4 μM), homodímero de etídio-1 (8 μM) e anexina V (5 μL em 500 μL de tampão Alexa Fluor 647 conjugado) por 20 min a 37 °C. Após a coloração das células, ajustar o microscópio para capturar os comprimentos de onda de excitação/emissão de 488/515 nm para calceína-AM, 543/600 nm para homodímero de etídio-1 e 633/665 nm para anexina V usando um microscópio confocal de varredura a laser.
- Obtenha as imagens e pegue pilhas Z para avaliar o tamanho da célula em três dimensões.
- Para adquirir as imagens bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D), encontre a área a ser fotografada com uma objetiva de água apócromática 40x/1.2. Com os lasers Argônio (488) (primeira varredura), HeNe1 (543) (segunda varredura e HeNe2 (633) (terceira varredura), digitalize em três canais separados usando os divisores de feixe, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis, e NFT 545 LP560, LP505.
- Use a varredura sequencial de várias faixas para reduzir o crosstalk.
NOTA: LP505 é usado para o canal 2 com o laser 488 para capturar a emissão do corante de calceína. A LP560 é utilizada no canal 3 com o laser 543 para captar a emissão do homodímero de etídio 1. NFT 635 é usado com o laser 633 para capturar a emissão da anexina V. O objetivo do HFT é separar a excitação e a emissão de luz. O NFT divide a luz refletindo a luz < comprimento de onda especificado para um canal separado, deixando a luz > um comprimento de onda especificado até um segundo canal. Os filtros LP bloqueiam comprimentos de onda mais curtos do que o comprimento de onda especificado e deixam passar os comprimentos de onda mais longos. - Para criar imagens em 3D, defina o confocal como Z-stack e digitalize pelo menos 20 quadros.
3. Exposição das células à radiação UV
- Semeando as células a 5 × 104/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubar a 37 °C com 5% de CO2 por 3 h. Após o período de incubação, reduzir o volume do meio nos poços para 300 μL. Em seguida, exponha as células à radiação UV (UVA a 6,48 W/m 2 e UVB a 1,82 W/m2, pois os tubos UVA e UVB são ligados na incubadora ao mesmo tempo) em uma incubadora de 37 °C por 5 e 20 minutos em experimentos separados.
- Após a radiação UV, adicionar 200 μL de HOEM fresco a cada poço e incubar durante 20 h a 37 °C com 5% de CO2.
- Após a incubação, coletar o sobrenadante celular em cada poço e transferi-lo para tubos estéreis de polipropileno de 2 mL. Congelar a -80 °C. Para determinar os níveis de citocinas liberados pelos pHCECs e iHCECs após exposição aos raios UV, use um ensaio de citocinas multiplex e siga as instruções do kit para quantificar as quatro citocinas a seguir: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.
- Adicionar reagente de ensaio metabólico às células dos poços.
- Preparar reagente de ensaio metabólico a 10% em DMEM/F12. Substitua o meio de cultura em cada poço por 1 mL da solução de ensaio metabólico a 10% e incube a 37 °C com CO2 a 5% por 4 h.
- Medir a fluorescência de cada solução usando um leitor de placas fluorescentes em comprimentos de onda de excitação/emissão de 530/590 nm.
4. Exposição das células a toxinas químicas
- Células de sementes a 5 × 104/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubam a 37 °C com 5% de CO2 por 3 h. Após o período de incubação, retirar o meio e expor as células a 1 mL de toxinas químicas (BAK 0,001%, H 2O2 0,01% e SDS 0,0025% em solução salina tamponada com fosfato (PBS)) por 5 e 15 min.
- Após a exposição às toxinas químicas, remova as toxinas dos poços, enxágue com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de HOEM a cada poço. Após 20 h de incubação, realizar um ensaio metabólico substituindo o meio com 1 mL de uma solução de ensaio metabólico a 10% e incubando a 37 °C com CO2 a 5% por 4 h. Meça a fluorescência usando um leitor de placas multipoços de fluorescência em comprimentos de onda de excitação/emissão de 530/590 nm.
- Transferir os sobrenadantes celulares dos poços após a incubação de 20 h para tubos de polipropileno estéreis separados de 2 mL e congelar a -80 °C. Quantificar as citocinas liberadas pelos pHCECs e iHCECs após a exposição aos produtos químicos. Use a mesma plataforma multiplex usada para avaliar as citocinas das células tratadas com UV. Use um ensaio de citocinas multiplex seguindo as instruções do kit para quantificar as quatro citocinas a seguir: IL-6, IL-8, IL-1β e TNF-α.
5. Exame de células expostas a várias concentrações de BAK
- Células de sementes a 1 × 10 5/mL de HOEM em cada poço de uma placa de cultura revestida com colágeno-1 de 24 poços e incubar a 37 °C com5% de CO2 por 24 h. Após o período de incubação, retirar o meio e expor as células a 1 mL de toxinas químicas (BAK 0,001%, BAK 0,005% e BAK 0,01% em PBS) por 5 min.
- Após a exposição, remova as toxinas químicas, lave os poços com 1 mL de PBS e adicione 1 mL de HOEM a cada poço. Após 20 h de incubação, corar as células com 500 μL de solução tampão de coloração de anexina contendo calceína (4 μM), homodímero de etídio-1 (8 μM) e anexina V (5 μL em 500 μL de tampão Alexa Fluor 647 conjugado) por 20 min a 37 °C. Ajustar o microscópio para medir intensidades de coloração de anexina V, calceína AM e etídio-1 nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 630/675 nm, 495/515 nm e 528/617 nm, respectivamente. Imagem das células usando o microscópio de fluorescência
6. Análise dos dados
- Realizar um teste de normalidade e um teste para variâncias iguais antes de realizar uma análise de variância (ANOVA), ANOVA de Welch ou teste de Kruskal-Wallis. Use o teste post-hoc apropriado para comparar cada grupo testado. Definir p < 0,05.
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Representative Results
Tamanho da célula
Os HCECs primários e imortalizados foram visualizados com três corantes fluorescentes, que refletem três diferentes estágios de viabilidade celular. As células vivas são verdes (calceína-AM), as células mortas são vermelhas (homodímero etídio-1) e as células apoptóticas são amarelas (anexina V - cor ajustada por computador para melhor visualização do sinal de fluorescência). As células vivas contêm esterases no citoplasma celular e convertem calceína-AM em calceína. As células mortas possuem membranas celulares permeáveis ao homodímero etídio-1. As células apoptóticas têm coloração na membrana celular como fosfatidilserina é translocada para a membrana externa.
A comparação do tamanho celular para os dois tipos de HCECs após 24 e 48 h de crescimento foi feita usando microscopia confocal, como mostrado na Figura 1. Os iHCECs (Figura 1A) são células menores que variam de 10 μm a 20 μm, e os pHCECs (Figura 1B) variam em tamanho de 20 μm a 50 μm após 24 h de crescimento. Diferenças semelhantes na faixa de tamanho foram observadas para iHCECs (Figura 1C) e pHCECs (Figura 1D) após 48 h de crescimento. Imagens 3D dos dois tipos de HCECs foram feitas usando microscopia confocal (Figura 2A mostra pHCECs; A Figura 2B mostra os iHCECs).
Figura 1: Comparação do tamanho celular usando microscopia confocal . iHCECs após 24 (A) e 48 (C) h de crescimento com células variando em tamanho de 10 a 20 μm. pHCECs após 24 (B) e 48 (D) h de crescimento com células variando em tamanho de 20 a 50 μm. Objetiva de água de 40x. Barras de escala = 10 e 20 μm (A); 25 e 50 μm (B); 10 e 20 μm (C); 50 μm (D). Abreviações: iHCECs = células epiteliais humanas imortalizadas da córnea; pHCECs = células epiteliais primárias da córnea humana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens confocais 3D. Imagens confocais 3D de pHCECs após 48 h de crescimento (A) e iHCECs após 24 h (B). Objetivo de água 40x. Abreviações: iHCECs = células epiteliais humanas imortalizadas da córnea; pHCECs = células epiteliais primárias da córnea humana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Efeito do UV em HCECs primários e imortalizados
A atividade metabólica dos HCECs primários e imortalizados após a exposição aos raios UV é mostrada na Figura 3. A figura mostra as médias normalizadas dos poços de teste (poços quádruplos, dois experimentos separados). Em comparação com as células não expostas aos raios UV, a atividade metabólica dos pHCECs irradiados foi significativamente reduzida aos 20 minutos de exposição. Para iHCECs, a atividade metabólica diminuiu para as células irradiadas em 5 e 20 min. Portanto, levou um tempo de exposição maior para reduzir a atividade metabólica dos pHCECs do que os iHCECs.
Figura 3: Atividade metabólica de pHCECs e iHCECs após exposição a 5 e 20 min de radiação UV. *p < 0,05 do controle não exposto aos raios UV. O controle não exposto aos raios UV são células em poços incubados com as amostras de teste, mas não expostas aos raios UV. O eixo Y é percentual em relação à atividade metabólica das células não expostas aos raios UV. As barras de erro indicam o desvio padrão. Abreviações: iHCECs = células epiteliais humanas imortalizadas da córnea; pHCECs = células epiteliais primárias da córnea humana; UV = ultravioleta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O efeito da exposição aos raios UV na liberação de citocinas inflamatórias dos HCECs é mostrado na Figura 4. A liberação máxima de citocinas ocorreu em diferentes momentos de exposição aos raios UV para HCECs primários e imortalizados. A liberação máxima de citocinas pelos iHCECs foi aos 5 min de exposição aos raios UV. As células liberaram níveis significativos (p < 0,05) de IL-1β, IL-6 e IL-8 em comparação com as células não expostas aos raios UV. Além disso, não ocorreu liberação significativa de citocinas aos 20 min de exposição UV para os iHCECs. No entanto, a liberação máxima de citocinas para pHCECs ocorreu em 20 min de exposição UV. Todas as quatro citocinas (IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α) foram liberadas em níveis significativos em comparação com as células não expostas à UV. Em termos de quantidades totais de citocinas inflamatórias liberadas (pg/mL), os pHCECs liberaram substancialmente mais IL-1β, IL-8 e TNF-α do que os iHCECs, enquanto os iHCECs liberaram mais IL-6.
Figura 4: Liberação de citocinas pelos pHCECs e iHCECs após exposição à radiação UV em pg/mL. As quatro citocinas pró-inflamatórias quantificadas são IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) e TNF-α (D). *p < 0,05 do controle não exposto aos raios UV. As barras de erro indicam o desvio padrão. Abreviações: iHCECs = células epiteliais humanas imortalizadas da córnea; pHCECs = células epiteliais primárias da córnea humana; UV = ultravioleta; IL = interleucina; TNF-α = fator de necrose tumoral alfa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Efeitos de toxinas químicas em HCECs primários e imortalizados
A redução percentual da atividade metabólica após a exposição às três toxinas oculares foi semelhante entre os pHCECs e iHCECs, como mostrado na Figura 5. A figura mostra as médias normalizadas dos poços de teste (poços quádruplos, dois experimentos separados).
Figura 5: Atividade metabólica de pHCECs e iHCECs após exposição a três toxinas oculares por 5 e 15 min.*p < 0,05 do controle. O controle não exposto a toxinas são células em poços incubados com as amostras teste, mas não expostas a toxinas químicas. O eixo Y é percentual em relação à atividade metabólica das células não expostas a toxinas químicas. As barras de erro indicam o desvio padrão. Abreviações: iHCECs = células epiteliais humanas imortalizadas da córnea; pHCECs = células epiteliais primárias da córnea humana; BAK = cloreto de benzalcônio; H 2O2 = peróxido de hidrogênio; SDS = dodecil sulfato de sódio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
As quantidades de citocinas liberadas pelos pHCECs foram maiores do que as quantidades liberadas pelos iHCECs. A liberação da citocina IL-6 foi a mais impactada pela exposição aos três produtos químicos (BAK 0,001%, H 2O2 0,01%, SDS 0,0025%, Figura 6). A figura mostra as médias (pg/mL) dos poços de teste (poços quádruplos, dois experimentos separados). Tanto os pHCECs quanto os iHCECs mostraram uma mudança na liberação de IL-6 após a exposição aos três produtos químicos. BAK causou uma diminuição na liberação de IL-6 em comparação com o controle para HCECs primários e imortalizados, enquanto H 2 O2causou um aumento na liberação de IL-6 de iHCECs e uma diminuição na liberação de pHCECs.
Figura 6: Liberação de citocinas. Liberação de citocinas pelos pHCECs e iHCECs após exposição a três toxinas oculares por 5 e 15 min em pg/mL. As quatro citocinas pró-inflamatórias quantificadas são IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) e TNF-α (D). *p < 0,05 do controle. As barras de erro indicam o desvio padrão. Abreviações: iHCECs = células epiteliais humanas imortalizadas da córnea; pHCECs = células epiteliais primárias da córnea humana; BAK = cloreto de benzalcônio; H 2O2 = peróxido de hidrogênio; SDS = dodecil sulfato de sódio; IL = interleucina; TNF-α = fator de necrose tumoral alfa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Efeitos de várias concentrações de BAK na viabilidade celular
Os efeitos das concentrações de BAK 0,001%, 0,005% e 0,01% por 5 min sobre a viabilidade da iHCEC são mostrados na Figura 7. BAK mostrou pouco efeito a 0,001% para ambos pHCECs e iHCECs. Tanto os pHCECs quanto os iHCECs foram significativamente danificados em 0,005% e 0,01% de BAK. Em 0,005% e 0,01% de BAK, o grau de coloração de etídio foi maior em iHCECs do que em pHCECs. Calceína cora verde, etídio cora vermelho e anexina V azul (anexina V cor ajustada por computador cor para melhor visualização do sinal de fluorescência)
Figura 7: Imagens microscópicas de fluorescência de pHCECs e iHCECs expostos a diferentes concentrações de BAK por 5 min. Barras de escala = 200 μm; Objetivo 10x. Abreviações: iHCECs = células epiteliais humanas imortalizadas da córnea; pHCECs = células epiteliais primárias da córnea humana; BAK = cloreto de benzalcônio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Diferenças potenciais no uso de dois tipos de HCECs foram avaliadas. As células foram colocadas no mesmo meio (HOEM) em concentrações idênticas de células e, em seguida, expostas a curtos e longos períodos de radiação UV e três toxinas oculares. As doses de radiação UV e produtos químicos foram selecionadas com base em seus efeitos fisiológicos, que foram prejudiciais o suficiente para as células produzirem respostas intermediárias que pudessem ser comparadas. Os tempos de exposição de 5 e 20 min para a radiação UV e 5 e 15 min para as doses selecionadas de BAK (0,001%), SDS (0,0025%) e H 2 O2(0,01%) foram tempos de exposição ideais e concentrações que mostraram respostas significativamente diferentes entre as células e os controles não tratados.
O HOEM é um meio livre de soro otimizado para a cultura de HCECs. O HOEM suporta o crescimento de células primárias e imortalizadas. A linhagem celular imortalizada utilizada nesta investigação foi imortalizada utilizando-se SV408. As células imortalizadas pelo SV40 expressam proteínas oncogênicas que podem promover a progressão do ciclo celular interferindo com Rb, p53 e pp2a17. O retinoblastoma (Rb) liga-se e inibe os fatores de transcrição E2F, que, quando não inibidos, permitem que uma célula progrida no ciclo celular e se divida18. A molécula p53 também se liga a fatores de transcrição para controlar a progressão do ciclo celular19. A inibição de uma terceira molécula, a pp2a 20,21, também promove a proliferação celular22. A expressão de proteínas do oncogene SV40 que inibem Rb, p53 e pp2a17 pode contribuir para as diferenças na resposta de iHCECs vs. pHCECs. pHCECs. Os tamanhos celulares dos dois tipos de HCECs também foram diferentes, o que pode ser devido a essas proteínas inibidoras de oncogenes, porque as células imortalizadas são forçadas a se dividir por essas moléculas antes que as células atinjam o tamanho grande das células primárias.
A exposição da córnea à radiação UV pode causar danos graves às células epiteliais da córnea. A radiação UV pode produzir espécies reativas de oxigênio na célula, danificar o DNA e as moléculas celulares e interromper processos enzimáticos23,24. O UVB danifica diretamente o DNA, e o UVA danifica o DNA e outras moléculas celulares através da produção de espécies reativas de oxigênio dentro da célula, que podem então reagir com outras biomoléculas25,26. Esse dano UV pode causar citotoxicidade e inflamação devido à liberação de citocinas inflamatórias das células expostas 3,27. Neste estudo, as células imortalizadas foram mais sensíveis aos efeitos da radiação UV sobre a atividade metabólica celular, pois houve queda na atividade metabólica das células imortalizadas, mas não na linhagem celular primária após 5 min. Diferenças na liberação de citocinas inflamatórias também ocorreram entre os pHCECs e iHCECs. Os pHCECs liberaram mais IL-1β, IL-8 e TNF-α do que os iHCECs após 20 min de radiação UV. Essas diferenças na liberação de citocinas podem estar relacionadas às diferenças entre o tamanho celular de culturas primárias e imortalizadas. Efeitos diferenciais na liberação de citocinas entre células primárias e imortalizadas foram observados em outro estudo que examinou os efeitos da fumaça de cigarro em linhagens celulares primárias e imortalizadas28.
Para modelar o potencial de toxinas químicas em causar irritação ocular, vários modelos de cultura celular foram desenvolvidos para avaliar a citotoxicidade desses produtos químicos. Este estudo mostrou que as toxinas oculares que têm efeitos intermediários sobre HCECs têm aproximadamente a mesma diminuição percentual na atividade metabólica para HCECs primários e imortalizados. As três toxinas oculares não causaram liberação substancial da maioria das citocinas inflamatórias em relação ao controle não tratado. No entanto, este trabalho mostra a sensibilidade desse método na detecção dos níveis basais de citocinas. Outro método para detecção de citocinas a partir de linhagens celulares imortalizadas foi avaliado e mostrou-se incapaz de detectar os níveis basais de citocinas29. As imagens microscópicas das culturas expostas ao BAC mostraram toxicidade tanto em pHCECs quanto em iHCECs nas concentrações de 0,005% e 0,01% após 5 min de exposição e 20 h de recuperação.
As etapas críticas deste protocolo foram selecionar doses de UV e doses de toxinas oculares que resultaram em toxicidade intermediária para as células e garantir que cada tipo de HCECs crescesse no mesmo meio. Isso permitiu comparações entre os efeitos de cada tratamento sobre os pHCECs e iHCECs. Modificações deste método podem ser feitas no tempo de exposição aos agentes tóxicos. No entanto, recomenda-se manter o tempo de exposição próximo aos tempos testados neste protocolo, pois períodos de tempo mais curtos podem não apresentar toxicidade nas células. Em contrapartida, uma exposição demasiado longa pode causar demasiados danos, pelo que pequenas diferenças na toxicidade das toxinas oculares não podem ser comparadas com os efeitos nocivos dos agentes de ensaio descritos neste protocolo.
Uma das vantagens dos HCECs imortalizados sobre os HCECs primários é que as células imortalizadas apresentaram desvios padrão mais baixos do que as células primárias para atividade metabólica e liberação de citocinas após exposição a toxinas oculares. Assim, para avaliar a atividade metabólica e a liberação de citocinas após a exposição, as células imortalizadas são mais propensas a detectar toxicidade fisiológica do que as células primárias. Tanto as células primárias quanto a linhagem celular imortalizada detectaram efeitos significativos na atividade metabólica e liberação de citocinas após exposição aos raios UV, e ambas detectaram a toxicidade da BAK após coloração das células com corantes de fluorescência.
Além dos desfechos de toxicidade mencionados nesta investigação, outros desfechos poderiam ser testados, incluindo efeitos em tight junctions, proliferação celular, migração celular e liberação de citocinas adicionais. Este protocolo avaliou os efeitos dos agentes tóxicos sobre a liberação de quatro citocinas inflamatórias, atividade metabólica e viabilidade celular usando medidas de permeabilidade celular, atividade esterase e apoptose. Além disso, os ensaios in vivo, tais como os ensaios de irritação ocular em coelhos, devem ser incluídos numa bateria de ensaios de toxicidade, uma vez que os ensaios de toxicidadein vitro são adequados para avaliar o mecanismo de acção da toxicidade para os HCEC. Testes in vivo em animais são necessários para determinar se existem outros mecanismos imunológicos e de toxicidade que não podem ser modelados in vitro.
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Disclosures
O autor, Lyndon W. Jones, ao longo dos últimos 3 anos, através do CORE, recebeu apoio à pesquisa ou honorários de palestras das seguintes empresas: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage e Visioneering. Lyndon Jones também é consultor e/ou atua em um conselho consultivo para Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis e Ophtecs. Os demais autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores não receberam financiamento para este trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Vented Flask | Corning | 354485 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| 96 well plate | costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining buffer solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system | Carl Zeiss Inc., Germany | ||
| Corning 48 Well plates | Corning | 354505 | This is the BioCoat brand, collagen-coated |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590) |
| Fetal Bovine Serum | Hycone | SH30396.03 | |
| glass bottom coverslips | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | ||
| Human Corneal Epithelial Cells | University of Ottawa | N/A | SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72. |
| Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: | Millipore, Billerica, MA, USA | SCMC001 | Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, USA | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, USA | ||
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media |
| Primary Corneal Epithelial Cells | Millipore, Billerica, MA, USA | SCCE016 | |
| SpectraMax fluorescence multi-well plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA | ||
| TrypLE Express (cell disassociation solution) | Fisher Scientific | 12605036 |
References
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