Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestemmelse af toksiciteten af UV-stråling og kemikalier på primære og udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62675
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1Centre for Ocular Research & Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo, 2Centre for Eye and Vision Research (CEVR)

Summary

Denne artikel beskriver de procedurer, der anvendes til at evaluere toksiciteten af UV-stråling og kemiske toksiner på en primær og udødeliggjort cellelinje.

Abstract

Denne artikel beskriver metoderne til måling af toksiciteten af ultraviolet (UV) stråling og okulære toksiner på primære (pHCEC) og udødeliggjorte (iHCEC) humane hornhindeepitelcellekulturer. Celler blev udsat for UV-stråling og toksiske doser af benzalkoniumchlorid (BAK), hydrogenperoxid (H2O2) og natriumdodecylsulfat (SDS). Metabolisk aktivitet blev målt ved hjælp af et metabolisk assay. Frigivelsen af inflammatoriske cytokiner blev målt ved anvendelse af et multi-plex interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 og tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) assay, og celler blev evalueret for levedygtighed ved anvendelse af fluorescerende farvestoffer.

De skadelige virkninger af UV på cellemetabolisk aktivitet og cytokinfrigivelse forekom ved 5 minutters UV-eksponering for iHCEC og 20 minutter for pHCEC. Lignende procentvise fald i metabolisk aktivitet af iHCEC og pHCEC opstod efter eksponering for BAK,H2O2eller SDS, og de mest signifikante ændringer i cytokinfrigivelse forekom for IL-6 og IL-8. Mikroskopi af fluorescerende farvede iHCEC- og pHCEC BAK-eksponerede celler viste celledød ved 0,005% BAK-eksponering, selvom graden af ethidiumfarvning var større i iHCEC'erne end pHCEC'erne. Ved hjælp af flere metoder til vurdering af toksiske virkninger ved hjælp af mikroskopi, vurderinger af metabolisk aktivitet og cytokinproduktion kunne toksiciteten af UV-stråling og kemiske toksiner bestemmes for både primære og udødeliggjorte cellelinjer.

Introduction

In vitro toksikologiundersøgelser udføres for at forudsige de toksiske virkninger af kemikalier og andre stoffer, der kan forårsage skade på celler. Ved vurderingen af toksicitet for hornhinden er humane hornhindeepitelceller (HCEC) blevet anvendt i modeller til evaluering af disse virkninger 1,2,3,4. Disse modeller evaluerer typisk fysiologiske effekter såsom ændringer i cellens metaboliske aktivitet, celleproliferation og andre cellefunktioner såsom produktion og frigivelse af inflammatoriske cytokiner. Til disse toksikologiundersøgelser er celler fra forskellige kilder blevet udvalgt til at vurdere kemikaliers og UV-strålings skadelige virkninger på HCECs 2,3. pHCEC-linjer er tilgængelige fra virksomheder, der leverer disse celler fra donorvæv hos voksne. Primære celler kan behandles med dispase og forsigtigt skrabes af hornhinden til dyrkning5. Cellerne testes derefter for virus og kontaminering og sendes derefter kryopræserveret i 10% dimethylsulfoxid.

Fordelen ved primære cellelinjer er, at cellerne er genetisk identiske med donorens celler. Dette er ideelt, da en in vitro-model skal efterligne in vivo-vævet så meget som muligt. Ulempen ved primære cellelinjer er, at de har et begrænset antal celledelinger eller passager6. Det begrænsede antal celler, der er til rådighed, begrænser antallet af eksperimenter, der kan udføres med en enkelt primærkultur, hvilket øger omkostningerne ved eksperimenterne.

Udødeliggjorte cellelinjer er også blevet anvendt i cellekultur toksicitetsmodeller. I modsætning til den primære cellelinje opnået fra in vivo-væv er den udødeliggjorte cellelinje imidlertid blevet genetisk ændret. Udødeliggjorte celler skabes ved at inkorporere generne fra en virus i DNA'et i primære celler 6,7,8. Celler med vellykket viral geninkorporering vælges til den udødeliggjorte cellelinje. Fordelen ved udødeliggørelse er, at det giver mulighed for ubestemt hurtig spredning, hvilket giver et ubegrænset antal celler til at udføre flere eksperimenter ved hjælp af den samme cellelinje. Dette giver mulighed for konsistens mellem eksperimenter og reducerer omkostningerne.

Ud over ændringer i generne, der begrænsede celleproliferationen, kunne der også forekomme ændringer i ekspressionen af gener med kritisk funktionalitet9. Derfor er ulempen ved at bruge udødeliggjorte celler, at de muligvis ikke længere repræsenterer de originale in vivo-celler med hensyn til deres reaktion på forskellige eksterne stimuli10. Sammenligninger har involveret observation af kemikaliers toksiske virkninger på primære og udødeliggjorte humane hornhindekeratocytter11 samt udødeliggjorte HCEC'er og kaninhornhindepitelprimærceller12. Sammenligningen mellem toksiners virkninger på primære humane keratocytter og udødeliggjorte keratocytter viste ingen signifikante forskelle11. Ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne artikel, bestemmes effektiviteten af disse assays til vurdering af toksiciteten af UV-stråling og okulære toksiner på pHCEC'er og iHCEC'er.

Tre okulære toksiner, der almindeligvis anvendes i in vitro-assays, blev udvalgt: BAK,H2O2og SDS. BAK er et kationisk konserveringsmiddel, der almindeligvis anvendes i oftalmiske opløsninger 13,14,H2O2bruges almindeligvis til at desinficere kontaktlinser 15, og SDS er et anionisk overfladeaktivt middel, der findes i vaskemidler og shampoo 14. I lighed med okulære toksiner kan UV-stråling også forårsage betydelig skade på HCEC'er3. Derudover kan overeksponering for UV forårsage en okulær tilstand kendt som fotokeratitis karakteriseret ved symptomer på rive, lysfølsomhed og en følelse af grynhed16.

Der er et ubegrænset antal primære cellekulturer, der kan bruges, og forskellige udødeliggjorte cellelinjer, der er blevet udviklet. Derfor blev der foretaget en undersøgelse for at sammenligne primære HCEC'er med en udødeliggjort HCEC-linje for at bestemme ligheder og forskelle mellem modeller, der inkorporerer disse typer celler.

Denne undersøgelse brugte mikroskopi til at vurdere mulige forskelle mellem pHCEC'er og iHCEC'er på cellefysiologisk respons på UV og toksiner. Virkningerne af UV-stråling og kemikalier på cellemetabolisk aktivitet og inflammatorisk cytokinfrigivelse for de to cellelinjer blev også evalueret. Vigtigheden af at bestemme forskellene mellem de to cellelinjer er at forstå den optimale anvendelse af disse cellelinjer til evaluering: 1) effekten af UV-stråling på celler, 2) virkningerne af toksiner på celler og 3) de resulterende ændringer i metabolisme, cellelevedygtighed og cellecytokinfrigivelse til fremtidige undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dyrkning af pHCEC'er og iHCEC'er

  1. Dyrk pHCEC'erne og iHCEC'erne i humant okulært epitelmedium (HOEM) med følgende kosttilskud: 6 mM L-glutamin, 0,002% cellemedietilskud O (materialefortegnelse), 1,0 μM adrenalin, 0,4% cellemedietilskud P (materialetabel), 5 μg / ml rh-insulin, 5 μg / ml apo-transferrin og 100 ng / ml hydrocortisonhemisuccinat i kollagen-1-belagte kulturkolber (18 ml i en 75 cm2 kulturkolbe).
  2. Skift mediet i kolberne hver 2-3 dage ved at fjerne mediet, efter at cellerne vokser til ~ 80% sammenløb. Der tilsættes dissociationsopløsning uden phenolrød, og kolben inkuberes ved 37 °C, indtil cellerne er helt løsnet. Neutraliser dissociationsopløsningen med DMEM/F12 med serum, og centrifuger derefter cellerne ved 500 × g. Supernatantsubstratet fjernes og cellerne resuspenderes i HEM-medium.

2. Bestemmelse af cellestørrelse ved hjælp af konfokalmikroskopi

  1. Både pHCEC'er og iHCEC'er tilsættes kollagenbelagte petriskåle med glasbundsdæksler i en koncentration på 1 × 105 med 1 ml HOEM. Der dyrkes pHCEC'er og iHCEC'er, et sæt kulturer i 24 timer og et andet sæt kulturer i 48 timer, i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
  2. Efter inkubationsperioden plettes cellerne med 500 μL annexin-farvningsbufferopløsning indeholdende calcein (4 μM), ethidiumhomodimer-1 (8 μM) og annexin V (5 μL i 500 μL buffer-Alexa Fluor 647-konjugat) i 20 minutter ved 37 °C. Efter farvning af cellerne justeres mikroskopet til opsamling af excitations-/emissionsbølgelængderne på 488/515 nm for calcein-AM, 543/600 nm for ethidiumhomodimer-1 og 633/665 nm for annexin V ved hjælp af et konfokal laserscanningsmikroskop.
  3. Hent billederne, og tag Z-stakke for at vurdere cellestørrelsen i tre dimensioner.
    1. For at erhverve de todimensionelle (2D) og tredimensionelle (3D) billeder skal du finde det område, der skal afbildes med et apochromat 40x / 1.2 vandmål. Med Argon (488) (første scanning), HeNe1 (543) (anden scanning og HeNe2 (633) (tredje scanning) lasere skal du scanne i tre separate kanaler ved hjælp af strålesplitterne, HFT 488/543/633, NFT 635 Vis og NFT 545 LP560, LP505.
    2. Brug sekventiel scanning med flere spor til at reducere krydstale.
      BEMÆRK: LP505 bruges til kanal 2 med 488-laseren til at fange emissionen af calceinfarvestoffet. LP560 bruges i kanal 3 med 543-laseren til at fange emissionen af ethidiumhomodimer 1. NFT 635 bruges sammen med 633-laseren til at fange emissionen af annexin V. Formålet med HFT er at adskille excitations- og emissionslyset. NFT splitter lys ved at reflektere lys < specificeret bølgelængde til en separat kanal, mens lyset lader > en bestemt bølgelængde igennem til en anden kanal. LP-filtre blokerer kortere bølgelængder end den angivne bølgelængde og lader de længere bølgelængder komme igennem.
    3. For at afbilde i 3D skal du indstille konfokalen til Z-stack og scanne mindst 20 billeder.

3. Eksponering af celler for UV-stråling

  1. Cellerne frøes ved 5 × 104/ml HOEM i hvert hul i en 24-brønds kollagen-1-belagt kulturplade og inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 3 timer. Efter inkubationsperioden reduceres volumenet af mediet i brøndene til 300 μL. Udsæt derefter cellerne for UV-stråling (både UVA ved 6,48 W/m2 og UVB ved 1,82 W/m2, da både UVA- og UVB-rør tændes i inkubatoren på samme tid) i en 37 °C inkubator i 5 og 20 minutter i separate forsøg.
  2. Efter UV-strålingen tilsættes 200 μL frisk HOEM til hvert hul, og der inkuberes i 20 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
  3. Efter inkubationen opsamles cellesupernatanten i hvert hul og overføres til sterile 2 ml polypropylenrør. Fryses ved -80 °C. For at bestemme cytokinniveauerne frigivet af pHCEC'erne og iHCEC'erne efter UV-eksponering skal du bruge et multiplexcytokinassay og følge sættets instruktioner for at kvantificere følgende fire cytokiner: IL-6, IL-8, IL-1β og TNF-α.
  4. Tilsæt metabolisk assayreagens til cellerne i brøndene.
  5. Forbered 10% metabolisk assayreagens i DMEM / F12. Dyrkningsmediet i hvert hul erstattes med 1 ml af 10 % metabolisk analyseopløsning, og der inkuberes ved 37 °C med 5 % CO2 i 4 timer.
  6. Fluorescensen af hver opløsning måles ved hjælp af en fluorescerende pladelæser ved 530/590 nm excitations-/emissionsbølgelængder.

4. Eksponering af celler for kemiske toksiner

  1. Frøceller ved 5 × 104/ml HOEM i hvert hul i en 24-brønds kollagen-1-belagt dyrkningsplade og inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 3 timer. Efter inkubationsperioden fjernes mediet og udsættes cellerne for 1 ml kemiske toksiner (BAK 0,001%, H2O2 0,01% og SDS 0,0025% i fosfatbufret saltvand (PBS)) i 5 og 15 minutter.
  2. Efter eksponering for de kemiske toksiner fjernes toksinerne fra brøndene, skylles med 1 ml PBS, og der tilsættes 1 ml HOEM til hvert hul. Efter 20 timers inkubation udføres et metabolisk assay ved at erstatte substratet med 1 ml af en 10 % metabolisk assayopløsning og inkubere ved 37 °C med 5 % CO2 i 4 timer. Fluorescensen måles ved hjælp af en pladelæser med flere huller med fluorescens ved 530/590 nm excitations-/emissionsbølgelængder.
  3. Cellesupernatanterne overføres fra hullerne efter 20 timers inkubation til separate sterile 2 ml polypropylenglas og fryses ved -80 °C. Kvantificer cytokiner frigivet af pHCEC'erne og iHCEC'erne efter eksponering for kemikalierne. Brug den samme multiplexplatform, der bruges til at vurdere cytokinerne fra de UV-behandlede celler. Brug et multiplexcytokinassay efter sættets instruktioner til at kvantificere følgende fire cytokiner: IL-6, IL-8, IL-1β og TNF-α.

5. Undersøgelse af celler udsat for forskellige koncentrationer af BAK

  1. Frøceller ved 1 × 10 5/ml HOEM i hvert hul i en 24-brønds kollagen-1-belagt kulturplade og inkuberes ved 37 °C med5% CO2 i 24 timer. Efter inkubationsperioden fjernes mediet og udsættes cellerne for 1 ml kemiske toksiner (BAK 0,001%, BAK 0,005% og BAK 0,01% i PBS) i 5 minutter.
  2. Efter eksponering fjernes de kemiske toksiner, hullerne skylles med 1 ml PBS, og der tilsættes 1 ml HOEM til hvert hul. Efter 20 timers inkubation plettes cellerne med 500 μL annexin-farvningsbufferopløsning indeholdende calcein (4 μM), ethidiumhomodimer-1 (8 μM) og annexin V (5 μL i 500 μL buffer-Alexa Fluor 647-konjugat) i 20 minutter ved 37 °C. Juster mikroskopet for at måle intensiteter af annexin V, calcein AM og ethidium-1-farvning ved excitations-/emissionsbølgelængder på henholdsvis 630/675 nm, 495/515 nm og 528/617 nm. Billede cellerne ved hjælp af fluorescensmikroskopet

6. Analyse af data

  1. Udfør en normalitetstest og en test for lige varianser, før du udfører en variansanalyse (ANOVA), Welch ANOVA- eller Kruskal-Wallis-test. Brug den relevante post-hoc-test til sammenligning af hver testet gruppe. Indstil p < 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cellestørrelse
De primære og udødeliggjorte HCEC'er blev visualiseret med tre fluorescerende farvestoffer, som afspejler tre forskellige stadier af cellelevedygtighed. Levende celler er grønne (calcein-AM), døde celler er røde (ethidium homodimer-1), og apoptotiske celler er gule (annexin V-computerjusteret farve for bedre visualisering af fluorescenssignalet). Levende celler indeholder esteraser i cellecytoplasmaet og konverterer calcein-AM til calcein. Døde celler har cellemembraner, der er gennemtrængelige for ethidium homodimer-1. Apoptotiske celler har farvning ved cellemembranen, da phosphatidylserin translokeres til den ydre membran.

En sammenligning af cellestørrelse for de to typer HCEC'er efter 24 og 48 timers vækst blev foretaget ved hjælp af konfokal mikroskopi, som vist i figur 1. iHCEC'erne (figur 1A) er mindre celler, der spænder fra 10 μm til 20 μm, og pHCEC'erne (figur 1B) varierer i størrelse fra 20 μm til 50 μm efter 24 timers vækst. Lignende forskelle i størrelsesinterval blev observeret for iHCEC'er (figur 1C) og pHCEC'er (figur 1D) efter 48 timers vækst. 3D-billeder af de to typer HCEC'er blev lavet ved hjælp af konfokal mikroskopi (figur 2A viser pHCEC'er; Figur 2B viser iHCEC'er).

Figure 1
Figur 1: En sammenligning af cellestørrelse ved hjælp af konfokal mikroskopi . iHCECs efter 24 (A) og 48 (C) h vækst med celler i størrelse fra 10 til 20 μm. pHCECs efter 24 (B) og 48 (D) h vækst med celler i størrelse fra 20 til 50 μm. 40x vand mål. Skalastænger = 10 og 20 μm (A); 25 og 50 μm (B); 10 og 20 μm (C); 50 μm (D). Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller; pHCECs = primære humane hornhindeepitelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: 3D-konfokale billeder. 3D-konfokale billeder af pHCEC'er efter 48 timers vækst (A) og iHCEC'er efter 24 timer (B). 40x vand mål. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller; pHCECs = primære humane hornhindeepitelceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Effekt af UV på primære og udødeliggjorte HCEC'er
Den metaboliske aktivitet af både primære og udødeliggjorte HCEC'er efter eksponering for UV er vist i figur 3. Figuren viser normaliserede midler fra testbrønde (firdobbelte brønde, to separate eksperimenter). Sammenlignet med de ikke-UV-eksponerede celler blev den metaboliske aktivitet af bestrålede pHCEC'er signifikant reduceret ved 20 minutters eksponering. For iHCEC'er faldt metabolisk aktivitet for celler, der blev bestrålet efter både 5 og 20 minutter. Derfor tog det længere eksponeringstid at reducere pHCEC'ernes metaboliske aktivitet end iHCEC'erne.

Figure 3
Figur 3: Den metaboliske aktivitet af pHCEC'er og iHCEC'er efter eksponering for 5 og 20 minutters UV-stråling . *p < 0,05 af den ikke-UV-eksponerede kontrol. Den ikke-UV-eksponerede kontrol er celler i brønde, der er inkuberet med testprøverne, men ikke udsat for UV. Y-aksen er procent i forhold til den metaboliske aktivitet af de celler, der ikke udsættes for UV. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller; pHCECs = primære humane hornhindeepitelceller; UV = ultraviolet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Effekten af UV-eksponering på frigivelsen af inflammatoriske cytokiner fra HCEC'erne er vist i figur 4. Den maksimale cytokinfrigivelse forekom på forskellige tidspunkter af UV-eksponering for de primære og udødeliggjorte HCEC'er. Den maksimale cytokinfrigivelse af iHCEC'erne var ved 5 minutters UV-eksponering. Cellerne frigav signifikante niveauer (p < 0,05) af IL-1β, IL-6 og IL-8 sammenlignet med de ikke-UV-eksponerede celler. Desuden forekom der ingen signifikant cytokinfrigivelse ved 20 minutters UV-eksponering for iHCEC'erne. Den maksimale cytokinfrigivelse for pHCEC'er forekom imidlertid ved 20 minutters UV-eksponering. Alle fire cytokiner (IL-1β, IL-6, IL-8 og TNF-α) blev frigivet på signifikante niveauer sammenlignet med de ikke-UV-eksponerede celler. Med hensyn til samlede mængder frigivne inflammatoriske cytokiner (pg / ml) frigav pHCEC'erne væsentligt mere IL-1β, IL-8 og TNF-α end iHCEC'erne, mens iHCEC'erne frigav mere IL-6.

Figure 4
Figur 4: Cytokinfrigivelse fra pHCEC'er og iHCEC'er efter eksponering for UV-stråling i pg/ml. De fire proinflammatoriske cytokiner kvantificeret er IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) og TNF-α (D). *p < 0,05 af den ikke-UV-eksponerede kontrol. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller; pHCECs = primære humane hornhindeepitelceller; UV = ultraviolet; IL = interleukin; TNF-α = tumornekrosefaktor alfa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Virkninger af kemiske toksiner på primære og udødeliggjorte HCEC'er
Den procentvise reduktion i metabolisk aktivitet efter eksponering for de tre okulære toksiner var den samme mellem pHCEC'erne og iHCEC'erne, som vist i figur 5. Figuren viser normaliserede midler fra testbrønde (firdobbelte brønde, to separate eksperimenter).

Figure 5
Figur 5: Den metaboliske aktivitet af pHCEC'er og iHCEC'er efter eksponering for tre okulære toksiner i 5 og 15 min. *p < 0,05 af kontrollen. Den ikke-toksineksponerede kontrol er celler i brønde, der er inkuberet med testprøverne, men ikke udsat for kemiske toksiner. Y-aksen er procent i forhold til den metaboliske aktivitet af cellerne, der ikke udsættes for kemiske toksiner. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller; pHCECs = primære humane hornhindeepitelceller; BAK = benzalkoniumchlorid; H2O2= hydrogenperoxid; SDS = natriumdodecylsulfat. Klik her for at se en større version af denne figur.

Mængderne af cytokiner frigivet af pHCEC'erne var større end de mængder, der blev frigivet af iHCEC'erne. Frigivelsen af cytokin IL-6 blev påvirket mest af eksponering for de tre kemikalier (BAK 0,001%, H 2 O20,01%, SDS 0,0025%, figur 6). Figuren viser middelværdier (pg/ml) fra prøvebrønde (firdobbelte brønde, to separate forsøg). Både pHCEC'er og iHCEC'er viste en ændring i frigivelsen af IL-6 efter eksponering for alle tre kemikalier. BAK forårsagede et fald i frigivelsen af IL-6 sammenlignet med kontrollen for både primære og udødeliggjorte HCEC'er, mensH2O2forårsagede en stigning i frigivelsen af IL-6 fra iHCEC'er og et fald i frigivelsen fra pHCEC'er.

Figure 6
Figur 6: Frigivelse af cytokin. Cytokinfrigivelse af pHCEC'er og iHCEC'er efter eksponering for tre okulære toksiner i 5 og 15 minutter i pg / ml. De fire proinflammatoriske cytokiner kvantificeret er IL-1β (A), IL-6 (B), IL-8 (C) og TNF-α (D). *p < 0,05 af kontrollen. Fejlbjælker angiver standardafvigelse. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller; pHCECs = primære humane hornhindeepitelceller; BAK = benzalkoniumchlorid; H2O2= hydrogenperoxid; SDS = natriumdodecylsulfat; IL = interleukin; TNF-α = tumornekrosefaktor alfa. Klik her for at se en større version af denne figur.

Virkninger af forskellige koncentrationer af BAK på cellelevedygtighed
Virkningerne af BAK-koncentrationerne på 0,001%, 0,005% og 0,01% i 5 minutter på iHCEC's levedygtighed er vist i figur 7. BAK viste ringe effekt ved 0,001% for både pHCEC'er og iHCEC'er. Både pHCEC'er og iHCEC'er blev signifikant beskadiget ved 0,005% og 0,01% af BAK. Ved 0,005% og 0,01% af BAK var graden af ethidiumfarvning større i iHCEC'er end pHCEC'er. Calcein pletter grønt, ethidium pletter rødt og annexin V blå (annexin V-farve computerjusteret farve for bedre visualisering af fluorescenssignalet)

Figure 7
Figur 7: Fluorescensmikroskopiske billeder af pHCEC'er og iHCEC'er udsat for forskellige koncentrationer af BAK i 5 min. Skalastænger = 200 μm; 10x målsætning. Forkortelser: iHCECs = udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller; pHCECs = primære humane hornhindeepitelceller; BAK = benzalkoniumchlorid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Potentielle forskelle i anvendelsen af to typer HCEC'er blev vurderet. Celler blev placeret i samme medium (HOEM) i identiske koncentrationer af celler og derefter udsat for korte og lange perioder med UV-stråling og tre okulære toksiner. Doser af UV-stråling og kemikalier blev valgt ud fra deres fysiologiske virkninger, som var skadelige nok for cellerne til at producere mellemliggende reaktioner, der kunne sammenlignes. Eksponeringstider på 5 og 20 minutter for UV-stråling og 5 og 15 minutter for de udvalgte doser BAK (0,001%), SDS (0,0025%) ogH2O2(0,01%) var ideelle eksponeringstider og koncentrationer, der viste signifikant forskellige reaktioner mellem cellerne og de ubehandlede kontroller.

HOEM er et serumfrit medie, der er optimeret til HCEC'ernes kultur. HOEM understøtter væksten af både primære og udødeliggjorte celler. Den udødeliggjorte cellelinje, der blev brugt i denne undersøgelse, blev udødeliggjort ved hjælp af SV408. SV40-udødeliggjorte celler udtrykker onkogenproteiner, der kan fremme cellecyklusprogression ved at forstyrre Rb, p53 og pp2a17. Retinoblastom (Rb) binder til og hæmmer E2F-transkriptionsfaktorer, som, når de ikke hæmmes, tillader en celle at udvikle sig i cellecyklussen og dele18. Molekylet p53 binder også til transkriptionsfaktorer for at kontrollere progressionen af cellecyklussen19. Inhiberingen af et tredje molekyle, pp2a 20,21, fremmer også cellulær proliferation22. Ekspressionen af SV40 onkogenproteiner, der hæmmer Rb, p53 og pp2a17, kan bidrage til forskellene i responsen mellem iHCEC'er vs. pHCEC'er. Cellestørrelserne på de to typer HCEC'er var også forskellige, hvilket kan skyldes disse onkogenhæmmende proteiner, fordi de udødeliggjorte celler tvinges til at dele sig af disse molekyler, før cellerne opnår den store størrelse af de primære celler.

Hornhindeeksponering for UV-stråling kan forårsage alvorlig skade på hornhindepitelceller. UV-stråling kan producere reaktive iltarter i cellen, beskadige DNA- og cellemolekyler og forstyrre enzymprocesser23,24. UVB beskadiger direkte DNA, og UVA beskadiger DNA og andre cellulære molekyler via produktion af reaktive iltarter i cellen, som derefter kan reagere med andre biomolekyler25,26. Denne UV-skade kan forårsage cytotoksicitet og betændelse på grund af frigivelsen af inflammatoriske cytokiner fra de eksponerede celler 3,27. I denne undersøgelse var udødeliggjorte celler mere følsomme over for UV-strålingseffekter på cellemetabolisk aktivitet, da der var et fald i de udødelige cellers metaboliske aktivitet, men ikke i den primære cellelinje efter 5 min. Forskelle i frigivelsen af inflammatoriske cytokiner forekom også mellem pHCEC'erne og iHCEC'erne. pHCEC'er frigav mere IL-1β, IL-8 og TNF-α end iHCEC'er efter 20 minutters UV-stråling. Disse forskelle i cytokinfrigivelse kan relateres til forskellene mellem cellestørrelsen af primære og udødeliggjorte cellekulturer. Differentielle virkninger i cytokinfrigivelse mellem primære og udødeliggjorte celler er blevet bemærket i en anden undersøgelse, der undersøgte virkningerne af cigaretrøg på primære og udødeliggjorte cellelinjer28.

For at modellere kemiske toksiners potentiale til at forårsage okulær irritation er der udviklet forskellige cellekulturmodeller til vurdering af cytotoksiciteten af disse kemikalier. Denne undersøgelse viste, at okulære toksiner, der har mellemliggende virkninger på HCEC'er, har omtrent det samme procentvise fald i metabolisk aktivitet for både primære og udødeliggjorte HCEC'er. De tre okulære toksiner forårsagede ikke en væsentlig frigivelse af de fleste inflammatoriske cytokiner sammenlignet med den ubehandlede kontrol. Dette papir viser imidlertid følsomheden af denne metode til påvisning af cytokinniveauer ved baseline. En anden metode til påvisning af cytokiner fra udødeliggjorte cellelinjer er blevet evalueret og viste sig ude af stand til at detektere baseline cytokinniveauer29. De mikroskopiske billeder af BAK-eksponerede kulturer viste toksicitet i både pHCEC'er og iHCEC'er ved koncentrationerne 0,005% og 0,01% efter 5 minutters eksponering og 20 timers genvinding.

De kritiske trin i denne protokol var at vælge UV-doser og okulære toksindoser, der resulterede i mellemliggende toksicitet for cellerne og sikre, at hver type HCEC'er voksede i samme medium. Dette gjorde det muligt at foretage sammenligninger mellem virkningerne af hver behandling på pHCEC'erne og iHCEC'erne. Modifikationer af denne metode kan foretages i eksponeringstiden for de giftige stoffer. Det anbefales dog at opretholde eksponeringstiden tæt på de tidspunkter, der testes i denne protokol, da kortere tidspunkter muligvis ikke viser toksicitet på cellerne. I modsætning hertil kan en for lang eksponering forårsage for stor skade, således at mindre forskelle i okulære toksiners toksicitet ikke kan sammenlignes med de skadelige virkninger af de testmidler, der er beskrevet i denne protokol.

En af fordelene ved de udødeliggjorte HCEC'er i forhold til de primære HCEC'er er, at de udødeliggjorte celler havde lavere standardafvigelser end de primære celler for metabolisk aktivitet og cytokinfrigivelse efter eksponering for okulære toksiner. For at vurdere metabolisk aktivitet og cytokinfrigivelse efter eksponering er de udødeliggjorte celler således mere tilbøjelige til at detektere fysiologisk toksicitet end primære celler. Både de primære celler og den udødeliggjorte cellelinje detekterede signifikante virkninger på metabolisk aktivitet og cytokinfrigivelse efter UV-eksponering, og begge detekterede toksiciteten af BAK efter farvning af cellerne med fluorescensfarvestoffer.

Ud over de toksicitetsendepunkter, der er nævnt i denne undersøgelse, kan andre endepunkter testes, herunder virkninger på snævre kryds, celleproliferation, cellemigration og frigivelse af yderligere cytokiner. Denne protokol evaluerede virkningerne af toksiske stoffer på frigivelsen af fire inflammatoriske cytokiner, metabolisk aktivitet og cellelevedygtighed ved hjælp af målinger for cellepermeabilitet, esteraseaktivitet og apoptose. Desuden bør in vivo-test, såsom undersøgelse for øjenirritation hos kaniner, indgå i et toksicitetstestbatteri, da in vitro-toksicitetstest er egnede til at vurdere virkningsmekanismen for toksicitet for HCEC'er. In vivo-forsøg på dyr er nødvendige for at afgøre, om der findes andre immun- og toksicitetsmekanismer, som ikke kan modelleres in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren, Lyndon W. Jones, har i løbet af de sidste 3 år gennem Core modtaget forskningsstøtte eller foredragshonorarer fra følgende virksomheder: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage og Visioneering. Lyndon Jones er også konsulent og/eller sidder i et advisory board for Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis og Ophtecs. De andre forfattere har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne modtog ingen finansiering til dette arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Vented Flask Corning 354485 This is the BioCoat brand, collagen-coated
96 well plate costar 3370
alamarBlue Fisher Scientific dal 1025
Annexin Staining buffer solution Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Annexin V Invitrogen, Burlington, ON, Canada
Axiovert 100 microscope with a Zeiss confocal laser scanning microscope 510 system Carl Zeiss Inc., Germany
Corning 48 Well plates Corning 354505 This is the BioCoat brand, collagen-coated
Cytation 5 BioTek CYT5MPV Can read fluorescence from 280 - 700 nm (for assay 540/590)
Fetal Bovine Serum Hycone SH30396.03
glass bottom coverslips MatTek Corporation, Ashland, MA, USA
Human Corneal Epithelial Cells University of Ottawa N/A SV40-immortalized human corneal epithelial cells from Dr. M. Griffith (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Canada) and have been characterized Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286:2169-72.
Human Ocular Epithelia Media (HOEM) with the following supplements: Millipore, Billerica, MA, USA SCMC001 Epigro base media supplemented with 6 mM L-Glutamine, 0.002% EpiFactor O (cell media supplement O in article) , 1.0 μM Epinephrine, 0.4% EpiFactor P (cell media supplement P in article), 5 μg/mL rh Insulin, 5 μg/mL Apo- Transferrin, and 100 ng/mL Hydrocortisone Hemisuccinate in Collagen-1 coated culture flasks (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, USA).
Live Dead calcien and ethidium homodimer Invitrogen, Burlington, ON, Canada
MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument Rockville, MD, USA
MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay Rockville, MD, USA
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media
Primary Corneal Epithelial Cells Millipore, Billerica, MA, USA SCCE016
SpectraMax fluorescence multi-well plate reader Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
TrypLE Express (cell disassociation solution) Fisher Scientific 12605036

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
  2. Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
  3. Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells. Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).
  4. Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
  5. Spurr, S. J., Gipson, I. K. Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).
  6. Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).
  7. Araki-Sasaki, K., et al. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
  8. Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
  9. Toouli, C. D., et al. Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit. Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).
  10. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  11. Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing. Altex. 21 (3), 129-134 (2004).
  12. Huhtala, A., et al. Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).
  13. Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits. Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).
  14. Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens. Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).
  15. Hughes, R., Kilvington, S. Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).
  16. Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea. Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).
  17. Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation. Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).
  18. Tong, Y., et al. Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage. Cell Death & Disease. 6, 1640 (2015).
  19. Muller, P. A., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).
  20. Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer. Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).
  21. Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells. Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).
  22. Xie, F., et al. Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK. Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).
  23. Mallet, J. D., Rochette, P. J. Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea. Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).
  24. Cejkova, J., Cejka, C. The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries. Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).
  25. Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. Photoprotection: a review of the current and future technologies. Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).
  26. Svobodova, A. R., et al. DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light. Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).
  27. Kennedy, M., et al. Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).
  28. Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells. Respiratory Research. 7, 132 (2006).
  29. Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).

Tags

Denne måned i JoVE udgave 173 primær kultur udødeliggjort kultur konfokal mikroskopi humane hornhindeepitelceller calcein ethidium homodimer annexin V
Bestemmelse af toksiciteten af UV-stråling og kemikalier på primære og udødeliggjorte humane hornhindeepitelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, J. M. L., Seo, J., Kwan, M.… More

Chang, J. M. L., Seo, J., Kwan, M. M. Y., Oh, S., McCanna, D. J., Subbaraman, L., Jones, L. Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (173), e62675, doi:10.3791/62675 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter