Summary
التعلم والذاكرة هي مقاييس قوية في دراسة إما النمو، تعتمد على المرض، أو الإعاقات المعرفية الناجمة بيئيا. تتطلب معظم التقييمات المعرفية معدات متخصصة والتزامات زمنية واسعة النطاق. ومع ذلك ، فإن المقايسة المكوكية هي أداة تعلم ارتباطية تستخدم صندوق هلام تقليدي لتقييم سريع وموثوق به لإدراك حمار وحشي بالغ.
Abstract
العجز المعرفي، بما في ذلك ضعف التعلم والذاكرة، هي الأعراض الرئيسية لمختلف الأمراض العصبية التنموية والسن ذات الصلة وإصابات الدماغ الرضية (TBI). حمار وحشي هي نموذج مهم لعلم الأعصاب نظرا لشفافيتها أثناء التنمية وقدرات تجديدية قوية بعد الصدمة العصبية. في حين أن الاختبارات المعرفية المختلفة موجودة في حمار وحشي، فإن معظم التقييمات المعرفية التي يتم فحصها بسرعة التعلم غير النقابي. وفي الوقت نفسه، غالبا ما تتطلب عمليات الفحص للتعلم النقابي عدة أيام أو أسابيع. هنا، نقوم بوصف اختبار التعلم النقابي السريع الذي يستخدم التحفيز السلبي (الصدمة الكهربائية) ويتطلب الحد الأدنى من وقت التحضير. إن المقايسة المكوكية، المعروضة هنا، بسيطة ومثالية للمحققين المبتدئين، وتتطلب الحد الأدنى من المعدات. ونحن نثبت أنه، بعد TBI، هذا الاختبار مربع المكوك يقيم بشكل مستنسخ العجز المعرفي والانتعاش من حمار وحشي الشباب إلى كبار السن. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء الفحص لفحص الذاكرة الفورية أو المتأخرة. نحن نثبت أن كلا من TBI واحد وأحداث TBI المتكررة تؤثر سلبا على التعلم والذاكرة الفورية ولكن لا تأخير الذاكرة. ولذلك، نستنتج أن صندوق المكوك يتتبع بشكل مستنسخ تطور وانتعاش الضعف الإدراكي.
Introduction
يتم استخدام التعلم والذاكرة بشكل روتيني كمقاييس لضعف الإدراك ، والذي يحدث بسبب الشيخوخة أو الأمراض العصبية أو الإصابة. إصابات الدماغ الرضية (TBIs) هي الإصابة الأكثر شيوعا التي تؤدي إلى العجز المعرفي. TBIs هي مصدر قلق متزايد بسبب ارتباطها مع العديد من الاضطرابات العصبية، مثل الخرف الجبهي الصدغي ومرض باركنسون1،2. وبالإضافة إلى ذلك، فإن زيادة تراكم بيتا اميلويد لوحظ في بعض المرضى TBI تشير إلى أنه قد يكون مرتبطا أيضا مع تطور مرض الزهايمر3،4. TBIs غالبا ما تكون نتيجة لصدمة القوة الحادة وتمتد مجموعة من الخطورة5, مع إصابات الدماغ خفيفة (miTBI) كونها الأكثر شيوعا. ومع ذلك، غالبا ما يتم الإبلاغ عن miTBIs وسوء تشخيصها لأنها تؤدي إلى ضعف إدراكي طفيف لفترة قصيرة فقط، وعادة ما يتعافى الأفراد المصابون بشكل كامل6. في المقابل، كانت أحداث miTBI المتكررة مصدر قلق متزايد لأنها منتشرة بشكل كبير في البالغين الصغار ومتوسطي العمر، ويمكن أن تتراكم مع مرور الوقت7،ويمكن أن تضعف النمو المعرفي، وتفاقم الأمراض العصبية1و2و3و4و5، على غرار الأفراد الذين يعانون إما TBI معتدلة أو شديدة8.
Zebrafish (Danio rerio) هو نموذج مفيد لاستكشاف مجموعة متنوعة من الموضوعات في علم الأعصاب ، بما في ذلك القدرة على تجديد الخلايا العصبية المفقودة أو التالفة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي9،10،11،12،13. كما تجلى التجديد العصبي في telencephalon، الذي يحتوي على الأرتشيباليوم في المنطقة الظهرية الداخلية. هذه المنطقة التشريحية العصبية مماثلة للقرن آمون ومن المرجح أن تكون مطلوبة للإدراك في الأسماك وللذاكرة القصيرة في البشر14،15،16. وعلاوة على ذلك، وقد تم وصف سلوك حمار وحشي على نطاق واسع وفهرسة17. وقد درس التعلم من خلال تقنيات مختلفة، بما في ذلك التعود على استجابةالذهول 18،والتي يمكن أن تمثل شكلا سريعا من التعلم غير النقابي عند تنفيذها في كتل قصيرة ومع الاهتمام بوقت الاضمحلال السريع19. وتستخدم اختبارات أكثر تعقيدا من التعلم النقابي، مثل صناديق تي، بالإضافة إلى متاهات، والتمييز البصري20،21 ولكن غالبا ما تستغرق وقتا طويلا، وتتطلب أيام أو أسابيع من التحضير، والاعتماد على المياه الضحلة أو التعزيز الإيجابي. هنا، نقوم بوصف نموذج سريع لتقييم كل من التعلم النقابي والذاكرة الفورية أو المتأخرة. يستخدم هذا المقايسة مربع المكوك حافزا عكسيا وتكييف التعزيز السلبي لتقييم العجز المعرفي والانتعاش بعد TBI قوة حادة. ونحن نثبت أن السيطرة غير التالفة حمار وحشي الكبار (8-24 شهرا) تتعلم بشكل مستنسخ لتجنب الضوء الأحمر في غضون 20 تجربة (<20 دقيقة من التقييم) في مربع المكوك، مع درجة عالية من الاتساق عبر المراقبين. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام مربع المكوك نثبت أن قدرات التعلم والذاكرة عبر البالغين (8-24 شهرا) متسقة ومفيدة للإدراك المقايسة مع ضعف كبير بين شدة TBI مختلفة أو TBI المتكررة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه الطريقة بسرعة كمقياس لتتبع مجموعة واسعة من تطور المرض أو فعالية التدخلات الدوائية التي تؤثر على الحفاظ على الإدراك أو استعادته في سمك الحمار الوحشي البالغ.
هنا، نقدم نظرة عامة تعليمية للتقييم المعرفي السريع الذي يمكن أن يدرس كل من التعلم الترابطي المعقد (القسم 1) والذاكرة من حيث الذاكرة الفورية والمتأخرة على حد سواء. ويقدم هذا النموذج تقييما للذاكرة القصيرة والطويلة الأجل لمهمة معرفية ارتباطية متعلمة (القسم 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تربية سمك الحمار الوحشي وصيانته في منشأة نوتردام زيبرافيش في مركز فرايمان لعلوم الحياة. تمت الموافقة على الأساليب الموصوفة في هذه المخطوطة من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة نوتردام (رقم ضمان رعاية الحيوان A3093-01).
1. المكوك مربع نموذج التعلم (الشكل 1A)
ملاحظة: يوفر نموذج التعلم تقييما سريعا للإدراك فيما يتعلق بالتعلم الترابطي.
- إعداد مربع المكوك عن طريق تعديل 30.5 × 19 × 7.5 سم هلام مربع مع 5 × 19 سم قطعة من زجاج شبكي درجة الحوض المضافة إلى كل جانب في زاوية 45 درجة. جعل خط بمناسبة نقطة منتصف الطريق من الخزان لتقييم عندما عبرت الأسماك في منتصف الخزان (الشكل 1B).
- أضف 800 مل من مياه النظام إلى صندوق المكوك. جعل هذا الماء عن طريق حل 60 ملغ من المحيط الفوري في 1 لتر من المياه RO deionized. ملء المياه إلى منتصف الخزان إلى عمق 5 سم.
ملاحظة: استبدلها بمياه نظام عذبة عند 28 درجة مئوية كل ساعة أو بعد اختبار 3 أسماك. - ضع 2-3 سمكة في خزان احتجاز يحتوي على مياه النظام ، وتقع في غرفة مظلمة حيث سيتم إجراء فحص صندوق المكوك.
- في الغرفة المظلمة، ضع سمكة واحدة في وسط صندوق المكوك، وأمن الغطاء، وربط الأقطاب الكهربائية بإمدادات الطاقة.
ملاحظة: يجب أن تظل الغرفة مظلمة قدر الإمكان أثناء التأقلم والاختبار.
- في الغرفة المظلمة، ضع سمكة واحدة في وسط صندوق المكوك، وأمن الغطاء، وربط الأقطاب الكهربائية بإمدادات الطاقة.
- تأقلم السمك في مربع المكوك لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: ينبغي أن يبقى المحقق في الغرفة أثناء فترة التأقلم أو أن يعود إلى غرفة الاختبار بهدوء مع متسع من الوقت قبل الاختبار للسماح للأسماك بالتكيف مع وجود المحقق. ويمكن النظر في التأقلم الناجح عندما تستكشف الأسماك الخزان بحرية.- إذا فشلت الأسماك في الاستكشاف، استمر في التأقلم لمدة 15 دقيقة إضافية. إذا كانت الأسماك لا تزال تفشل في التأقلم مع مربع المكوك، وإزالة الأسماك. لا تستخدم هذه السمكة للاختبار.
- تألق يدويا 800 لومين مصباح يدوي عدسة حمراء ~ 2 سم من جدار مربع هلام على الجانب الذي تحتله الأسماك، بعد التأقلم.
ملاحظة: لا تبدأ تجربة إذا كانت السمكة يستريح بجوار السلك البلاتيني مقابل الجدار بالقرب من النهايات العميقة لصندوق المكوك. - تألق التحفيز الضوء مباشرة على الأسماك واتبع يدويا أي حركة الجانبية للأسماك مع الضوء لضمان التصور المستمر للتحفيز (الشكل 1C). الاستمرار في توفير التحفيز الخفيف حتى يتم استيفاء أي من الشروط التالية.
- النظر في درب ناجحة إذا عبرت الأسماك على نقطة منتصف الطريق من الخزان داخل 15 ق من التعرض للضوء. بمجرد أن تعبر السمكة منتصف الطريق، أوقف التحفيز الخفيف فورا (الشكل 1D).
- النظر في درب كما فشلت إذا كان السمك لا يعبر على نقطة منتصف الطريق من مربع في 15 s. في هذه الحالة، استخدم مصدر طاقة كهربائي لتطبيق حافز صدمة سلبية (20 mV:1 A) بالتناوب 2 s من On، 2 s of Off لمدة 15 s (بحد أقصى 4 صدمات)، أو حتى تمر السمكة في منتصف نقطة المربع، وعند هذه النقطة إنهاء كل من التحفيز الخفيف والسلبي.
- دع السمك يستريح لمدة 30 ق وكرر الخطوة (ق) 1.5-1.6.2. احتفظ بسجل مفصل لترتيب التجارب الناجحة (1.6.1) والمحاكمات الفاشلة (1.6.2).
ملاحظة: هنا، قمنا بتعريف التعلم على أنه إكمال 5 تجارب ناجحة متتالية. وبمجرد أن يتم إثبات التعلم، ينبغي إزالة الأسماك من صندوق المكوك والقتل الرحيم إنسانيا.
2. نموذج الذاكرة (الشكل 1A)
ملاحظة: يوفر هذا النموذج تقييما للذاكرة قصيرة وطويلة الأجل لمهمة معرفية ارتباطية متعلمة.
- فترة التدريب
- أضف 800 مل من مياه النظام إلى صندوق المكوك. جعل هذا الماء عن طريق حل 60 ملغ من المحيط الفوري في 1 لتر من المياه RO deionized. ملء المياه إلى منتصف الخزان إلى عمق 5 سم.
ملاحظة: ينبغي استبدال المياه بمياه النظام العذب عند 28 درجة مئوية كل ساعة أو بعد اختبار 3 أسماك. - ضع السمك 2-3 في خزان احتجاز يحتوي على مياه النظام ، ويقع في غرفة مظلمة حيث سيتم إجراء فحص صندوق المكوك.
- في الغرفة المظلمة، ضع سمكة واحدة في وسط صندوق المكوك، وأمن الغطاء، وربط الأقطاب الكهربائية بإمدادات الطاقة.
ملاحظة: يجب أن تظل الغرفة مظلمة قدر الإمكان أثناء التأقلم والاختبار. - تأقلم الأسماك في مربع المكوك لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: ينبغي أن يبقى المحقق في الغرفة أثناء فترة التأقلم أو أن يعود إلى غرفة الاختبار بهدوء مع متسع من الوقت قبل الاختبار للسماح للأسماك بالتكيف مع وجود المحقق. تحديد التأقلم الناجح عندما تقوم الأسماك باستكشاف الخزان بحرية. - إذا فشلت الأسماك في الاستكشاف، استمر في التأقلم لمدة 15 دقيقة إضافية. إذا كانت الأسماك لا تزال تفشل في التأقلم مع مربع المكوك، وإزالة الأسماك وعدم استخدامها للاختبار.
- بعد التأقلم الناجح، تألق يدويا مصباح يدوي عدسة حمراء 800 لومن ~ 2 سم من الجدار الجانبي مربع هلام، على جانب مربع المكوك الذي تشغله الأسماك.
- تألق التحفيز الضوء مباشرة على الأسماك واتبع أي حركة الجانبية للأسماك مع الضوء لضمان التصور المستمر للتحفيز من قبل الأسماك.
- في حين أن الضوء يضيء على الأسماك، وتطبيق في وقت واحد التحفيز صدمة سلبية (20 mV:1 A) بالتناوب 2 ق على، 2 ق قبالة لمدة 15 ق (بحد أقصى 4 صدمات)، أو حتى الأسماك يمر نقطة منتصف الطريق من مربع. وبمجرد تحقيق ذلك، قم بإنهاء كل من الضوء والتحفيز السلبي.
ملاحظة: السماح للأسماك للراحة لمدة 30 s ثم كرر الخطوة 2.1.6-2.1.8 لمدة 25 التكرار (الشكل 1A).
- أضف 800 مل من مياه النظام إلى صندوق المكوك. جعل هذا الماء عن طريق حل 60 ملغ من المحيط الفوري في 1 لتر من المياه RO deionized. ملء المياه إلى منتصف الخزان إلى عمق 5 سم.
- الاختبار الأولي
- السماح 15 دقيقة من الراحة للأسماك بعد فترة التدريب. لا تقم بإخراجها من صندوق المكوك. اختبار الاحتفاظ بالذاكرة الأولية عن طريق تسجيل كل تجربة كما تمرير بدقة / تفشل، مباشرة بعد هذه الفترة بقية.
- تطبيق فقط على ضوء التحفيز لمدة تصل إلى 15 ق وتسجيل الردود على النحو التالي.
- النظر في تجربة ناجحة إذا عبرت الأسماك على نقطة منتصف الطريق من مربع المكوك في غضون 15 s بعد بدء التحفيز الخفيفة. وقف التحفيز الخفيفة على الفور عندما تعبر الأسماك نقطة منتصف الطريق.
- النظر في التجربة كما فشلت إذا كانت الأسماك لا تعبر أكثر من نقطة منتصف الطريق من مربع المكوك 15 ق بعد بدء التحفيز الخفيفة. وقف التحفيز الخفيف بعد 15 s.
ملاحظة: أثناء الاختبار الأولي، لا يتم تطبيق حافز سلبي بعد محاولة فاشلة.
- كرر الخطوة 2.2.2، مع فترة راحة مدتها 30 ق بين التجارب، وتسجيل التجارب الناجحة (2.2.2.1) والمحاكمات الفاشلة (2.2.2.2) عبر 25 تجربة. وستكون هذه القيمة بمثابة مرجع فردي لكل سمكة.
- الذاكرة الفورية
- حث الإصابة مباشرة بعد فترة الاختبار الأولية من خلال نموذج الضرر المفضل (على سبيل المثال ، صدمة القوة الحادة باستخدام انخفاض وزن Marmarou المعدل). منزل الأسماك بشكل فردي لتحديد سهل. سجل قيم الاختبار الأولية الخاصة بهم وأعاد الأسماك إلى منشأة الحيوان.
ملاحظة: أصيب الأسماك من قبل TBI قوة حادة كما وصفها سابقا22. - جمع 2-3 الأسماك غير التالفة أو TBI 4 ساعة بعد الاختبار الأولي و / أو 4 ساعة بعد الإصابة (أو في الإطار الزمني التجريبي المعني) من منشأة الحيوان. إبقاء جميع الأسماك في غرفة مظلمة في خزانات الفردية التي تحتوي على مياه النظام.
- ضع السمك في وسط صندوق المكوك (المعد بمياه النظام كما هو موضح في 1.1) ، سمكة واحدة في وقت واحد ، وتأمين الغطاء. إرفاق إمدادات الطاقة والسماح للأسماك لتتأقلم لمدة 15 دقيقة.
- بعد التأقلم، قم بتقييم الذاكرة الفورية (تمرير/فشل صارم) من خلال تطبيق حافز الضوء فقط لمدة تصل إلى 15 ثانية وتسجيل الاستجابات على النحو التالي.
- اعتبر التجربة ناجحة إذا عبرت الأسماك عبر منتصف نقطة المربع خلال فترة الاختبار 15 s. إنهاء التحفيز الخفيف عند عبور منتصف الطريق.
- النظر في التجربة كما فشلت إذا كان السمك لا يعبر عبر نقطة منتصف الطريق من مربع في غضون 15 ق من بدء التحفيز الخفيفة. إنهاء التحفيز الخفيف بعد فترة 15 ق قد انتهت.
ملاحظة: أثناء هذا الاختبار بعد الإصابة، لا يتم تطبيق التحفيز الصدمة السلبية بعد محاولة فاشلة.
- كرر الخطوة 2.3.4، مع فترة راحة مدتها 30 ق بين التجارب، وسجل عدد التجارب الناجحة (2.3.4.1) والتجارب الفاشلة (2.3.4.2) عبر 25 تجربة.
- حساب الفرق في النسبة المئوية للتجارب الناجحة بعد الإصابة إلى فترة الاختبار الأولي باستخدام المعادلة:
- حث الإصابة مباشرة بعد فترة الاختبار الأولية من خلال نموذج الضرر المفضل (على سبيل المثال ، صدمة القوة الحادة باستخدام انخفاض وزن Marmarou المعدل). منزل الأسماك بشكل فردي لتحديد سهل. سجل قيم الاختبار الأولية الخاصة بهم وأعاد الأسماك إلى منشأة الحيوان.
- الذاكرة المتأخرة
- إعادة الأسماك، التي يتم إيواؤها بشكل فردي لتسهيل التعرف على قيم الاختبار الأولية وتسجيلها، إلى منشأة الحيوانات مباشرة بعد فترة الاختبار الأولية.
- السماح للأسماك 4 أيام (أو الإطار الزمني التجريبي المعني) بين الاختبار الأولي والإصابة و / أو تأخر اختبار الذاكرة.
- حث الإصابة من قبل نموذج الضرر المفضل (مثل انخفاض وزن مارمارو المعدل للحث على صدمة القوة الحادة). منزل الأسماك بشكل فردي لسهولة تحديد قيم الاختبار الأولي، وإعادة الأسماك إلى منشأة الحيوان.
ملاحظة: أصيب الأسماك من قبل TBI قوة حادة كما وصفها سابقا22. - جمع 2-3 الأسماك غير التالفة أو TBI 4 ساعة بعد الاختبار الأولي و / أو 4 ساعة بعد الإصابة (أو في الإطار الزمني التجريبي المعني) من منشأة الحيوان.
- إبقاء جميع الأسماك في غرفة مظلمة في خزانات الفردية التي تحتوي على مياه النظام، ووضع واحد في وقت واحد في وسط مربع المكوك (أعدت مع مياه النظام كما هو موضح في 1.1)، وتأمين الغطاء، نعلق على إمدادات الطاقة، والسماح للأسماك 15 دقيقة للتأقلم.
- بعد التأقلم، قم بتقييم الذاكرة الفورية (تمرير/فشل صارم) من خلال تطبيق حافز الضوء فقط لمدة تصل إلى 15 ثانية وتسجيل الردود التالية:
- النظر في درب ناجحة إذا عبرت الأسماك على نقطة منتصف الطريق من مربع خلال فترة الاختبار 15 ق. إنهاء التحفيز الخفيف عند عبور منتصف الطريق.
- النظر في درب كما فشلت إذا كان السمك لا يعبر أكثر من نقطة منتصف الطريق من مربع في غضون 15 ق من بدء التحفيز الخفيفة، وإنهاء التحفيز الخفيفة.
ملاحظة: أثناء هذا الاختبار بعد الإصابة، لا يتم تطبيق حافز صدمة سلبية بعد محاولة فاشلة.
- كرر الخطوة 2.4.6، مع فترة راحة مدتها 30 ق بين التجارب، وسجل عدد التجارب الناجحة (2.4.6.1) والتجارب الفاشلة (2.4.6.2) عبر 25 تجربة.
- حساب الفرق في المئة في التجارب الناجحة لما بعد الإصابة إلى فترة الاختبار الأولية مع المعادلة:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نموذج التعلم، المبين في البروتوكول وتخطيطي(الشكل 1)،يوفر تقييما سريعا للإدراك فيما يتعلق بالتعلم النقابي. بالإضافة إلى ذلك، يتمتع هذا النموذج بمستوى عال من الصرامة، من خلال تعريف التعلم على أنه عرض متكرر ومتسق ل 5 تجارب إيجابية متتالية. وينطبق هذا النموذج أيضا على مجموعة من الأعمار والإصابات. الأسماك غير التالفة في 8 أشهر (الشباب الكبار)، 18 شهرا (الكبار في منتصف العمر)، و 24 شهرا (الكبار المسنين) تتطلب عددا مماثلا من التجارب لمعرفة سلوك تجنب الضوء الأحمر (غير التالفة 8 م: 15.28 ± 4.92 التجارب، 18 م: 17.66 ± 5.5 تجارب، 24 م: 16.2 ± 4.79 تجربة، 8 م مقابل 18 م=0.92، 8 م مقابل 24 م=0.98، 18 م مقابل 24 م ص = 0.97، الشكل 2A). كما استخدم نموذج22 لإصابة الدماغ الرضية الشديدة القوة الحادة ولاحظنا أن الأسماك في أعمار مختلفة تتطلب عددا مماثلا من التجارب لإتقان الفحص عبر 1-5 أيام بعد الإصابة (نقطة في البوصة؛ 8 م مقابل 18 م، ص = 0.09، 8 م مقابل 24 م، ص = 0.96، 18 م مقابل 24 م، ص = 0.12، الشكل 2A). في اليوم الأول التالي ل sTBI، تطلبت الأسماك من جميع الأعمار (8 و18 و24 م) عددا مماثلا من التجارب لمعرفة السلوك (8 م: 73.3 ± 9.45 تجربة، 18 م: 79.33 ± 6.35 تجربة، 24 م: 68.25 ± 6.65 تجربة، 8 م مقابل 18 م=0.71، 8 م مقابل 24 م=0.76، 18 م مقابل 24 م=0.28، الشكل 2A) وكانت جميعها أكبر بكثير من الضوابط غير التالفة (p<0.01). بشكل جماعي، تثبت هذه البيانات أنه يمكن استخدام صندوق المكوك لفحص العجز المعرفي الناجم عن الإصابة عبر الفئات العمرية وتشير إلى أن سمك الحمار الوحشي البالغ يمكن أن يتعافى معرفيا بعد إصابة القوة الحادة.
نظرا لأن أحداث miTBI المتكررة يمكن أن تضعف بشكل متزايد الوظيفة المعرفية ، استخدمنا المقايسة المربع المكوكية كمقياس لتتبع التقدم المعتمد على الجرعة باستخدام TBI المتكرر. لقد استخدمنا هذا المقايسة لتقييم التعلم بعدإصابة القوة الحادة miTBI 22 التي تتكرر يوميا لفترات مختلفة من الزمن. وكما لوحظ سابقا، فإن الأسماك غير التالفة تتقن بسرعة المكوكية، محققة 5 تجارب إيجابية متتالية في 16.4 ± 3.5 تجارب(الشكل 2ب). يوم واحد بعد miTBI واحد، عرض الأسماك زيادة كبيرة في عدد التجارب لمعرفة السلوك (40.25 ± 12.65 التجارب، p<0.05، الشكل 2B). ازداد هذا العجز بعد أحداث miTBI 2 (48 ± 14.9 التجارب) وارتفع بعد 3 إصابات miTBI (56.63 ± 12.75 التجارب, الشكل 2B). بالإضافة إلى ذلك، لاحظنا زيادة كبيرة في ضعف الإدراك بين أسماك miTBI التي تلقت إصابة فريدة و 3 إصابات (p<0.05).
كما درسنا كيف تأثرت الذاكرة بعد أحداث miTBI المتكررة باستخدام البروتوكول لنماذج الذاكرة الفورية والمتأخرة(الشكل 1A). وأعطيت الأسماك الساذجة غير التالفة فترة تدريب وفترة اختبار أولية، أصيب بعدها جزء من الأسماك للذاكرة الفورية وأعيد آخرون إلى مرفق الأسماك لمدة 4 أيام للوصول إلى الذاكرة المتأخرة(الشكل 2C). تظهر الأسماك غير التالفة زيادة طفيفة في الفرق في المئة من التجارب الناجحة في كل من الذاكرة الفورية (6.22٪ ± 4.7٪) والذاكرة المتأخرة (6.13٪ ± 5.57٪) بالنسبة لفترة الاختبار الأولية. ثم درسنا تأثير أحداث TBI متعددة القوة الحادة على الذاكرة. لوحظ عجز كبير بعد miTBI في الذاكرة الفورية، ولكن ليس في الذاكرة المتأخرة. بعد miTBI واحد، أظهرت الأسماك عجز الذاكرة الفورية كبيرة (-26.77٪ ± 8.93٪) مقارنة مع الأسماك غير التالفة (p<0.0001، الشكل 2C). واستمر هذا الاتجاه مع الإصابة المتكررة مع زيادة العجز بعد كل من 2x miTBI (-37.42٪ ± 10.01٪) و3x miTBI (-39.71٪ ± 11.39٪). وعلاوة على ذلك، لاحظنا تأثير جرعة مماثلة بين الأسماك تعامل مع واحد (1x) miTBI و miTBI 3x (p<0.05، الشكل 2C). وتشير هذه البيانات إلى أن التعلم والذاكرة يتم تقليلهما في أسماك miTBI مع تزايد عدد الإصابات ، مما يزيد بشكل كبير من العجز ، كما أن المقايسة المربعة المكوكية والبروتوكولات الموصوفة أعلاه حساسة بما يكفي للكشف عن هذه الاختلافات.
الشكل 1: المكوك مربع المقايسة. (أ)نظرة عامة تعليمية لنماذج التعلم والذاكرة للتقييم المعرفي. (ب) تخطيطي لصندوق جل الحمض النووي كبير المحولة للمقاايسة مربع المكوك. (C, D) تمثيل رسومي لتطبيق المحفزات أثناء التجارب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: Zebrafish عرض العجز المعرفي بعد TBI قوة حادة. (أ) التالية sTBI, حمار وحشي في 8, 18, و 24 أشهر من العمر معرض العجز التعلم التي لا تختلف اختلافا كبيرا بين الفئات العمرية. ولوحظت زيادات كبيرة في عدد التجارب لمعرفة نموذج صندوق المكوك مقارنة بالضوابط المطابقة للعمر عند نقطة أساس واحدة تعود إلى مستويات غير متضررة بنسبة 4-5 نقطة في البوصة. (B, C) عرض الأسماك miTBI المتكررة على حد سواء التعلم (ب) والذاكرة (ج) العجز بطريقة تعتمد على الجرعة. يتم رسم متوسط ± SEM في A و B، بينما يتم رسم متوسط الانحراف المعياري ± في C. تمثل كل نقطة بيانات على جميع الرسوم البيانية الثلاثة سمك حمار وحشي بالغ واحد. وأجريت التحليلات الإحصائية إما باستخدام ANOVA أحادية الاتجاه أو ذات اتجاهين يليها اختبار توكي اللاحق. # ع <0.05 ، # # ص <0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يؤثر الضعف الإدراكي بشكل كبير وسلبي على جودة الحياة. بسبب زيادة الرؤية وحدوث الارتجاج وإصابات الدماغ الرضية في جميع أنحاء السكان ، من المهم أن نفهم كيف تسبب ضعف الإدراك وكيف يمكن تقليل الضرر أو عكسه. لهذه الأسباب، تلعب الكائنات الحية النموذجية التي يمكن اختبارها للتدهور المعرفي دورا حاسما في هذه الدراسات. القوارض منذ فترة طويلة النموذج الأساسي للتحقيق في neurobehavior والإدراك، ومع ذلك، ظهرت حمار وحشي كنموذج مفيد مع العديد من السلوكيات المتميزة للتحقيق في مجموعة من النمو، المرتبطة بالعمر، واكتسبت العجز المعرفي17،20،23،24،25،26. وقد استخدمت أساليب مختلفة لتقييم الإدراك من التعلم أحادي البعد في شكل التعود، إلى التعلم المعقد والذاكرة المكانية، كائن الرواية والتعرف على الموقع، واتخاذ القرار18،19،20،21،27،28. ومع ذلك، تقتصر هذه الاختبارات المعرفية على اختبار الإدراك غير النقابي أو تتطلب إعدادا معقدا أو استثمارا ماليا في المعدات أو التزاما زمنيا مكثفا قبل إجراء الاختبارات. وعلى النقيض من ذلك، يستخدم صندوق المكوك ونماذج التعلم والذاكرة الموصوفة هنا م المقايسة المعقدة للتعلم الترابطي الفعالة من حيث التكلفة، والقابلية للتقييم السريع، والقابلة للتوظيف بسهولة من قبل محقق مبتدئ. الأهم من ذلك، بما يتفق مع الاختبارات المعرفية الأخرى، لدينا المقايسة يدل على أن الأسماك غير التالفة تعلم بسرعة المهمة النقابية ويمكن أن الذاكرة المهمة بعد أيام دون تدريب متقطع29.
توفر قابلية التكيف للمقاسة سبلا للتحقيق في النقاط الزمنية المختلفة للتعلم والذاكرة كمقياس لتطور المرض أو التدخلات الميكانيكية. هناك ميزتان أساسيتان للمقاسة. أولا، الطريقة بسيطة. وسرعان ما يتم إعداد هذا الفحص، ويحظى بنقاط نهاية واضحة ومتميزة فيما يتعلق بالمحاكمات الناجحة وال فاشلة، مما يجعلها في متناول مجموعة من المحققين. وجدنا أنه بسبب بساطة هذا المقايسة ، هناك القليل جدا من استكشاف الأخطاء وإصلاحها اللازمة لاستخدام مربع المكوك بنجاح. ثانيا، الفحص سريع للغاية بالمقارنة مع الامتحانات المعرفية الأخرى، التي توفر المرونة أو القدرة على فحص عدد كبير من الأسماك بسرعة في يوم واحد. الوقت لتقييم التعلم هو في الحد الأدنى 19.75 دقيقة (الشكل 1)، مع الأسماك التي تتطلب 15 دقيقة للتأقلم مع مربع المكوك (التي يحددها استكشاف خزان)، تليها تجربة واحدة فاشلة (15 s التحفيز الخفيف، 15 s التحفيز النفور، 30 ق بين التجارب) و 5 التجارب الإيجابية الفورية والمتعاقبة (<15 s التحفيز الخفيف). في الممارسة العملية، لاحظنا أن الأسماك غير التالفة تتطلب 6-30 تجربة (19.75 دقيقة -43.75 دقيقة)، في حين أنه في الحالات القصوى (بعد صدمة حادة في القوة الحادة)، يمكن أن يتطلب العجز الأكثر حدة 100 تجربة (113.75 دقيقة). كما يتم إجراء دراسات الذاكرة بسرعة. بعد مخطط البروتوكول ، فإن الحد الأدنى من الوقت اللازم للتأقلم والتدريب والاختبار الأولي هو 67.5 دقيقة (15 دقيقة تأقلم ، 25 تكرارا للضوء والصدمة لمدة 15 s ، 30 s rest between trials ، وتكرار الاختبار الأولي دون المحفزات الضارة). في حين أن إعادة اختبار الذاكرة الفورية أو المتأخرة تتطلب 33.75 دقيقة فقط (15 دقيقة تأقلم ، 25 تكرارا لتحفيز الضوء فقط لمدة 15 عاما ، و 30 ق الراحة بين التجارب) ، بغض النظر عن الإصابة أو العلاج أو العجز المعرفي.
عند تقييم neurobehavior، نماذج مختلفة تستخدم المحفزات الإيجابية أو السلبية. يمكن أن تساعد المحفزات الإيجابية في شكل تفاعل غذائي أو اجتماعي ، غالبا ما تستخدم في متاهات T-box الكلاسيكية ، في استجابة قوية لمهمة متعلمة. ومع ذلك، فإن المقايسات التي تستخدم الارتباط الإيجابي تفعل ذلك على حساب الوقت. وعلى النقيض من ذلك، ففي حين أن التكييف استجابة لتحفيز سلبي يوفر ارتباطا سريعا واستجابة سلوكية قوية، إلا أنه على حساب التحفيز السلبي. وغالبا ما تتعلم الأسماك غير التالفة المقايسة المكوكية بسرعة، وبالتالي تتعرض لعدد ضئيل من الصدمات، ونتيجة لذلك يبدو أنها لا تتعرض لأي أحداث سلبية. ومع ذلك، تتطلب الأسماك المعرضة للخطر العصبي (TBI)، مع العجز المعرفي الحاد، عددا كبيرا من التجارب والصدمات الكهربائية. وقد لوحظ أن هذه الصدمات المتعددة تؤدي أحيانا إلى نوبات منشطية كلونيك. أي سمكة تعاني من نوبة منشط كلونيك بينما داخل مربع المكوك ينبغي إزالتها على الفور والقتل الرحيم أخلاقيا. وينبغي استبعاد جميع التجارب على الأسماك القتل الرحيم، حتى حدث الضبط، بما في ذلك في أي تحليل إحصائي. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الصدمة الكهربائية التي يتعرض لها شخص متضرر عصبيا يمكن أن تفرض اختلافات غير مقصودة بين الأسماك التالفة التي تنتج ولا تنتج عن صندوق المكوك. ولهذا السبب، نقترح عدم استخدام جميع الأسماك الخاضعة لتقييم الخافوي العصبي لأي مقياس كمي آخر (العلامة الحيوية المصلية، IHC، وما إلى ذلك). من المهم أيضا أن نفهم أن هذه الطريقة في التعلم تقوم على التحفيز البصري وغير مناسبة للضرر الذي قد يعرض الدوائر البصرية للخطر ، لأنها سوف تربك النتائج.
نتائجنا تثبت أنه بعد TBI قوة حادة، حمار وحشي تظهر العجز المعرفي السريع الذي يؤدي إلى زيادة التجارب لإتقان مهمة الترابطية في المقايسة مربع المكوك. وينظر إلى العجز الفوري مماثلة في نماذج القوارض من TBI، ولكن هذه العجز يمكن أن تقلل، فإنها غالبا ما تستمر وتبقى كبيرة30. في المقابل، تعرض سمكة الحمار الوحشي التعافي المعرفي في غضون 7 أيام بعد الإصابة. القدرة التجديدية للحمار الوحشي البالغ موثقة جيدا9،10،11،12،13،14،15، مع منافذ عصبية معروفة في المناطق البطينية / البطينية من telencephalon31،32. يوفر التعافي المعرفي الملاحظ في المقايسة التالية ل TBI نظرة ثاقبة للامتحانات اللازمة لتحديد ما إذا كانت هذه المنافذ العصبية يتم تحفيزها وتلعب دورا في الأنسجة والتعافي المعرفي.
في الختام، يوفر صندوق المكوك تقييما سريعا للإدراك فيما يتعلق بالتعلم والذاكرة الترابطية. يستخدم المقايسة الحد الأدنى من المعدات والدير وهي بسيطة من الناحية الفنية. ويمكن استخدام التطبيقات المستقبلية لتقييم التدخلات الوراثية والصيدلانية للأسماك المهينة عصبيا فيما يتعلق بالبروت الحماية العصبية وكذلك نماذج الإصابات الأخرى أو النماذج العصبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
ويود المؤلفون أن يشكروا أعضاء مختبر هايد على مناقشاتهم المدروسة وفنيي مركز فرايمان لعلوم الحياة على رعاية وتربية سمك الحمار الوحشي. تم دعم هذا العمل من قبل مركز أبحاث زيبرافيش في جامعة نوتردام، ومركز الخلايا الجذعية والطب التجديدي في جامعة نوتردام، والمنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون في NIH R01-EY018417 (DRH)، وبرنامج زمالة أبحاث الدراسات العليا التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم (JTH)، وزمالة LTC نيل هايلاند من نوتردام (JTH)، زمالة حراس الحرية (JTH)، ومنحة بات تيلمان (JTH). الشكل 1 المصنوع من BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
- Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
- Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
- Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
- Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
- Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L.
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
- GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
- López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
- Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
- Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
- Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
- Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
- Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V.
- Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
- Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
- Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
- Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
