Summary
El aprendizaje y la memoria son métricas potentes en el estudio de los deterioros cognitivos del desarrollo, dependientes de enfermedades o inducidos por el medio ambiente. La mayoría de las evaluaciones cognitivas requieren equipo especializado y amplios compromisos de tiempo. Sin embargo, el ensayo de caja de transporte es una herramienta de aprendizaje asociativo que utiliza una caja de gel convencional para una evaluación rápida y confiable de la cognición del pez cebra adulto.
Abstract
Los déficits cognitivos, incluidos los problemas de aprendizaje y memoria, son un síntoma principal de diversas enfermedades neurodegenerativas relacionadas con el desarrollo y la edad y la lesión cerebral traumática (LCT). El pez cebra es un modelo importante de neurociencia debido a su transparencia durante el desarrollo y sus sólidas capacidades regenerativas después del neurotrauma. Si bien existen varias pruebas cognitivas en el pez cebra, la mayoría de las evaluaciones cognitivas que son rápidas examinan el aprendizaje no asociativo. Al mismo tiempo, los ensayos de aprendizaje asociativo a menudo requieren varios días o semanas. Aquí, describimos una prueba rápida de aprendizaje asociativo que utiliza un estímulo adverso (descarga eléctrica) y requiere un tiempo de preparación mínimo. El ensayo de la caja de transporte, presentado aquí, es simple, ideal para investigadores novatos y requiere un equipo mínimo. Demostramos que, después de una LCT, esta prueba de caja de transporte evalúa de manera reproducible el déficit cognitivo y la recuperación de peces cebra jóvenes a viejos. Además, el ensayo es adaptable para examinar la memoria inmediata o retardada. Demostramos que tanto una sola LCT como los eventos repetidos de LCT afectan negativamente el aprendizaje y la memoria inmediata, pero no la memoria retardada. Por lo tanto, concluimos que el ensayo de la caja del transbordador rastrea de manera reproducible la progresión y la recuperación del deterioro cognitivo.
Introduction
El aprendizaje y la memoria se utilizan rutinariamente como métricas de deterioro cognitivo, que ocurre debido al envejecimiento, enfermedades neurodegenerativas o lesiones. Las lesiones cerebrales traumáticas (LCT) son la lesión más común que resulta en déficits cognitivos. Las LCT son de creciente preocupación debido a su asociación con varios trastornos neurodegenerativos, como la demencia frontotemporal y la enfermedad de Parkinson1,2. Además, el aumento de las agregaciones beta-amiloides observadas en algunos pacientes con LCT sugiere que también puede estar asociado con el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer3,4. Las LCT a menudo son el resultado de un traumatismo por fuerza contundente y abarcan una variedad de gravedades5, siendolas lesiones cerebrales leves (miTBI) las más comunes. Sin embargo, los miTBIs a menudo no se informan y se diagnostican erróneamente porque resultan en deficiencias cognitivas menores durante un corto período, y los individuos lesionados generalmente se recuperan por completo6. En contraste, los eventos repetidos de miTBI han sido una preocupación creciente porque es altamente prevalente en adultos jóvenes y de mediana edad, puede acumularse con el tiempo7,puede afectar el desarrollo cognitivo y exacerbar las enfermedades neurodegenerativas1,2,3,4,5,similar a las personas que experimentan una LCT moderada o grave8.
El pez cebra(Danio rerio)es un modelo útil para explorar una variedad de temas en neurociencia, incluida la capacidad de regenerar neuronas perdidas o dañadas en todo el sistema nervioso central9,10,11,12,13. La regeneración neuronal también se demostró en el telencéfalo, que contiene el archipalio en la región dorsal-interna. Esta región neuroanatómica es análoga al hipocampo y es probable que sea necesaria para la cognición en peces y para la memoria de corto tiempo en humanos14,15,16. Además, el comportamiento del pez cebra ha sido ampliamente caracterizado y catalogado17. El aprendizaje ha sido estudiado a través de diversas técnicas, entre ellas la habituación a la respuesta de sobresalto18,que puede representar una forma rápida de aprendizaje no asociativo cuando se realiza en bloques cortos y con atención al rápido tiempo de decaimiento19. Se utilizan pruebas más complejas de aprendizaje asociativo, como T-boxes, laberintos plus y discriminación visual20,21, pero a menudo consumen mucho tiempo, requieren días o semanas de preparación y dependen de cardúmenes o refuerzo positivo. Aquí, describimos un paradigma rápido para evaluar tanto el aprendizaje asociativo como la memoria inmediata o retardada. Este ensayo de caja de lanzadera utiliza un estímulo aversivo y un condicionamiento de refuerzo negativo para evaluar los déficits cognitivos y la recuperación después de una LCT de fuerza contundente. Demostramos que el pez cebra adulto de control no dañado (8-24 meses) aprende de manera reproducible a evitar la luz roja dentro de los 20 ensayos (<20 minutos de evaluación) en la caja del transbordador, con un alto grado de consistencia entre los observadores. Además, utilizando la caja lanzadera demostramos que las habilidades de aprendizaje y memoria en adultos (8-24 meses de edad) son consistentes y son útiles para analizar la cognición con deficiencias significativas entre diferentes severidades de TBI o TBI repetidas. Además, este método podría emplearse rápidamente como una métrica para rastrear una amplia gama de progresiones de la enfermedad o la eficacia de las intervenciones farmacológicas que afectan el mantenimiento o la recuperación de la cognición en el pez cebra adulto.
Aquí, proporcionamos una visión general instructiva de una evaluación cognitiva rápida que puede examinar tanto el aprendizaje asociativo complejo (sección 1) como la memoria en términos de memoria inmediata y retardada. Este paradigma proporciona una evaluación de la memoria a corto y largo plazo de una tarea cognitiva asociativa aprendida (sección 2).
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Protocol
El pez cebra se crió y mantuvo en las instalaciones de Notre Dame Zebrafish en el Centro de Ciencias de la Vida Freimann. Los métodos descritos en este manuscrito fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Notre Dame (Número de Garantía de Bienestar Animal A3093-01).
1. Paradigma de aprendizaje de la caja del transbordador (Figura 1A)
NOTA: El paradigma de aprendizaje proporciona una evaluación rápida de la cognición con respecto al aprendizaje asociativo.
- Prepare la caja de transporte modificando una caja de gel de 30,5 x 19 x 7,5 cm con una pieza de plexiglás de grado de acuario de 5 x 19 cm agregada a cada lado en un ángulo de 45 °. Haga una línea que marque el punto medio del tanque para evaluar cuándo los peces han cruzado el medio del tanque(Figura 1B).
- Agregue 800 ml de agua del sistema a la caja del transbordador. Haga esta agua disolviendo 60 mg de Instant Ocean en 1 L de agua RO desionizada. Llene el agua hasta el centro del tanque a una profundidad de 5 cm.
NOTA: Reemplace con agua fresca del sistema a 28 ° C cada h o después de probar 3 peces. - Coloque 2-3 peces en un tanque de retención que contenga agua del sistema, ubicado en una habitación oscura donde se realizará el ensayo de la caja del transbordador.
- En la habitación oscura, coloque 1 pez en el centro de la caja del transbordador, asegure la tapa y conecte los electrodos a una fuente de alimentación.
NOTA: La habitación debe permanecer lo más oscura posible durante la aclimatación y las pruebas.
- En la habitación oscura, coloque 1 pez en el centro de la caja del transbordador, asegure la tapa y conecte los electrodos a una fuente de alimentación.
- Aclimata los peces en la caja del transbordador durante 15 min.
NOTA: El investigador debe permanecer en la habitación durante el período de aclimatación o regresar a la sala de pruebas en silencio con tiempo suficiente antes de la prueba para permitir que los peces se ajusten a la presencia del investigador. La aclimatación exitosa se puede considerar cuando el pez explora libremente el tanque.- Si el pez no explora, continúe la aclimatación durante 15 minutos adicionales. Si el pez aún no se aclimata a la caja del transbordador, retire el pescado. No use este pez para las pruebas.
- Haga brillar manualmente una linterna de lente roja de 800 lúmenes ~ 2 cm de la pared de la caja de gel en el lado ocupado por el pez, después de la aclimatación.
NOTA: No inicie una prueba si el pez está descansando junto al alambre de platino contra la pared cerca de los extremos profundos de la caja del transbordador. - Haga brillar el estímulo de luz directamente sobre el pez y siga manualmente cualquier movimiento lateral del pez con la luz para garantizar la visualización continua del estímulo(Figura 1C). Continúe proporcionando el estímulo de luz hasta que se cumpla cualquiera de las siguientes condiciones.
- Considere el sendero exitoso si el pez cruza el punto medio del tanque dentro de los 15 s de exposición a la luz. Una vez que el pez cruce el punto medio, detenga el estímulo de luz inmediatamente(Figura 1D).
- Considere el sendero como fallido si el pez no cruza el punto medio de la caja en 15 s. En este caso, utilice una fuente de alimentación por electroforesis para aplicar un estímulo de choque negativo (20 mV: 1 A) alternando 2 s de Encendido, 2 s de Apagado durante un período de 15 s (máximo de 4 choques), o hasta que el pez pase el punto medio de la caja, momento en el que terminan tanto la luz como el estímulo negativo.
- Deje reposar el pescado durante 30 s y repita paso(s) 1.5-1.6.2. Mantenga un registro detallado del orden de los ensayos exitosos (1.6.1) y los ensayos fallidos (1.6.2).
NOTA: Aquí, definimos el aprendizaje como la finalización de 5 ensayos exitosos consecutivos. Una vez que se ha demostrado el aprendizaje, el pez debe ser retirado de la caja del transbordador y sacrificado humanamente.
2. Paradigma de memoria (Figura 1A)
NOTA: Este paradigma proporciona una evaluación de la memoria a corto y largo plazo de una tarea cognitiva asociativa aprendida.
- Periodo de formación
- Agregue 800 ml de agua del sistema a la caja del transbordador. Haga esta agua disolviendo 60 mg de Instant Ocean en 1 L de agua RO desionizada. Llene el agua hasta el centro del tanque a una profundidad de 5 cm.
NOTA: El agua debe reemplazarse con agua fresca del sistema a 28 ° C cada h o después de probar 3 peces. - Coloque 2-3 peces en un tanque de retención que contenga agua del sistema, ubicado en una habitación oscura donde se realizará el ensayo de la caja del transbordador.
- En la habitación oscura, coloque 1 pez en el centro de la caja del transbordador, asegure la tapa y conecte los electrodos a una fuente de alimentación.
NOTA: La habitación debe permanecer lo más oscura posible durante la aclimatación y las pruebas. - Aclimatar los peces en la caja del transbordador durante 15 min.
NOTA: El investigador debe permanecer en la habitación durante el período de aclimatación o regresar a la sala de pruebas en silencio con tiempo suficiente antes de la prueba para permitir que los peces se ajusten a la presencia del investigador. Determine la aclimatación exitosa cuando el pez está explorando libremente el tanque. - Si el pez no explora, continúe la aclimatación durante 15 minutos adicionales. Si el pez aún no se aclimata a la caja del transbordador, retire el pescado y no lo use para las pruebas.
- Después de la aclimatación exitosa, haga brillar manualmente una linterna de lente roja de 800 lúmenes ~ 2 cm de la pared lateral de la caja de gel, en el lado de la caja del transbordador que está ocupada por los peces.
- Haga brillar el estímulo de luz directamente sobre el pez y siga cualquier movimiento lateral del pez con la luz para garantizar la visualización continua del estímulo por parte del pez.
- Mientras la luz brilla sobre los peces, aplique simultáneamente el estímulo de choque adverso (20 mV: 1 A) alternando 2 s On, 2 s Off durante 15 s (máximo de 4 choques), o hasta que el pez pase el punto medio de la caja. Una vez logrado esto, termine tanto la luz como el estímulo adverso.
NOTA: Deje que el pez descanse durante 30 s y luego repita el paso 2.1.6-2.1.8 durante 25 iteraciones(Figura 1A).
- Agregue 800 ml de agua del sistema a la caja del transbordador. Haga esta agua disolviendo 60 mg de Instant Ocean en 1 L de agua RO desionizada. Llene el agua hasta el centro del tanque a una profundidad de 5 cm.
- Pruebas iniciales
- Permita 15 minutos de descanso a los peces después del período de entrenamiento. No los retire de la caja del transbordador. Pruebe la retención de memoria inicial registrando cada prueba como estrictamente aprobada / reprobado, inmediatamente después de este período de descanso.
- Aplique solo el estímulo de luz durante un máximo de 15 s y registre las respuestas de la siguiente manera.
- Considere que el ensayo es exitoso si el pez cruza el punto medio de la caja del transbordador dentro de los 15 s posteriores al inicio del estímulo de luz. Detenga el estímulo de la luz inmediatamente cuando el pez cruce el punto medio.
- Considere el ensayo como fallido si el pez no cruza el punto medio de la caja del transbordador 15 s después de iniciar el estímulo de luz. Detenga el estímulo de la luz después de 15 s.
NOTA: Durante la prueba inicial, no se aplica un estímulo adverso después de un intento fallido.
- Repita el paso 2.2.2, con un período de descanso de 30 s entre ensayos, y registre los ensayos exitosos (2.2.2.1) y los ensayos fallidos (2.2.2.2) en 25 ensayos. Este valor servirá como referencia individual para cada pez.
- Memoria inmediata
- Inducir lesiones inmediatamente después del período de prueba inicial por el paradigma de daño preferido (por ejemplo, un trauma de fuerza contundente utilizando la caída de peso de Marmarou modificada). Casa los peces individualmente para una fácil identificación. Registre sus valores iniciales de prueba y devuelva los peces a la instalación de animales.
NOTA: Los peces resultaron heridos por una LCT de fuerza contundente como se describió anteriormente22. - Reúna 2-3 peces no dañados o con LCT 4 h después de la prueba inicial y / o 4 h después de la lesión (o en el marco de tiempo experimental en cuestión) de la instalación de animales. Mantenga a todos los peces en la habitación oscura en tanques individuales que contengan agua del sistema.
- Coloque el pescado en el centro de la caja del transbordador (preparado con agua del sistema como se describe en 1.1), un pez a la vez y asegure la tapa. Conecte la fuente de alimentación y permita que los peces se aclimaten durante 15 minutos.
- Después de la aclimatación, evalúe la memoria inmediata (estrictamente pasar / fallar) aplicando solo el estímulo de luz durante un máximo de 15 s y registre las respuestas de la siguiente manera.
- Considere que la prueba es exitosa si el pez cruza el punto medio de la caja dentro del período de prueba de 15 s. Termine el estímulo de luz al cruzar el punto medio.
- Considere el ensayo como fallido si el pez no cruza el punto medio de la caja dentro de los 15 s posteriores al inicio del estímulo de luz. Termine el estímulo de luz después de que termine el período de 15 s.
NOTA: Durante esta prueba posterior a la lesión, el estímulo de choque adverso no se aplica después de un intento fallido.
- Repita el paso 2.3.4, con un período de descanso de 30 s entre ensayos, y registre el número de ensayos exitosos (2.3.4.1) y los ensayos fallidos (2.3.4.2) en 25 ensayos.
- Calcule la diferencia porcentual en los ensayos exitosos después de la lesión con respecto al período de prueba inicial utilizando la ecuación:
- Inducir lesiones inmediatamente después del período de prueba inicial por el paradigma de daño preferido (por ejemplo, un trauma de fuerza contundente utilizando la caída de peso de Marmarou modificada). Casa los peces individualmente para una fácil identificación. Registre sus valores iniciales de prueba y devuelva los peces a la instalación de animales.
- Retraso en la memoria
- Devolver los peces, alojados individualmente para facilitar la identificación y el registro de sus valores iniciales de ensayo, a la instalación de animales inmediatamente después del período de ensayo inicial.
- Permita que los peces 4 días (o el período de tiempo experimental en cuestión) entre la prueba inicial y la lesión y / o la prueba de memoria retrasada.
- Inducir lesiones por el paradigma de daño preferido (como la caída de peso de Marmarou modificada para inducir un trauma de fuerza contundente). Aloja a los peces individualmente para facilitar la identificación de los valores iniciales de las pruebas y devuelve los peces a la instalación de animales.
NOTA: Los peces resultaron heridos por una LCT de fuerza contundente como se describió anteriormente22. - Reúna 2-3 peces no dañados o con LCT 4 h después de la prueba inicial y / o 4 h después de la lesión (o en el marco de tiempo experimental en cuestión) de la instalación de animales.
- Mantenga a todos los peces en la habitación oscura en tanques individuales que contengan agua del sistema, y coloque uno a la vez en el centro de la caja del transbordador (preparada con agua del sistema como se describe en 1.1), asegure la tapa, conecte la fuente de alimentación y permita que los peces se aclimaten durante 15 minutos.
- Después de la aclimatación, evalúe la memoria inmediata (estrictamente pasar / fallar) aplicando solo el estímulo de luz durante un máximo de 15 s y registre las siguientes respuestas:
- Considere que el sendero es exitoso si el pez cruza el punto medio de la caja dentro del período de prueba de 15 s. Termine el estímulo de luz al cruzar el punto medio.
- Considere el rastro como fallido si el pez no cruza el punto medio de la caja dentro de los 15 s de comenzar el estímulo de luz, termine el estímulo de luz.
NOTA: Durante esta prueba posterior a la lesión, no se aplica un estímulo de choque adverso después de un intento fallido.
- Repita el paso 2.4.6, con un período de descanso de 30 s entre ensayos, y registre el número de ensayos exitosos (2.4.6.1) y los ensayos fallidos (2.4.6.2) en 25 ensayos.
- Calcule la diferencia porcentual en los ensayos exitosos posteriores a la lesión con respecto al período de prueba inicial con la ecuación:
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Representative Results
El paradigma de aprendizaje, esbozado en el protocolo y esquema(Figura 1),proporciona una evaluación rápida de la cognición con respecto al aprendizaje asociativo. Además, este paradigma tiene un alto nivel de rigurosidad, al definir el aprendizaje como una exhibición repetida y consistente de 5 ensayos positivos consecutivos. Este paradigma también es aplicable a una variedad de edades y lesiones. Los peces no dañados a los 8 meses (adulto joven), 18 meses (adulto de mediana edad) y 24 meses (adultos mayores) requirieron un número similar de ensayos para aprender el comportamiento de evitar la luz roja (No dañados 8 m: 15,28 ± 4,92 ensayos, 18 m: 17,66 ± 5,5 ensayos, 24 m: 16,2 ± 4,79 ensayos, 8 m frente a 18 m p = 0,92, 8 m vs. 24 m p = 0,98, 18 m vs. 24 m p=0,97, Figura 2A). También utilizamos un modelo22 de lesión cerebral traumática de fuerza contundente grave (sTBI) y observamos que los peces de diferentes edades requirieron un número similar de ensayos para dominar el ensayo durante 1-5 días después de la lesión (dpi; 8 m vs 18 m, p = 0.09, 8 m vs 24 m, p = 0.96, 18 m vs 24 m, p = 0.12, Figura 2A). En el día 1 después de sTBI, los peces de todas las edades (8, 18 y 24 m) requirieron un número similar de ensayos para aprender el comportamiento (8 m: 73,3 ± 9,45 ensayos, 18 m: 79,33 ± 6,35 ensayos, 24 m: 68,25 ± 6,65 ensayos, 8 m frente a 18 m p = 0,71, 8 m frente a 24 m p = 0,76, 18 m frente a 24 m p = 0,28, Figura 2A) y todos fueron significativamente mayores que los controles no dañados (p<0,01). En conjunto, estos datos demuestran que la caja del transbordador se puede utilizar para examinar los déficits cognitivos inducidos por lesiones en todos los rangos de edad y sugieren que el pez cebra adulto puede recuperarse cognitivamente después de una lesión por fuerza contundente.
Debido a que los eventos repetidos de miTBI pueden afectar cada vez más la función cognitiva, utilizamos el ensayo de caja de transbordador como una métrica para rastrear la progresión dependiente de la dosis utilizando TBI repetitiva. Empleamos este ensayo para evaluar el aprendizaje después de una lesión por fuerza contundente miTBI22 que se repite diariamente durante los diferentes períodos de tiempo. Como se observó anteriormente, los peces no dañados dominaron rápidamente la caja de transbordadores logrando 5 ensayos positivos consecutivos en 16,4 ± 3,5 ensayos(Figura 2B). Un día después de un solo miTBI, los peces muestran un aumento significativo en el número de ensayos para aprender el comportamiento (40.25 ± 12.65 ensayos, p<0.05, Figura 2B). Este déficit aumentó después de 2 eventos de miTBI (48 ± 14,9 ensayos) y se elevó aún más después de 3 lesiones de miTBI (56,63 ± 12,75 ensayos, Figura 2B). Adicionalmente, observamos un aumento significativo del deterioro cognitivo entre los peces miTBI que recibieron una lesión singular y 3 lesiones (p<0,05).
También examinamos cómo la memoria se vio afectada después de eventos repetidos de miTBI utilizando el protocolo para paradigmas de memoria inmediata y retardada(Figura 1A). A los peces ingenuos no dañados se les dio un período de entrenamiento y un período de prueba inicial, después del cual una parte de los peces resultaron heridos para la memoria inmediata y otros fueron devueltos a la instalación de peces durante 4 días para acceder a la memoria retrasada(Figura 2C). Los peces no dañados exhiben un ligero aumento en la diferencia porcentual de los ensayos exitosos tanto en la memoria inmediata (6,22% ± 4,7%) como en la memoria retardada (6,13% ± 5,57%) en relación con el período de prueba inicial. Luego examinamos el efecto de múltiples eventos de LCT de fuerza contundente que tenían en la memoria. Se observaron déficits significativos después de miTBI en la memoria inmediata, pero no en la memoria retardada. Después de un solo miTBI, los peces mostraron déficits de memoria inmediatos significativos (-26.77% ± 8.93%) en comparación con los peces no dañados (p<0.0001, Figura 2C). Esta tendencia continuó con lesiones repetidas con déficits crecientes después de 2x miTBI (-37.42% ± 10.01%) y 3x miTBI (-39.71% ± 11.39%). Además, observamos un efecto de dosis similar entre los peces tratados con un solo (1x) miTBI y 3x miTBI (p<0,05, Figura 2C). Estos datos sugieren que el aprendizaje y la memoria se reducen en los peces miTBI con el aumento del número de lesiones, lo que aumenta significativamente el déficit y el ensayo y los protocolos de la caja de transbordador descritos anteriormente son lo suficientemente sensibles como para detectar estas diferencias.
Figura 1: Ensayo de la caja del transbordador. (A) Visión general de la instrucción de los paradigmas de aprendizaje y memoria para la evaluación cognitiva. (B) Esquema de una caja de gel de ADN grande convertida para el ensayo de caja de transbordador. (C,D) Representación gráfica de la aplicación de estímulos durante los ensayos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:El pez cebra muestra déficits cognitivos después de una LCT de fuerza contundente. (A) Después de la LCT, el pez cebra a los 8, 18 y 24 meses de edad exhibe déficits de aprendizaje que no son significativamente diferentes entre los grupos de edad. Se observaron aumentos significativos en el número de ensayos para aprender el paradigma de la caja de lanzadera en comparación con los controles emparejados por edad a 1 dpi que volvían a niveles no dañados en 4-5 dpi. (B,C) Los peces miTBI repetidos mostraron déficits de aprendizaje(B)y de memoria(C)de una manera dependiente de la dosis. La media ± SEM se grafitra en A y B,mientras que la media ± desviación estándar se traza en C. Cada punto de datos en los tres gráficos representa un solo pez cebra adulto. Los análisis estadísticos se realizaron con un ANOVA unidireccional o bidireccional seguido de una prueba post-hoc de Tukey. # p<0.05, ## p<0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El deterioro cognitivo puede tener un impacto significativo y negativo en la calidad de vida. Debido a la mayor visibilidad y ocurrencia de conmociones cerebrales y lesiones cerebrales traumáticas en toda la población, es importante comprender cómo causan deterioro cognitivo y cómo se puede minimizar o revertir el daño. Por estas razones, los organismos modelo que pueden ser probados para el deterioro cognitivo juegan un papel crítico en estos estudios. Los roedores han sido durante mucho tiempo el modelo principal para investigar el neuromeducto y la cognición, sin embargo, el pez cebra ha surgido como un modelo útil con numerosos comportamientos distintos para investigar una gama de déficits cognitivos del desarrollo, relacionados con la edad y adquiridos17,20,23,24,25,26. Se han utilizado varios métodos para evaluar la cognición, desde el aprendizaje unidimensional en forma de habituación, hasta el aprendizaje complejo y la memoria espacial, el reconocimiento novedoso de objetos y ubicaciones, y la toma de decisiones18,19,20,21,27,28. Sin embargo, estas pruebas cognitivas se limitan a probar la cognición no asociativa o requieren una configuración compleja, inversión financiera en equipos o un compromiso de tiempo extenso antes de que se puedan realizar las pruebas. En contraste, la caja de transporte y los paradigmas de aprendizaje y memoria descritos aquí utilizan un ensayo de aprendizaje asociativo complejo que es rentable, se evalúa rápidamente y es fácilmente empleado por un investigador novato. Lo más importante, de acuerdo con las otras pruebas cognitivas, nuestro ensayo demuestra que los peces no dañados aprenden rápidamente la tarea asociativa y pueden recordar la tarea días después sin entrenamiento intermitente29.
La adaptabilidad del ensayo proporciona vías para investigar varios puntos de tiempo de aprendizaje y memoria como una métrica de la progresión de la enfermedad o intervenciones mecanicistas. Hay dos características principales del ensayo. Primero, el método es simple. El ensayo se establece rápidamente y tiene puntos finales claros y distintos con respecto a los ensayos exitosos y fallidos, lo que lo hace accesible a una variedad de investigadores. Descubrimos que debido a la simplicidad de este ensayo, se necesita muy poca solución de problemas para usar la caja del transbordador con éxito. En segundo lugar, el ensayo es extremadamente rápido en comparación con otros exámenes cognitivos, lo que proporciona flexibilidad o la capacidad de examinar una gran cantidad de peces rápidamente en un solo día. El tiempo para evaluar el aprendizaje es de un mínimo de 19,75 min (Figura 1), con el pez requiriendo 15 minutos para aclimatarse a la caja del transbordador (determinado por la exploración del tanque), seguido de un solo ensayo fallido (estímulo de luz de 15 s, estímulo de aversión de 15 s, 30 s entre ensayos) y 5 ensayos positivos inmediatos y consecutivos (estímulo de luz de <15 s). En la práctica, observamos que los peces no dañados requieren 6-30 ensayos (19,75 min-43,75 min), mientras que en casos extremos (después de un trauma severo de fuerza contundente), los déficits más graves pueden requerir 100 ensayos (113,75 min). Los estudios de memoria también se realizan rápidamente. Siguiendo el esquema del protocolo, el tiempo mínimo necesario para la aclimatación, el entrenamiento y las pruebas iniciales es de 67,5 min (15 min de aclimatación, 25 iteraciones de luz y choque durante 15 s, 30 s de descanso entre ensayos y repetición para pruebas iniciales sin los estímulos adversos). Mientras que volver a probar la memoria inmediata o retardada requiere solo 33,75 minutos (aclimatación de 15 minutos, 25 iteraciones de solo estímulo ligero durante 15 s y 30 s de descanso entre ensayos), independientemente de la lesión, el tratamiento o el déficit cognitivo.
Al evaluar el neuromahavior, varios paradigmas utilizan estímulos positivos o adversos. Los estímulos positivos en forma de comida o interacción social, a menudo utilizados en los laberintos clásicos de T-box, pueden ayudar en una respuesta fuerte de una tarea aprendida. Sin embargo, los ensayos que utilizan la asociación positiva lo hacen a expensas del tiempo. Por el contrario, mientras que el condicionamiento en respuesta a un estímulo adverso proporciona una asociación rápida y una fuerte respuesta conductual, es a expensas del estímulo adverso. Los peces no dañados a menudo aprenden el ensayo de la caja del transbordador rápidamente y, por lo tanto, están sujetos a un número mínimo de choques y, como resultado, parecen no tener eventos adversos. Sin embargo, los peces neurológicamente comprometidos (LCT), con déficits cognitivos graves, requieren un número significativo de ensayos y descargas eléctricas. Se ha observado que estos choques múltiples ocasionalmente resultan en convulsiones tónico-clónicas. Cualquier pez que experimente una convulsión tónico-clónica mientras esté dentro de la caja del transbordador debe ser retirado inmediatamente y sacrificado éticamente. Todos los ensayos para los peces sacrificados, hasta e incluyendo el evento de incautación, deben excluirse en cualquier análisis estadístico. Además, vale la pena señalar que la descarga eléctrica a un sujeto neurológicamente dañado podría imponer diferencias involuntarias entre los peces dañados que son y no son el resultado de la caja del transbordador. Por esa razón, sugerimos que todos los peces sometidos a evaluación de neuromavio no deben usarse para ninguna otra métrica cuantitativa (biomarcador sérico, IHC, etc.). También es importante entender que este método de aprendizaje se basa en un estímulo visual y no es apropiado para daños que puedan comprometer los circuitos visuales, ya que confundirá los resultados.
Nuestros resultados demuestran que después de una LCT de fuerza contundente, el pez cebra exhibe un déficit cognitivo rápido que resulta en un aumento de los ensayos para dominar una tarea asociativa en el ensayo de la caja del transbordador. Déficits inmediatos similares se observan en modelos de roedores de LCT, sin embargo, estos déficits pueden disminuir, a menudo persisten y siguensiendo significativos 30. En contraste, el pez cebra muestra recuperación cognitiva dentro de los 7 días posteriores a la lesión. La capacidad regenerativa del pez cebra adulto está bien documentada9,10,11,12,13,14,15,con nichos neurogénicos conocidos en las zonas ventriculares/subventriculares del telencéfalo31,32. La recuperación cognitiva observada en nuestro ensayo después de una LCT proporciona información sobre los exámenes necesarios para identificar si estos nichos neurogénicos se estimulan y desempeñan un papel en la recuperación tisular y cognitiva.
En conclusión, la caja lanzadera proporciona una evaluación rápida de la cognición con respecto al aprendizaje asociativo y la memoria. El ensayo utiliza equipos mínimos y conventuales y es técnicamente simple. Las aplicaciones futuras podrían utilizarse para evaluar las intervenciones genéticas y farmacológicas a peces neurológicamente insultados con respecto a la neuroprotección, así como otros paradigmas de lesiones o modelos neurodegenerativos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio Hyde por sus discusiones reflexivas y a los técnicos del Centro de Ciencias de la Vida Freimann para el cuidado y la cría del pez cebra. Este trabajo fue apoyado por el Centro de Investigación del Pez Cebra de la Universidad de Notre Dame, el Centro de Células Madre y Medicina Regenerativa de la Universidad de Notre Dame, y subvenciones del Instituto Nacional del Ojo de NIH R01-EY018417 (DRH), el Programa de Becas de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship de Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH), y la Beca Pat Tillman (JTH). Figura 1 realizada con BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
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