Summary
L’apprentissage et la mémoire sont des mesures puissantes dans l’étude des troubles cognitifs développementaux, dépendants de la maladie ou induits par l’environnement. La plupart des évaluations cognitives nécessitent un équipement spécialisé et des engagements de temps importants. Cependant, le test de la boîte navette est un outil d’apprentissage associatif qui utilise une boîte de gel conventionnelle pour une évaluation rapide et fiable de la cognition du poisson-zèbre adulte.
Abstract
Les déficits cognitifs, y compris les troubles de l’apprentissage et de la mémoire, sont un symptôme principal de diverses maladies neurodégénératives liées au développement et à l’âge et des lésions cérébrales traumatiques (TCC). Les poissons-zèbres sont un modèle de neuroscience important en raison de leur transparence au cours du développement et de leurs capacités de régénération robustes après un neurotraumatisme. Bien qu’il existe divers tests cognitifs chez le poisson-zèbre, la plupart des évaluations cognitives qui sont rapides examinent l’apprentissage non associatif. Dans le même temps, les tests d’apprentissage associatif nécessitent souvent plusieurs jours ou semaines. Nous décrivons ici un test d’apprentissage associatif rapide qui utilise un stimulus défavorable (choc électrique) et nécessite un temps de préparation minimal. Le test de la boîte de navette, présenté ici, est simple, idéal pour les enquêteurs novices et nécessite un équipement minimal. Nous démontrons qu’à la suite d’un TCC, ce test de boîte navette évalue de manière reproductible le déficit cognitif et la récupération du poisson zèbre jeune au vieux. De plus, le test est adaptable pour examiner la mémoire immédiate ou retardée. Nous démontrons qu’un seul TCC et des événements répétés de TCC affectent négativement l’apprentissage et la mémoire immédiate, mais pas la mémoire retardée. Nous concluons donc que le test de la boîte navette suit de manière reproductible la progression et la récupération des troubles cognitifs.
Introduction
L’apprentissage et la mémoire sont couramment utilisés comme mesures de la déficience cognitive, qui se produit en raison du vieillissement, d’une maladie neurodégénérative ou d’une blessure. Les lésions cérébrales traumatiques (TCC) sont les lésions les plus courantes qui entraînent des déficits cognitifs. Les traumatismes crités sont de plus en plus préoccupants en raison de leur association avec plusieurs troubles neurodégénératifs, tels que la démence frontotemporale et la maladie de Parkinson1,2. De plus, l’augmentation des agrégations bêta-amyloïdes observée chez certains patients atteints de TCC suggère qu’elle peut également être associée au développement de la maladie d’Alzheimer3,4. Les traumatismes crâniens sont souvent le résultat d’un traumatisme contondant et couvrent une gamme de gravités5, les lésions cérébrales légères (miTBI) étant les plus courantes. Cependant, les miTCI sont souvent non signalés et mal diagnostiqués car ils entraînent des troubles cognitifs mineurs pendant une courte période seulement, et les personnes blessées se rétablissent généralement complètement6. En revanche, les événements répétés de miTBI ont été une préoccupation croissante car ils sont très répandus chez les jeunes et les adultes d’âge moyen, peuvent s’accumuler au fil du temps7,peuvent altérer le développement cognitif et exacerber les maladies neurodégénératives1,2,3,4,5,similaires aux personnes qui subissent un TCC modéré ou sévère8.
Le poisson-zèbre (Danio rerio) est un modèle utile pour explorer une variété de sujets en neurosciences, y compris la capacité de régénérer les neurones perdus ou endommagés dans tout le système nerveux central9,10,11,12,13. La régénération neurale a également été démontrée dans le télencéphale, qui contient l’archipallium dans la région dorsale-interne. Cette région neuroanatomique est analogue à l’hippocampe et est probablement nécessaire pour la cognition chez les poissons et pour la mémoire à court terme chezl’homme14,15,16. En outre, le comportement du poisson-zèbre a été largement caractérisé et catalogué17. L’apprentissage a été étudié à travers diverses techniques, y compris l’accoutumance à la réponse de sursasance18, qui peut représenter une forme rapide d’apprentissage non associatif lorsqu’il est effectué en blocs courts et avec une attention particulière au temps de désintégration rapide19. Des tests plus complexes d’apprentissage associatif, tels que les boîtes en T, les labyrinthes plus et la discrimination visuelle20,21 sont utilisés, mais prennent souvent beaucoup de temps, nécessitent des jours ou des semaines de préparation et reposent sur le haut-fond ou le renforcement positif. Nous décrivons ici un paradigme rapide pour évaluer à la fois l’apprentissage associatif et la mémoire immédiate ou retardée. Ce test de boîte navette utilise un stimulus aversif et un conditionnement de renforcement négatif pour évaluer les déficits cognitifs et la récupération après un TCC contondant. Nous démontrons que le poisson-zèbre adulte témoin non endommagé (8-24 mois) apprend de manière reproductible à éviter la lumière rouge dans les 20 essais (<20 minutes d’évaluation) dans la boîte de la navette, avec un degré élevé de cohérence entre les observateurs. De plus, à l’aide de la boîte de navette, nous démontrons que les capacités d’apprentissage et de mémoire chez les adultes (âgés de 8 à 24 mois) sont cohérentes et sont utiles pour doser la cognition avec des déficiences significatives entre différentes sévérités de TCC ou TCC répétés. En outre, cette méthode pourrait être rapidement utilisée comme mesure pour suivre un large éventail de progressions de la maladie ou l’efficacité des interventions médicamenteuses ayant un impact sur le maintien ou le rétablissement de la cognition chez le poisson-zèbre adulte.
Ici, nous fournissons un aperçu pédagogique d’une évaluation cognitive rapide qui peut examiner à la fois l’apprentissage associatif complexe (section 1) et la mémoire en termes de mémoire immédiate et retardée. Ce paradigme fournit une évaluation de la mémoire à court et à long terme d’une tâche cognitive associative apprise (section 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Les poissons-zèbres ont été élevés et entretenus dans l’installation de poisson-zèbre de Notre Dame du Freimann Life Sciences Center. Les méthodes décrites dans ce manuscrit ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Notre Dame (numéro d’assurance du bien-être animal A3093-01).
1. Paradigme d’apprentissage de la boîte de navette (Figure 1A)
NOTE: Le paradigme d’apprentissage fournit une évaluation rapide de la cognition en ce qui concerne l’apprentissage associatif.
- Préparez la boîte de navette en modifiant une boîte de gel de 30,5 x 19 x 7,5 cm avec un morceau de plexiglas de qualité aquarium de 5 x 19 cm ajouté de chaque côté à un angle de 45 °. Faites une ligne marquant la moitié du réservoir pour évaluer quand les poissons ont traversé le milieu du réservoir (Figure 1B).
- Ajouter 800 mL d’eau système à la boîte de navette. Faites cette eau en dissolvant 60 mg d’Instant Ocean dans 1 L d’eau d’OI désionisée. Remplissez l’eau au milieu du réservoir jusqu’à une profondeur de 5 cm.
REMARQUE: Remplacer par de l’eau douce du système à 28 °C toutes les h ou après avoir testé 3 poissons. - Placez 2-3 poissons dans un réservoir de rétention contenant de l’eau du système, situé dans une pièce sombre où le test de la boîte de navette sera effectué.
- Dans la pièce sombre, placez 1 poisson au centre de la boîte de navette, fixez le couvercle et fixez les électrodes à une alimentation.
REMARQUE: La pièce doit rester aussi sombre que possible pendant l’acclimatation et les tests.
- Dans la pièce sombre, placez 1 poisson au centre de la boîte de navette, fixez le couvercle et fixez les électrodes à une alimentation.
- Acclimatez le poisson dans la boîte de navette pendant 15 min.
REMARQUE : L’enquêteur doit rester dans la pièce pendant la période d’acclimatation ou retourner tranquillement à la salle d’essai avec suffisamment de temps avant l’essai pour permettre aux poissons de s’adapter à la présence de l’enquêteur. Une acclimatation réussie peut être envisagée lorsque le poisson explore librement l’aquarium.- Si le poisson ne parvient pas à explorer, continuez l’acclimatation pendant 15 minutes supplémentaires. Si le poisson ne parvient toujours pas à s’acclimater à la boîte de navette, retirez-le. N’utilisez pas ce poisson pour les tests.
- Faites briller manuellement une lampe de poche à lentille rouge de 800 lumens à environ 2 cm du mur de la boîte en gel sur le côté occupé par le poisson, après acclimatation.
REMARQUE: Ne commencez pas un essai si le poisson repose à côté du fil de platine contre le mur près des extrémités profondes de la boîte de navette. - Faites briller le stimulus lumineux directement sur le poisson et suivez manuellement tout mouvement latéral du poisson avec la lumière pour assurer une visualisation continue du stimulus (Figure 1C). Continuez à fournir le stimulus lumineux jusqu’à ce que l’une ou l’autre des conditions suivantes soit remplie.
- Considérez le sentier comme réussi si le poisson traverse la moitié du réservoir dans les 15 s d’exposition à la lumière. Une fois que le poisson a franchi la moitié du chemin, arrêtez immédiatement le stimulus lumineux(Figure 1D).
- Considérez le sentier comme raté si le poisson ne traverse pas la moitié de la boîte en 15 s. Dans ce cas, utilisez une alimentation par électrophorèse pour appliquer un stimulus de choc négatif (20 mV:1 A) alternant 2 s de On, 2 s de Off pendant une période de 15 s (maximum de 4 chocs), ou jusqu’à ce que le poisson passe la moitié de la boîte, à quel point se terminent à la fois le stimulus léger et négatif.
- Laissez le poisson reposer pendant 30 s et répétez la ou les étapes 1.5-1.6.2. Conservez un registre détaillé de l’ordre des essais réussis (1.6.1) et des essais échoués (1.6.2).
REMARQUE: Ici, nous avons défini l’apprentissage comme la réalisation de 5 essais réussis consécutifs. Une fois l’apprentissage démontré, le poisson doit être retiré de la boîte de la navette et euthanasié sans gestion.
2. Paradigme de la mémoire (Figure 1A)
NOTE: Ce paradigme fournit une évaluation de la mémoire à court et à long terme d’une tâche cognitive associative apprise.
- Période de formation
- Ajouter 800 mL d’eau système à la boîte de navette. Faites cette eau en dissolvant 60 mg d’Instant Ocean dans 1 L d’eau d’OI désionisée. Remplissez l’eau au milieu du réservoir jusqu’à une profondeur de 5 cm.
REMARQUE: L’eau doit être remplacée par de l’eau douce du système à 28 ° C toutes les h ou après avoir testé 3 poissons. - Placez 2-3 poissons dans un réservoir de rétention qui contient de l’eau du système, situé dans une pièce sombre où le test de la boîte de navette sera effectué.
- Dans la pièce sombre, placez 1 poisson au centre de la boîte de navette, fixez le couvercle et fixez les électrodes à une alimentation.
REMARQUE: La pièce doit rester aussi sombre que possible pendant l’acclimatation et les tests. - Acclimater les poissons dans la boîte de navette pendant 15 min.
REMARQUE : L’investigateur doit rester dans la pièce pendant la période d’acclimatation ou retourner tranquillement à la salle d’essai avec suffisamment de temps avant les tests pour permettre aux poissons de s’adapter à la présence de l’investigateur. Déterminez une acclimatation réussie lorsque le poisson explore librement l’aquarium. - Si le poisson ne parvient pas à explorer, continuez l’acclimatation pendant 15 minutes supplémentaires. Si le poisson ne parvient toujours pas à s’acclimater à la boîte de navette, retirez-le et ne l’utilisez pas pour les tests.
- Après l’acclimatation réussie, faites briller manuellement une lampe de poche à lentille rouge de 800 lumens à environ 2 cm de la paroi latérale de la boîte de gel, sur le côté de la boîte de navette occupée par le poisson.
- Faites briller le stimulus lumineux directement sur le poisson et suivez tout mouvement latéral du poisson avec la lumière pour assurer une visualisation continue du stimulus par le poisson.
- Pendant que la lumière brille sur le poisson, appliquez simultanément le stimulus de choc défavorable (20 mV: 1 A) en alternant 2 s On, 2 s Off pendant 15 s (maximum de 4 chocs), ou jusqu’à ce que le poisson passe la moitié de la boîte. Une fois que cela est réalisé, mettez fin à la fois à la lumière et au stimulus défavorable.
REMARQUE: Laissez le poisson reposer pendant 30 s, puis répétez l’étape 2.1.6-2.1.8 pendant 25 itérations (Figure 1A).
- Ajouter 800 mL d’eau système à la boîte de navette. Faites cette eau en dissolvant 60 mg d’Instant Ocean dans 1 L d’eau d’OI désionisée. Remplissez l’eau au milieu du réservoir jusqu’à une profondeur de 5 cm.
- Tests initiaux
- Laissez 15 min de repos aux poissons après la période d’entraînement. Ne les retirez pas de la boîte de navette. Testez la rétention initiale de la mémoire en enregistrant chaque essai comme strictement réussi/échoué, immédiatement après cette période de repos.
- Appliquez uniquement le stimulus lumineux jusqu’à 15 s et enregistrez les réponses comme suit.
- Considérez l’essai comme réussi si le poisson traverse la moitié de la boîte de navette dans les 15 secondes suivant le début du stimulus léger. Arrêtez le stimulus lumineux immédiatement lorsque le poisson traverse la moitié du chemin.
- Considérez l’essai comme un échec si le poisson ne traverse pas la moitié de la boîte de navette 15 s après avoir commencé le stimulus lumineux. Arrêtez le stimulus lumineux après 15 s.
REMARQUE: Lors du test initial, un stimulus indésirable n’est pas appliqué après une tentative infructueuse.
- Répétez l’étape 2.2.2, avec une période de repos de 30 s entre les essais, et enregistrez les essais réussis (2.2.2.1) et les essais échoués (2.2.2.2) dans 25 essais. Cette valeur servira de référence individuelle pour chaque poisson.
- Mémoire immédiate
- Induire une blessure immédiatement après la période d’essai initiale par le paradigme de dommage préféré (p. ex., un traumatisme contondant à l’aide de la perte de poids de Marmarou modifiée). Abritez les poissons individuellement pour une identification facile. Consigner leurs valeurs d’essai initiales et renvoyer les poissons à l’animalisation.
REMARQUE: Les poissons ont été blessés par un TCC contondant comme décrit précédemment22. - Recueillir 2 à 3 poissons non endommagés ou atteints d’un TCC 4 h après les tests initiaux et/ou 4 h après la blessure (ou à la période expérimentale en question) à partir de l’animalière. Gardez tous les poissons dans la pièce sombre dans des réservoirs individuels contenant de l’eau du système.
- Placez les poissons au centre de la boîte de navette (préparée avec de l’eau du système comme décrit au point 1.1), un poisson à la fois, et fixez le couvercle. Fixez l’alimentation électrique et laissez le poisson s’acclimater pendant 15 min.
- Après l’acclimatation, évaluez la mémoire immédiate (strictement réussite / échec) en appliquant uniquement le stimulus lumineux jusqu’à 15 s et enregistrez les réponses comme suit.
- Considérez l’essai comme réussi si le poisson traverse la moitié de la boîte au cours de la période d’essai de 15 s. Terminez le stimulus lumineux en traversant le point à mi-chemin.
- Considérez l’essai comme un échec si le poisson ne traverse pas la moitié de la boîte dans les 15 secondes suivant le début du stimulus lumineux. Terminez le stimulus lumineux après la fin de la période de 15 s.
REMARQUE: Au cours de ce test post-blessure, un stimulus de choc défavorable n’est pas appliqué après une tentative infructueuse.
- Répétez l’étape 2.3.4, avec une période de repos de 30 s entre les essais, et notez le nombre d’essais réussis (2.3.4.1) et d’essais échoués (2.3.4.2) dans 25 essais.
- Calculez la différence en pourcentage entre les essais réussis après la blessure et la période d’essai initiale à l’aide de l’équation suivante :
- Induire une blessure immédiatement après la période d’essai initiale par le paradigme de dommage préféré (p. ex., un traumatisme contondant à l’aide de la perte de poids de Marmarou modifiée). Abritez les poissons individuellement pour une identification facile. Consigner leurs valeurs d’essai initiales et renvoyer les poissons à l’animalisation.
- Mémoire retardée
- Renvoyer les poissons, logés individuellement pour faciliter l’identification et l’enregistrement de leurs valeurs d’essai initiales, à l’animalier immédiatement après la période d’essai initiale.
- Prévoyez aux poissons 4 jours (ou le délai expérimental en question) entre le test initial et les tests de blessure et / ou de mémoire retardée.
- Induire une blessure par le paradigme de dommage préféré (comme la chute de poids de Marmarou modifiée pour induire un traumatisme contondant). Abritez les poissons individuellement pour faciliter l’identification des valeurs d’essai initiales et retournez les poissons à l’animalière.
REMARQUE: Les poissons ont été blessés par un TCC contondant comme décrit précédemment22. - Recueillir 2 à 3 poissons non endommagés ou atteints d’un TCC 4 h après les tests initiaux et/ou 4 h après la blessure (ou à la période expérimentale en question) à partir de l’animalière.
- Gardez tous les poissons dans la pièce sombre dans des réservoirs individuels contenant de l’eau du système et placez-en un à la fois au centre de la boîte de navette (préparée avec de l’eau du système comme décrit au point 1.1), fixez le couvercle, fixez l’alimentation électrique et laissez les poissons s’acclimater pendant 15 minutes.
- Après l’acclimatation, évaluez la mémoire immédiate (strictement réussite / échec) en appliquant uniquement le stimulus lumineux jusqu’à 15 s et enregistrez les réponses suivantes:
- Considérez le sentier comme réussi si le poisson traverse la moitié de la boîte au cours de la période d’essai de 15 s. Terminez le stimulus lumineux en traversant le point à mi-chemin.
- Considérez le sentier comme ayant échoué si le poisson ne traverse pas la moitié de la boîte dans les 15 s suivant le début du stimulus lumineux, mettez fin au stimulus lumineux.
REMARQUE: Au cours de ce test post-blessure, un stimulus de choc défavorable n’est pas appliqué après une tentative infructueuse.
- Répétez l’étape 2.4.6, avec une période de repos de 30 s entre les essais, et notez le nombre d’essais réussis (2.4.6.1) et d’essais échoués (2.4.6.2) dans 25 essais.
- Calculez la différence en pourcentage entre les essais réussis après la blessure et la période d’essai initiale avec l’équation :
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Le paradigme d’apprentissage, décrit dans le protocole et le schéma(Figure 1),fournit une évaluation rapide de la cognition par rapport à l’apprentissage associatif. De plus, ce paradigme a un haut niveau de rigueur, en définissant l’apprentissage comme un affichage répété et cohérent de 5 essais positifs consécutifs. Ce paradigme est également applicable à une gamme d’âges et de blessures. Les poissons non endommagés à 8 mois (jeune adulte), 18 mois (adulte d’âge moyen) et 24 mois (adulte âgé) ont nécessité un nombre similaire d’essais pour apprendre le comportement d’éviter la lumière rouge (Non endommagé 8 m: 15,28 ± 4,92 essais, 18 m: 17,66 ± 5,5 essais, 24 m: 16,2 ± 4,79 essais, 8 m vs 18 m p = 0,92, 8 m vs 24 m p = 0,98, 18 m vs 24 m p=0,97, Figure 2A). Nous avons également utilisé un modèle22 de lésion cérébrale traumatique contondante sévère (ITCs) et observé que les poissons à différents âges nécessitaient un nombre similaire d’essais pour maîtriser le test pendant 1 à 5 jours après la blessure (dpi; 8 m vs 18 m, p = 0,09, 8 m vs 24 m, p = 0,96, 18 m vs 24 m, p = 0,12, Figure 2A). Au jour 1 suivant le TCC, les poissons de tous âges (8, 18 et 24 m) ont nécessité un nombre similaire d’essais pour apprendre le comportement (8 m : 73,3 ± 9,45 essais, 18 m : 79,33 ± 6,35 essais, 24 m : 68,25 ± 6,65 essais, 8 m vs 18 m p = 0,71, 8 m vs 24 m p = 0,76, 18 m vs 24 m p = 0,28, Figure 2A) et ils étaient tous significativement plus importants que les témoins non endommagés (p<0.01). Collectivement, ces données démontrent que la boîte navette peut être utilisée pour examiner les déficits cognitifs induits par les blessures dans toutes les tranches d’âge et suggèrent que le poisson-zèbre adulte peut récupérer cognitivement après une blessure contondante.
Étant donné que les événements répétés d’ITI mi peuvent altérer de plus en plus la fonction cognitive, nous avons utilisé le test de la boîte navette comme mesure pour suivre la progression dose-dépendante à l’aide d’un TCC répétitif. Nous avons utilisé ce test pour évaluer l’apprentissage à la suite d’une blessure contondante miTBI22 qui est répétée quotidiennement pendant les différentes durées. Comme observé précédemment, les poissons non endommagés ont rapidement maîtrisé la boîte de navette en réalisant 5 essais positifs consécutifs dans 16,4 ± 3,5 essais(Figure 2B). Un jour après un seul miTBI, les poissons affichent une augmentation significative du nombre d’essais pour apprendre le comportement (40,25 ± 12,65 essais, p<0,05, Figure 2B). Ce déficit a augmenté après 2 événements de miTBI (48 ± 14,9 essais) et a été encore plus élevé après 3 blessures de miTBI (56,63 ± 12,75 essais, Figure 2B). De plus, nous avons observé une augmentation significative des troubles cognitifs entre les poissons miTBI qui ont subi une blessure singulière et 3 blessures (p<0,05).
Nous avons également examiné comment la mémoire était affectée à la suite d’événements miTBI répétés en utilisant le protocole pour les paradigmes de mémoire immédiate et retardée (Figure 1A). Les poissons naïfs non endommagés ont reçu une période d’entraînement et une période d’essai initiale, après quoi une partie des poissons ont été blessés pour la mémoire immédiate et d’autres ont été renvoyés à l’installation de pêche pendant 4 jours pour accéder à la mémoire retardée (Figure 2C). Les poissons non endommagés présentent une légère augmentation de la différence en pourcentage des essais réussis à la fois dans la mémoire immédiate (6,22% ± 4,7%) et la mémoire retardée (6,13% ± 5,57%) par rapport à la période de test initiale. Nous avons ensuite examiné l’effet de plusieurs événements de TCC à force contondante sur la mémoire. Des déficits significatifs ont été observés après un miTBI dans la mémoire immédiate, mais pas dans la mémoire retardée. Après un seul miTBI, les poissons présentaient des déficits de mémoire immédiats significatifs (-26,77 % ± 8,93 %) par rapport aux poissons non endommagés (p<0,0001, Figure 2C). Cette tendance s’est poursuivie avec des blessures répétées avec des déficits croissants à la suite de 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) et 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%). De plus, nous avons observé un effet de dose similaire entre les poissons traités avec un seul (1x) miTBI et 3x miTBI (p<0,05, Figure 2C). Ces données suggèrent que l’apprentissage et la mémoire sont réduits chez les poissons miTBI avec le nombre croissant de blessures, ce qui augmente considérablement le déficit et que le test de la boîte de navette et les protocoles décrits ci-dessus sont suffisamment sensibles pour détecter ces différences.
Figure 1: Essai de la boîte de navette. ( A )Aperçupédagogique des paradigmes d’apprentissage et de mémoire pour l’évaluation cognitive. (B) Schéma d’une grande boîte de gel d’ADN convertie pour le test de la boîte navette. (C,D) Représentation graphique de l’application des stimuli pendant les essais. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Le poisson-zèbre présente des déficits cognitifs à la suite d’un TCC contondant. (A) Après un TCC, le poisson-zèbre à l’âge de 8, 18 et 24 mois présente des déficits d’apprentissage qui ne sont pas significativement différents d’un groupe d’âge à l’autre. Des augmentations significatives du nombre d’essais visant à apprendre le paradigme de la boîte navette par rapport aux témoins appariés selon l’âge ont été observées à 1 dpi pour revenir à des niveaux non endommagés de 4 à 5 dpi. (B,C) Les poissons miTBI répétés présentaient à la fois des déficits d’apprentissage (B) et de mémoire (C) d’une manière dose-dépendante. La moyenne ± SEM est tracée en A et B,tandis que la moyenne ± écart-type est tracée en C. Chaque point de données sur les trois graphiques représente un seul poisson-zèbre adulte. Les analyses statistiques ont été effectuées avec une ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle suivie d’un test post-hoc Tukey. # p<0.05, ## p<0.01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les troubles cognitifs peuvent avoir un impact significatif et négatif sur la qualité de vie. En raison de la visibilité accrue et de l’occurrence des commotions cérébrales et des lésions cérébrales traumatiques dans l’ensemble de la population, il est important de comprendre comment elles causent des troubles cognitifs et comment les dommages peuvent être minimisés ou inversés. Pour ces raisons, les organismes modèles qui peuvent être testés pour le déclin cognitif jouent un rôle essentiel dans ces études. Les rongeurs ont longtemps été le principal modèle pour étudier le neuroportement et la cognition, cependant, le poisson-zèbre est apparu comme un modèle utile avec de nombreux comportements distincts pour étudier une gamme de déficits cognitifs développementaux, liés à l’âge et acquis17,20,23,24,25,26. Diverses méthodes d’évaluation de la cognition ont été utilisées, de l’apprentissage unidimensionnel sous forme d’accoutumante à l’apprentissage complexe et à la mémoire spatiale, en passant par la reconnaissance de nouveaux objets et lieux, et la prise de décision18,19,20,21,27,28. Cependant, ces tests cognitifs se limitent à tester la cognition non associative ou nécessitent une configuration complexe, un investissement financier dans l’équipement ou un engagement de temps important avant que les tests puissent être effectués. En revanche, la boîte de navette et les paradigmes d’apprentissage et de mémoire décrits ici utilisent un test d’apprentissage associatif complexe qui est rentable, rapidement évalué et facilement utilisé par un chercheur novice. Plus important encore, conformément aux autres tests cognitifs, notre test démontre que les poissons non endommagés apprennent rapidement la tâche associative et peuvent se souvenir de la tâche quelques jours plus tard sans entraînement intermittent29.
L’adaptabilité du test offre des moyens d’étudier divers points temporels de l’apprentissage et de la mémoire en tant que mesure de la progression de la maladie ou des interventions mécanistes. Il y a deux caractéristiques principales de l’essai. Tout d’abord, la méthode est simple. Le test est rapidement mis en place et a des points finaux clairs et distincts en ce qui concerne les essais réussis et échoués, ce qui le rend accessible à un éventail d’investigateurs. Nous avons constaté qu’en raison de la simplicité de ce test, il y a très peu de dépannage nécessaire pour utiliser la boîte de navette avec succès. Deuxièmement, le test est extrêmement rapide par rapport à d’autres examens cognitifs, ce qui offre une flexibilité ou la capacité d’examiner rapidement un grand nombre de poissons en une seule journée. Le temps nécessaire pour évaluer l’apprentissage est d’au moins 19,75 min(Figure 1),le poisson nécessitant 15 minutes pour s’acclimater à la boîte de navette (déterminée par l’exploration du réservoir), suivi d’un seul essai raté (stimulus léger de 15 s, stimulus d’aversion de 15 s, 30 s entre les essais) et de 5 essais positifs immédiats et consécutifs (stimulus de lumière de <15 s). Dans la pratique, nous avons observé que les poissons non endommagés nécessitent 6 à 30 essais (19,75 min à 43,75 min), tandis que dans les cas extrêmes (à la suite d’un traumatisme contondant grave), les déficits les plus graves peuvent nécessiter 100 essais (113,75 min). Des études de la mémoire sont également effectuées rapidement. Selon les grandes lignes du protocole, le temps minimum nécessaire pour l’acclimatation, l’entraînement et les tests initiaux est de 67,5 minutes (15 minutes d’acclimatation, 25 itérations de lumière et de choc pendant 15 s, 30 s de repos entre les essais et répéter pour les tests initiaux sans les stimuli indésirables). Bien que le nouveau test de la mémoire immédiate ou retardée ne nécessite que 33,75 minutes (15 minutes d’acclimatation, 25 itérations de stimulus lumineux uniquement pendant 15 s et 30 s de repos entre les essais), indépendamment de la blessure, du traitement ou du déficit cognitif.
Lors de l’évaluation du comportement neurologique, divers paradigmes utilisent des stimuli positifs ou indésirables. Les stimuli positifs sous forme de nourriture ou d’interaction sociale, souvent utilisés dans les labyrinthes classiques de boîtes en T, peuvent aider à une forte réponse d’une tâche apprise. Cependant, les tests utilisant une association positive le font au détriment du temps. En revanche, bien que le conditionnement en réponse à un stimulus défavorable fournisse une association rapide et une réponse comportementale forte, il se fait au détriment du stimulus adverse. Les poissons non endommagés apprennent souvent rapidement le test de la boîte de navette et sont donc soumis à un nombre minimal de chocs et, par conséquent, ne semblent pas avoir d’événements indésirables. Cependant, les poissons neurologiquement compromis (TCC), avec de graves déficits cognitifs, nécessitent un nombre important d’essais et de chocs électriques. On a observé que ces chocs multiples entraînent occasionnellement des crises tonico-cloniques. Tout poisson subissant une crise tonico-clonique alors qu’il se trouve dans la boîte de navette doit être immédiatement retiré et euthanasié de manière éthique. Tous les essais pour le poisson euthanasié, jusqu’à l’événement de saisie inclus, doivent être exclus de toute analyse statistique. En outre, il convient de noter qu’un choc électrique sur un sujet neurologiquement endommagé pourrait imposer des différences involontaires entre les poissons endommagés qui résultent et ne résultent pas de la boîte de navette. Pour cette raison, nous suggérons que tous les poissons soumis à une évaluation du neuroportement ne devraient pas être utilisés pour toute autre mesure quantitative (biomarqueur sérique, IHC, etc.). Il est également important de comprendre que cette méthode d’apprentissage est basée sur un stimulus visuel et n’est pas appropriée pour les dommages qui peuvent compromettre les circuits visuels, car elle confondra les résultats.
Nos résultats démontrent qu’à la suite d’un TCC contondant, le poisson-zèbre présente un déficit cognitif rapide qui se traduit par une augmentation des essais pour maîtriser une tâche associative dans le test de la boîte navette. Des déficits immédiats similaires sont observés dans les modèles rongeurs de TCC, mais ces déficits peuvent diminuer, ils persistent souvent et restent importants30. En revanche, le poisson-zèbre présente une récupération cognitive dans les 7 jours suivant la blessure. La capacité de régénération du poisson-zèbre adulte est bien documentée9,10,11,12,13,14,15, avec des niches neurogènes connues dans les zones ventriculaires / subventriculaires du télencéphale31,32. La récupération cognitive observée dans notre test après un TCC donne un aperçu des examens nécessaires pour déterminer si ces niches neurogènes sont stimulées et jouent un rôle dans la récupération tissulaire et cognitive.
En conclusion, la boîte navette fournit une évaluation rapide de la cognition en ce qui concerne l’apprentissage associatif et la mémoire. Le test utilise un équipement minimal et conventuel et est techniquement simple. Des applications futures pourraient être utilisées pour évaluer les interventions génétiques et pharmacologiques sur les poissons neurologiquement insultés en ce qui concerne la neuroprotection ainsi que d’autres paradigmes de blessures ou modèles neurodégénératifs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire Hyde pour leurs discussions réfléchies et les techniciens du Freimann Life Sciences Center pour les soins et l’élevage du poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par le Center for Zebrafish Research de l’Université de Notre Dame, le Center for Stem Cells and Regenerative Medicine de l’Université de Notre Dame, et des subventions du National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), du National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), du LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) et Pat Tillman Scholarship (JTH). Figure 1 réalisée avec BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
- Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
- Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
- Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
- Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
- Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L.
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
- GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
- López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
- Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
- Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
- Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
- Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
- Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V.
- Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
- Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
- Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
- Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
