Summary
Leren en geheugen zijn krachtige maatstaven bij het bestuderen van ontwikkelings-, ziekteafhankelijke of door het milieu veroorzaakte cognitieve stoornissen. De meeste cognitieve beoordelingen vereisen gespecialiseerde apparatuur en uitgebreide tijdsbestedingen. De shuttle box assay is echter een associatief leermiddel dat een conventionele gelbox gebruikt voor een snelle en betrouwbare beoordeling van de cognitie van volwassen zebravissen.
Abstract
Cognitieve tekorten, waaronder verminderd leren en geheugen, zijn een primair symptoom van verschillende ontwikkelings- en leeftijdsgebonden neurodegeneratieve ziekten en traumatisch hersenletsel (TBI). Zebravissen zijn een belangrijk neurowetenschappelijk model vanwege hun transparantie tijdens de ontwikkeling en robuuste regeneratieve mogelijkheden na neurotrauma. Hoewel er verschillende cognitieve tests bestaan bij zebravissen, onderzoeken de meeste cognitieve beoordelingen die snel zijn niet-associatief leren. Tegelijkertijd vereisen associatieve leertests vaak meerdere dagen of weken. Hier beschrijven we een snelle associatieve leertest die gebruik maakt van een ongunstige stimulus (elektrische schok) en minimale voorbereidingstijd vereist. De shuttle box-test, hier gepresenteerd, is eenvoudig, ideaal voor beginnende onderzoekers en vereist minimale apparatuur. We tonen aan dat, na TBI, deze shuttle box test reproduceerbaar cognitieve tekorten en herstel van jonge tot oude zebravissen beoordeelt. Bovendien is de test aanpasbaar om onmiddellijk of vertraagd geheugen te onderzoeken. We tonen aan dat zowel een enkele TBI als herhaalde TBI-gebeurtenissen een negatieve invloed hebben op het leren en het onmiddellijke geheugen, maar niet op vertraagd geheugen. We concluderen daarom dat de shuttle box assay reproduceerbaar de progressie en het herstel van cognitieve stoornissen volgt.
Introduction
Leren en geheugen worden routinematig gebruikt als metrieken van cognitieve stoornissen, die optreedt als gevolg van veroudering, neurodegeneratieve ziekte of letsel. Traumatisch hersenletsel (TBI's) is het meest voorkomende letsel dat resulteert in cognitieve tekorten. TBI's zijn van groeiende zorg vanwege hun associatie met verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zoals frontotemporale dementie en de ziekte van Parkinson1,2. Bovendien suggereren de verhoogde bèta-amyloïde aggregaties waargenomen bij sommige TBI-patiënten dat het ook geassocieerd kan zijn met de ontwikkeling van de ziekte van Alzheimer3,4. TBI's zijn vaak het resultaat van stomp krachttrauma en omvatten een reeks ernst5, waarbij mild hersenletsel (miTBI) de meest voorkomende is. MiTBIs worden echter vaak niet gerapporteerd en verkeerd gediagnosticeerd omdat ze slechts voor een korte periode resulteren in kleine cognitieve stoornissen en de gewonde personen meestal volledig herstellen6. Daarentegen zijn herhaalde miTBI-gebeurtenissen een groeiende zorg omdat het veel voorkomt bij jonge en middelbare volwassenen, zich in de loop van de tijd kan ophopen7, de cognitieve ontwikkeling kan schaden en neurodegeneratieve ziekten kanverergeren1,2,3,4,5,vergelijkbaar met personen die een matige of ernstige TBI ervaren8.
Zebravis (Danio rerio) is een nuttig model voor het verkennen van een verscheidenheid aan onderwerpen in de neurowetenschappen, waaronder het vermogen om verloren of beschadigde neuronen in het centrale zenuwstelsel te regenereren9,10,11,12,13. Neurale regeneratie werd ook aangetoond in het telencephalon, dat het archipallium in het dorsaal-binnenste gebied bevat. Dit neuroanatomische gebied is analoog aan de hippocampus en is waarschijnlijk nodig voor cognitie bij vissen en voor het korte-tijd geheugen bij mensen14,15,16. Verder is het gedrag van zebravissen uitgebreid gekarakteriseerd en gecatalogiseerd17. Leren is bestudeerd door middel van verschillende technieken, waaronder gewenning aan de schrikreactie18, die een snelle vorm van niet-associatief leren kan vertegenwoordigen wanneer het wordt uitgevoerd in korte blokken en met aandacht voor de snelle vervaltijd19. Meer complexe tests van associatief leren, zoals T-boxen, plus-doolhoven en visuele discriminatie20,21 worden gebruikt, maar zijn vaak tijdrovend, vereisen dagen of weken voorbereiding en vertrouwen op scholen of positieve bekrachtiging. Hier beschrijven we een snel paradigma om zowel associatief leren als onmiddellijk of vertraagd geheugen te beoordelen. Deze shuttle box assay maakt gebruik van een aversieve stimulus en negatieve versterking conditionering om cognitieve tekorten en herstel na stompe kracht TBI te beoordelen. We tonen aan dat onbeschadigde controle volwassen zebravissen (8-24 maanden) reproduceerbaar leren om het rode licht te vermijden binnen 20 proeven (<20 minuten beoordeling) in de shuttlebox, met een hoge mate van consistentie tussen waarnemers. Bovendien tonen we met behulp van de shuttlebox aan dat leer- en geheugenvaardigheden bij volwassenen (8-24 maanden oud) consistent zijn en nuttig zijn voor het testen van cognitie met significante stoornissen tussen verschillende TBI-ernst of herhaalde TBI. Bovendien kan deze methode snel worden gebruikt als een metriek om een breed scala aan ziekteprogressies of werkzaamheid van medicamenteuze interventies te volgen die van invloed zijn op het behoud of herstel van cognitie bij volwassen zebravissen.
Hier geven we een instructief overzicht van een snelle cognitieve beoordeling die zowel complex associatief leren (sectie 1) als geheugen kan onderzoeken in termen van zowel onmiddellijk als vertraagd geheugen. Dit paradigma biedt een beoordeling van het korte- en langetermijngeheugen van een aangeleerde associatieve cognitieve taak (sectie 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebravissen werden grootgebracht en onderhouden in de Notre Dame Zebrafish-faciliteit in het Freimann Life Sciences Center. De methoden beschreven in dit manuscript zijn goedgekeurd door de University of Notre Dame Animal Care and Use Committee (Animal Welfare Assurance Number A3093-01).
1. Shuttle box leerparadigma (Figuur 1A)
OPMERKING: Het leerparadigma biedt een snelle beoordeling van cognitie met betrekking tot associatief leren.
- Bereid de shuttlebox voor door een gelbox van 30,5 x 19 x 7,5 cm aan te passen met een stuk plexiglas van 5 x 19 cm van aquariumkwaliteit dat aan elke kant is toegevoegd in een hoek van 45 °. Maak een lijn die het halverwege punt van de tank markeert om te beoordelen wanneer vissen het midden van de tank zijn overgestoken(figuur 1B).
- Voeg 800 ml systeemwater toe aan de shuttlebox. Maak dit water door 60 mg Instant Ocean op te lossen in 1 L gedeioniseerd RO-water. Vul het water in het midden van de tank tot een diepte van 5 cm.
OPMERKING: Vervang door vers systeemwater bij 28 °C elke h of na het testen van 3 vissen. - Plaats 2-3 vissen in een vuilwatertank met systeemwater, gelegen in een donkere kamer waar de shuttlebox-test zal worden uitgevoerd.
- Plaats in de donkere kamer 1 vis in het midden van de shuttlebox, bevestig het deksel en bevestig de elektroden aan een voeding.
OPMERKING: De kamer moet zo donker mogelijk blijven tijdens het acclimatiseren en testen.
- Plaats in de donkere kamer 1 vis in het midden van de shuttlebox, bevestig het deksel en bevestig de elektroden aan een voeding.
- Acclimeer de vis in de shuttle box gedurende 15 min.
OPMERKING: De onderzoeker moet tijdens de acclimatisatieperiode in de kamer blijven of rustig terugkeren naar de testruimte met voldoende tijd voor het testen om vissen in staat te stellen zich aan te passen aan de aanwezigheid van de onderzoeker. Succesvolle acclimatisatie kan worden overwogen wanneer de vis vrijelijk de tank verkent.- Als de vis niet kan verkennen, ga dan nog eens 15 minuten door met acclimatiseren. Als de vis nog steeds niet kan wennen aan de shuttlebox, verwijder dan de vis. Gebruik deze vis niet om te testen.
- Schijn handmatig een 800-lumen rode lens zaklamp ~ 2 cm van de gel box muur aan de kant bezet door de vis, na acclimatisatie.
OPMERKING: Begin geen proef als de vis naast de platinadraad tegen de muur in de buurt van de diepe uiteinden van de shuttlebox rust. - Laat de lichtprikkel rechtstreeks op de vis schijnen en volg handmatig elke zijwaartse beweging van de vis met het licht om een continue visualisatie van de stimulus te garanderen(figuur 1C). Blijf de lichtprikkel geven totdat aan een van de volgende voorwaarden is voldaan.
- Beschouw het pad als succesvol als de vis het halve punt van de tank oversteekt binnen de 15 s van blootstelling aan licht. Zodra de vis halverwege het punt is, stopt u de lichtprikkel onmiddellijk(figuur 1D).
- Beschouw het pad als mislukt als de vis niet in 15 s over het halve punt van de doos gaat. Gebruik in dit geval een elektroforese-voeding om een negatieve schokprikkel (20 mV: 1 A) toe te passen, afwisselend 2 s aan, 2 s uit gedurende een periode van 15 s (maximaal 4 schokken), of totdat de vis het halve punt van de doos passeert, waarna zowel de lichte als de negatieve stimulus eindigt.
- Laat de vis 30 s rusten en herhaal stap(en) 1.5-1.6.2. Houd een gedetailleerd overzicht bij van de volgorde van succesvolle onderzoeken (1.6.1) en mislukte onderzoeken (1.6.2).
OPMERKING: Hier hebben we leren gedefinieerd als de voltooiing van 5 opeenvolgende succesvolle onderzoeken. Zodra het leren is aangetoond, moet de vis uit de shuttlebox worden verwijderd en op humane wijze worden geëuthanaseerd.
2. Geheugenparadigma (Figuur 1A)
OPMERKING: Dit paradigma biedt een beoordeling van het korte- en langetermijngeheugen van een aangeleerde associatieve cognitieve taak.
- Trainingsperiode
- Voeg 800 ml systeemwater toe aan de shuttlebox. Maak dit water door 60 mg Instant Ocean op te lossen in 1 L gedeioniseerd RO-water. Vul het water in het midden van de tank tot een diepte van 5 cm.
OPMERKING: Water moet worden vervangen door vers systeemwater bij 28 °C elke h of na het testen van 3 vissen. - Plaats 2-3 vissen in een vuilwatertank die systeemwater bevat, gelegen in een donkere kamer waar de shuttlebox-test zal worden uitgevoerd.
- Plaats in de donkere kamer 1 vis in het midden van de shuttlebox, bevestig het deksel en bevestig de elektroden aan een voeding.
OPMERKING: De kamer moet zo donker mogelijk blijven tijdens het acclimatiseren en testen. - Acclimeer vis in de shuttle box gedurende 15 min.
OPMERKING: De onderzoeker moet tijdens de acclimatisatieperiode in de kamer blijven of rustig terugkeren naar de testruimte met voldoende tijd voorafgaand aan het testen, zodat vissen zich kunnen aanpassen aan de aanwezigheid van de onderzoeker. Bepaal een succesvolle acclimatisatie wanneer de vis vrijelijk de tank verkent. - Als de vis niet kan verkennen, ga dan nog eens 15 minuten door met acclimatiseren. Als de vis nog steeds niet kan wennen aan de shuttlebox, verwijder dan de vis en gebruik deze niet voor het testen.
- Na de succesvolle acclimatisatie schijnt handmatig een 800-lumen rode lenslantaarn ~ 2 cm van de zijwand van de gelbox, aan de zijkant van de shuttlebox die door de vis wordt bezet.
- Laat de lichtprikkel direct op de vis schijnen en volg elke zijwaartse beweging van de vis met het licht om te zorgen voor een voortdurende visualisatie van de stimulus door de vis.
- Terwijl het licht op de vis schijnt, past u tegelijkertijd de negatieve schokprikkel (20 mV: 1 A) toe, afwisselend 2 s aan, 2 s uit gedurende 15 s (maximaal 4 schokken), of totdat de vis halverwege de doos passeert. Zodra dit is bereikt, beëindigt u zowel het licht als de negatieve stimulus.
OPMERKING: Laat de vis 30 s rusten en herhaal stap 2.1.6-2.1.8 voor 25 iteraties(Figuur 1A).
- Voeg 800 ml systeemwater toe aan de shuttlebox. Maak dit water door 60 mg Instant Ocean op te lossen in 1 L gedeioniseerd RO-water. Vul het water in het midden van de tank tot een diepte van 5 cm.
- Eerste testen
- Laat 15 minuten rust aan de vis na de trainingsperiode. Haal ze niet uit de shuttlebox. Test het initieel geheugenbehoud door elke proef te registreren als strikt geslaagd/mislukt, onmiddellijk na deze rustperiode.
- Pas alleen de lichtprikkel toe gedurende maximaal 15 s en noteer de reacties als volgt.
- Beschouw de proef als geslaagd als de vis binnen 15 s na het starten van de lichtprikkel over het halve punt van de shuttlebox gaat. Stop de lichtprikkel onmiddellijk wanneer de vis halverwege het punt is.
- Beschouw de proef als mislukt als de vis niet 15 s na het starten van de lichtprikkel over het halve punt van de shuttlebox gaat. Stop de lichtprikkel na 15 s.
OPMERKING: Tijdens de eerste test wordt geen negatieve stimulus toegepast na een mislukte poging.
- Herhaal stap 2.2.2, met een rustperiode van 30 s tussen de proeven, en registreer succesvolle onderzoeken (2.2.2.1) en mislukte onderzoeken (2.2.2.2) in 25 onderzoeken. Deze waarde zal dienen als een individuele referentie voor elke vis.
- Onmiddellijke herinnering
- Induceer letsel onmiddellijk na de eerste testperiode door het gewenste schadeparadigma (bijvoorbeeld een stompkrachttrauma met behulp van de gemodificeerde Marmarou-gewichtsdaling). Huisvissen individueel voor een eenvoudige identificatie. Noteer hun initiële testwaarden en breng vissen terug naar de dierenfaciliteit.
OPMERKING: Vissen werden gewond door stompe kracht TBI zoals eerder beschreven22. - Verzamel 2-3 onbeschadigde of TBI-vissen 4 uur na de eerste test en/of 4 uur na het verwonding (of op het experimentele tijdsbestek in kwestie) uit de dierfaciliteit. Bewaar alle vissen in de donkere kamer in individuele tanks met systeemwater.
- Plaats de vis in het midden van de shuttlebox (bereid met systeemwater zoals beschreven in 1.1), één vis tegelijk en zet het deksel vast. Sluit de voeding aan en laat de vis 15 minuten acclimatiseren.
- Beoordeel na de acclimatisatie het onmiddellijke geheugen (strikt geslaagd /mislukt) door alleen de lichtprikkel gedurende maximaal 15 s toe te passen en de reacties als volgt vast te leggen.
- Beschouw de proef als geslaagd als de vis binnen de testperiode van 15 s over het halve punt van de doos gaat. Beëindig de lichtprikkel bij het passeren van het halverwege punt.
- Beschouw de proef als mislukt als de vis niet binnen 15 s na het starten van de lichtprikkel over het halve punt van de doos gaat. Beëindig de lichtprikkel nadat de periode van 15 s voorbij is.
OPMERKING: Tijdens deze post-blessuretest wordt geen negatieve schokprikkel toegepast na een mislukte poging.
- Herhaal stap 2.3.4, met een rustperiode van 30 s tussen de proeven, en noteer het aantal succesvolle onderzoeken (2.3.4.1) en mislukte onderzoeken (2.3.4.2) in 25 onderzoeken.
- Bereken het procentuele verschil in succesvolle onderzoeken na het letsel ten opzichte van de eerste testperiode met behulp van de vergelijking:
- Induceer letsel onmiddellijk na de eerste testperiode door het gewenste schadeparadigma (bijvoorbeeld een stompkrachttrauma met behulp van de gemodificeerde Marmarou-gewichtsdaling). Huisvissen individueel voor een eenvoudige identificatie. Noteer hun initiële testwaarden en breng vissen terug naar de dierenfaciliteit.
- Vertraagd geheugen
- Breng vissen, die individueel zijn gehuisvest voor eenvoudige identificatie en registratie van hun oorspronkelijke testwaarden, onmiddellijk na de eerste testperiode terug naar de dierfaciliteit.
- Geef vissen 4 dagen (of het experimentele tijdsbestek in kwestie) tussen de eerste test en het letsel en/of vertraagde geheugentests.
- Induceer letsel door het gewenste schadeparadigma (zoals de gemodificeerde Marmarou-gewichtsdaling om een stomp krachttrauma te induceren). Huisvissen individueel voor eenvoudige identificatie van de initiële testwaarden en breng vissen terug naar de dierlijke faciliteit.
OPMERKING: Vissen werden gewond door stompe kracht TBI zoals eerder beschreven22. - Verzamel 2-3 onbeschadigde of TBI-vissen 4 uur na de eerste test en/of 4 uur na het verwonding (of op het experimentele tijdsbestek in kwestie) uit de dierfaciliteit.
- Bewaar alle vissen in de donkere kamer in individuele tanks met systeemwater en plaats één voor één in het midden van de shuttlebox (bereid met systeemwater zoals beschreven in 1.1), bevestig het deksel, bevestig de voeding en laat vissen 15 minuten acclimatiseren.
- Beoordeel na acclimatisatie het onmiddellijke geheugen (strikt geslaagd / mislukt) door alleen de lichtprikkel gedurende maximaal 15 s toe te passen en de volgende reacties op te nemen:
- Beschouw het parcours als succesvol als de vis binnen de testperiode van 15 s halverwege de doos oversteekt. Beëindig de lichtprikkel bij het passeren van het halverwege punt.
- Beschouw het spoor als mislukt als de vis niet binnen 15 s na het starten van de lichtprikkel het halve punt van de doos oversteekt, beëindig de lichtprikkel.
OPMERKING: Tijdens deze post-blessuretest wordt geen negatieve schokprikkel toegepast na een mislukte poging.
- Herhaal stap 2.4.6, met een rustperiode van 30 s tussen de proeven, en noteer het aantal succesvolle onderzoeken (2.4.6.1) en mislukte onderzoeken (2.4.6.2) in 25 onderzoeken.
- Bereken het procentuele verschil in succesvolle onderzoeken van post-letsel tot de eerste testperiode met de vergelijking:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het leerparadigma, geschetst in het protocol en schema (Figuur 1), biedt een snelle beoordeling van cognitie met betrekking tot associatief leren. Bovendien heeft dit paradigma een hoge mate van strengheid, door leren te definiëren als een herhaalde en consistente weergave van 5 opeenvolgende positieve onderzoeken. Dit paradigma is ook van toepassing op een reeks leeftijden en verwondingen. Onbeschadigde vissen na 8 maanden (jongvolwassene), 18 maanden (volwassene van middelbare leeftijd) en 24 maanden (oudere volwassene) hadden een vergelijkbaar aantal proeven nodig om het gedrag van het vermijden van rood licht te leren (Onbeschadigd 8 m: 15,28 ± 4,92 proeven, 18 m: 17,66 ± 5,5 proeven, 24 m: 16,2 ± 4,79 proeven, 8 m vs. 18 m p = 0,92, 8 m vs. 24 m p = 0,98, 18 m vs. 24 m p=0,97, figuur 2A). We gebruikten ook een ernstig stomp-kracht traumatisch hersenletsel (sTBI) model22 en merkten op dat vissen op verschillende leeftijden een vergelijkbaar aantal proeven nodig hadden om de test 1-5 dagen na het letsel onder de knie te krijgen (dpi; 8 m vs 18 m, p = 0,09, 8 m versus 24 m, p = 0,96, 18 m versus 24 m, p = 0,12, figuur 2A). Op dag 1 na sTBI hadden vissen van alle leeftijden (8, 18 en 24 m) een vergelijkbaar aantal proeven nodig om het gedrag te leren (8 m: 73,3 ± 9,45 proeven, 18 m: 79,33 ± 6,35 proeven, 24 m: 68,25 ± 6,65 proeven, 8 m vs. 18 m p=0,71, 8 m vs. 24 m p=0,76, 18 m vs. 24 m p=0,28, Figuur 2A) en ze waren allemaal aanzienlijk groter dan de onbeschadigde controles (p<0,01). Gezamenlijk tonen deze gegevens aan dat de shuttlebox kan worden gebruikt om door letsel veroorzaakte cognitieve tekorten in leeftijdsbereiken te onderzoeken en suggereren dat volwassen zebravissen cognitief kunnen herstellen na botte krachtbeschadiging.
Omdat herhaalde miTBI-gebeurtenissen de cognitieve functie in toenemende mate kunnen aantasten, gebruikten we de shuttle box-test als een metriek om dosisafhankelijke progressie te volgen met behulp van repetitieve TBI. We gebruikten deze test om het leren te beoordelen na een miTBI stompe krachtblessure22 die dagelijks wordt herhaald gedurende de verschillende tijdsduur. Zoals eerder waargenomen, beheersten onbeschadigde vissen de shuttle-box snel en bereikten 5 opeenvolgende positieve proeven in 16,4 ± 3,5 proeven(figuur 2B). Een dag na een enkele miTBI vertonen vissen een significante toename van het aantal proeven om het gedrag te leren (40,25 ± 12,65 proeven, p<0,05, figuur 2B). Dit tekort nam toe na 2 miTBI-voorvallen (48 ± 14,9 onderzoeken) en was verder verhoogd na 3 miTBI-letsels (56,63 ± 12,75 onderzoeken, figuur 2B). Daarnaast zagen we een significante toename van cognitieve stoornissen tussen miTBI-vissen die een enkelvoudige verwonding en 3 verwondingen kregen (p<0,05).
We onderzochten ook hoe het geheugen werd beïnvloed na herhaalde miTBI-gebeurtenissen met behulp van het protocol voor onmiddellijke en vertraagde geheugenparadigma's(figuur 1A). Naïeve onbeschadigde vissen kregen een trainingsperiode en een eerste testperiode, waarna een deel van de vissen gewond raakte voor onmiddellijk geheugen en anderen gedurende 4 dagen werden teruggebracht naar de visfaciliteit om toegang te krijgen tot vertraagd geheugen (figuur 2C). Onbeschadigde vissen vertonen een lichte toename van het procentuele verschil in succesvolle proeven in zowel het onmiddellijke geheugen (6,22% ± 4,7%) als het vertraagde geheugen (6,13% ± 5,57%) ten opzichte van de eerste testperiode. Vervolgens onderzochten we het effect van meerdere stompe TBI-gebeurtenissen op het geheugen. Significante tekorten werden waargenomen na miTBI in het onmiddellijke geheugen, maar niet in vertraagd geheugen. Na een enkele miTBI vertoonden vissen significante onmiddellijke geheugentekorten (-26,77% ± 8,93%) in vergelijking met onbeschadigde vissen (p<0,0001, figuur 2C). Deze trend zette zich voort met herhaalde schade met toenemende tekorten na zowel 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) als 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%). Verder zagen we een vergelijkbaar dosiseffect tussen vissen behandeld met een enkele (1x) miTBI en 3x miTBI (p<0,05, figuur 2C). Deze gegevens suggereren dat leren en geheugen verminderd is bij miTBI-vissen met het toenemende aantal verwondingen, waardoor het tekort aanzienlijk toeneemt en de shuttlebox-test en protocollen die hierboven zijn beschreven, gevoelig genoeg zijn om deze verschillen te detecteren.
Figuur 1: De Shuttle Box Assay. (A) Instructief overzicht van de leer- en geheugenparadigma's voor cognitieve beoordeling. (B) Schema van een omgebouwde grote DNA-gelbox voor de shuttle box assay. (C,D) Grafische weergave van stimulitoepassing tijdens proeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Zebravissen vertonen cognitieve tekorten na stompe kracht TBI. (A) Na sTBI vertonen zebravissen op de leeftijd van 8, 18 en 24 maanden leerachterstanden die niet significant verschillen tussen leeftijdsgroepen. Significante toenames in het aantal proeven om het shuttlebox-paradigma te leren in vergelijking met leeftijdsgematchte controles werden waargenomen bij 1 dpi die terugkeerde naar onbeschadigde niveaus met 4-5 dpi. (B, C) Herhaalde miTBI-vissen vertoonden zowel leer-(B)als geheugentekorten(C)op een dosisafhankelijke manier. Het gemiddelde ± SEM wordt uitgezet in A en B,terwijl het gemiddelde ± standaarddeviatie wordt uitgezet in C. Elk gegevenspunt op alle drie de grafieken vertegenwoordigt een enkele volwassen zebravis. Statistische analyses werden uitgevoerd met een One-Way of Two-Way ANOVA gevolgd door een Tukey post-hoc test. # p<0,05, ## p<0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cognitieve stoornissen kunnen de kwaliteit van leven aanzienlijk en negatief beïnvloeden. Vanwege de verhoogde zichtbaarheid en het optreden van hersenschuddingen en traumatisch hersenletsel in de hele bevolking, is het belangrijk om te begrijpen hoe ze cognitieve stoornissen veroorzaken en hoe de schade kan worden geminimaliseerd of omgekeerd. Om deze redenen spelen modelorganismen die kunnen worden getest op cognitieve achteruitgang een cruciale rol in deze studies. Knaagdieren zijn al lang het primaire model om neurogedrag en cognitie te onderzoeken, maar zebravissen zijn naar voren gekomen als een nuttig model met tal van verschillende gedragingen om een reeks ontwikkelings-, leeftijdsgerelateerde en verworven cognitieve tekorten te onderzoeken17,20,23,24,25,26. Verschillende methoden om cognitie te beoordelen zijn gebruikt, van eendimensionaal leren in de vorm van gewenning, tot complex leren en ruimtelijk geheugen, nieuwe object- en locatieherkenning en besluitvorming18,19,20,21,27,28. Deze cognitieve tests zijn echter beperkt tot het testen van niet-associatieve cognitie of vereisen een complexe opstelling, financiële investering in apparatuur of een uitgebreide tijdsbesteding voordat tests kunnen worden uitgevoerd. Daarentegen maken de shuttlebox en de hier beschreven leer- en geheugenparadigma's gebruik van een complexe associatieve leertest die kosteneffectief is, snel wordt beoordeeld en gemakkelijk kan worden gebruikt door een beginnende onderzoeker. Het belangrijkste is dat, in overeenstemming met de andere cognitieve tests, onze test aantoont dat onbeschadigde vissen snel de associatieve taak leren en de taak dagen later kunnen onthouden zonder intermitterende training29.
Het aanpassingsvermogen van de test biedt mogelijkheden om verschillende tijdspunten van leren en geheugen te onderzoeken als een metriek voor ziekteprogressie of mechanistische interventies. Er zijn twee primaire kenmerken van de test. Ten eerste is de methode eenvoudig. De test is snel opgezet en heeft duidelijke en duidelijke eindpunten met betrekking tot succesvolle en mislukte onderzoeken, waardoor het toegankelijk is voor een reeks onderzoekers. We ontdekten dat vanwege de eenvoud van deze test, er zeer weinig probleemoplossing nodig is om de shuttlebox met succes te gebruiken. Ten tweede is de test extreem snel in vergelijking met andere cognitieve examens, die flexibiliteit bieden of de mogelijkheid om een groot aantal vissen snel op één dag te onderzoeken. De tijd om het leren te beoordelen is minimaal 19,75 min(figuur 1),waarbij de vis 15 minuten nodig heeft om te acclimatiseren aan de shuttlebox (bepaald door tankverkenning), gevolgd door een enkele mislukte proef (15 s lichtprikkel, 15 s aversieprikkel, 30 s tussen proeven) en 5 onmiddellijke en opeenvolgende positieve proeven (<15 s lichtprikkel). In de praktijk zagen we dat onbeschadigde vissen 6-30 proeven vereisen (19,75 min-43,75 min), terwijl in extreme gevallen (na een ernstig stompkrachttrauma) de ernstigste tekorten 100 proeven (113,75 min) kunnen vereisen. Geheugenstudies worden ook snel uitgevoerd. Volgens het protocolschema is de minimale tijd die nodig is voor acclimatisatie, training en initiële tests 67,5 minuten (15 minuten acclimatisatie, 25 iteraties van licht en schok gedurende 15 s, 30 s rust tussen proeven en herhaal voor de eerste tests zonder de nadelige stimuli). Terwijl het hertesten van onmiddellijk of vertraagd geheugen slechts 33,75 minuten vereist (15 minuten acclimatisatie, 25 iteraties van alleen lichte stimulus gedurende 15 s en 30 s rust tussen proeven), ongeacht letsel, behandeling of cognitieve achterstand.
Bij het beoordelen van neurogedrag maken verschillende paradigma's gebruik van positieve of negatieve stimuli. Positieve stimuli in de vorm van voedsel of sociale interactie, vaak gebruikt in klassieke T-box doolhoven, kunnen helpen bij een sterke reactie van een aangeleerde taak. Assays die gebruik maken van positieve associatie doen dit echter ten koste van de tijd. Daarentegen, terwijl conditionering als reactie op een ongunstige stimulus een snelle associatie en sterke gedragsrespons biedt, gaat dit ten koste van de negatieve stimulus. Onbeschadigde vissen leren de shuttle box-test vaak snel en worden daarom onderworpen aan een minimaal aantal schokken en lijken daardoor geen bijwerkingen te hebben. Neurologisch gecompromitteerde vissen (TBI), met ernstige cognitieve tekorten, vereisen echter een aanzienlijk aantal proeven en elektrische schokken. Deze meervoudige schokken zijn waargenomen om af en toe te resulteren in tonisch-clonische aanvallen. Elke vis die een tonisch-clonische aanval ervaart terwijl hij zich in de shuttlebox beaconteerde, moet onmiddellijk worden verwijderd en ethisch worden geëuthanaseerd. Alle proeven voor de geëuthanaseerde vis, tot en met de inbeslagname, moeten worden uitgesloten in elke statistische analyse. Bovendien is het vermeldenswaard dat elektrische schokken voor een neurologisch beschadigd onderwerp onbedoelde verschillen kunnen veroorzaken tussen beschadigde vissen die wel en niet het gevolg zijn van de shuttlebox. Om die reden raden we aan dat alle vissen die worden onderworpen aan een beoordeling van het neurogedrag niet mogen worden gebruikt voor een andere kwantitatieve metriek (serumbiomarker, IHC, enz.). Het is ook belangrijk om te begrijpen dat deze leermethode is gebaseerd op een visuele stimulus en niet geschikt is voor schade die visuele circuits in gevaar kan brengen, omdat het de resultaten zal verstoren.
Onze resultaten tonen aan dat zebravissen na blunt-force TBI een snel cognitief tekort vertonen dat resulteert in verhoogde proeven om een associatieve taak in de shuttle box-assay onder de knie te krijgen. Vergelijkbare onmiddellijke tekorten worden gezien in knaagdiermodellen van TBI, maar deze tekorten kunnen verminderen, ze blijven vaak bestaan en blijven significant30. Zebravissen daarentegen vertonen cognitief herstel binnen 7 dagen na letsel. Het regeneratieve vermogen van de volwassen zebravis is goed gedocumenteerd9,10,11,12,13,14,15,met bekende neurogene niches in de ventriculaire / subventriculaire zones van het telencephalon31,32. Het cognitieve herstel dat wordt waargenomen in onze test na TBI biedt inzicht in de benodigde onderzoeken om te bepalen of deze neurogene niches worden gestimuleerd en een rol spelen bij weefsel- en cognitief herstel.
Kortom, de shuttlebox biedt een snelle beoordeling van cognitie met betrekking tot associatief leren en geheugen. De test maakt gebruik van minimale en conventuele apparatuur en is technisch eenvoudig. Toekomstige toepassingen kunnen worden gebruikt om genetische en farmacologische interventies aan neurologisch beledigde vissen te beoordelen met betrekking tot neuroprotectie en andere letselparadigma's of neurodegeneratieve modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen de Hyde-lableden bedanken voor hun doordachte discussies en de technici van het Freimann Life Sciences Center voor zebravisverzorging en -houderij. Dit werk werd ondersteund door het Center for Zebrafish Research aan de Universiteit van Notre Dame, het Centrum voor Stamcellen en Regeneratieve Geneeskunde aan de Universiteit van Notre Dame, en subsidies van het National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) en de Pat Tillman Scholarship (JTH). Figuur 1 gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
- Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
- Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
- Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
- Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
- Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L.
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
- GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
- López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
- Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
- Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
- Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
- Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
- Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V.
- Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
- Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
- Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
- Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
