Summary
학습과 기억은 발달, 질병 의존, 또는 환경 유발 인지 장애를 연구하는 데 강력한 지표입니다. 대부분의 인지 평가에는 특수 장비와 광범위한 시간 약속이 필요합니다. 그러나 셔틀박스 분석체는 기존의 젤박스를 활용하여 성인 제브라피시 인식의 신속하고 신뢰할 수 있는 평가를 제공하는 연관 학습 도구입니다.
Abstract
인지 적자, 장애인 된 학습 및 메모리를 포함 하 여, 다양 한 발달 및 나이 관련 된 신경 퇴행 성 질환및 외상성 뇌 손상의 주요 증상 (TBI). Zebrafish는 개발 중 투명성과 신경 외상에 따른 강력한 재생 기능으로 인해 중요한 신경 과학 모델입니다. 제브라피시에는 다양한 인지 검사가 존재하지만, 급속히 비 연관 학습을 검사하는 인지 평가의 대부분은. 동시에, 연관 학습 소법은 종종 며칠 또는 몇 주가 필요합니다. 여기서는 불리한 자극(감전)을 활용하고 최소한의 준비 시간이 필요한 신속한 연관 학습 테스트를 설명합니다. 여기에 제시 된 셔틀 박스 분석법은 간단하고 초보자 수사관에게 이상적이며 최소한의 장비가 필요합니다. TBI에 이어 이 셔틀 박스 테스트는 인지 적자와 젊은 자발물고기로의 회복을 재현적으로 평가합니다. 또한 분석법은 즉시 또는 지연된 메모리를 검사할 수 있습니다. 단일 TBI와 반복된 TBI 이벤트가 학습 및 즉각적인 메모리에 부정적인 영향을 미치지만 메모리가 지연되지 는 않음을 입증합니다. 따라서 셔틀박스 분석이 인지 장애의 진행과 회복을 재현적으로 추적한다는 결론을 내릴 수 있습니다.
Introduction
학습과 기억은 노화, 신경 퇴행성 질환 또는 부상으로 인해 발생하는 인지 장애의 지표로 일상적으로 사용됩니다. 외상성 뇌 손상 (TBIs) 인지 적자 결과 가장 일반적인 부상. 결핵은 전두엽 치매 및 파킨슨 병1,2와 같은 여러 신경 퇴행성 질환과의 연관성 때문에 우려가 커지고있습니다. 또한, 일부 TBI 환자에서 관찰된 베타 아밀로이드 집계증가는 알츠하이머병3,4의발병과도 연관될 수 있음을 시사한다. 결핵은 종종 무딘 힘 외상의 결과이며, 경미한 뇌 손상 (miTBI)이 가장 일반적인 것으로, 단절의 범위에 걸쳐5. 그러나, miTBIs는 수시로 보고되지 않고 단지 짧은 기간 동안 경미한 인식 손상 귀착되기 때문에잘못 진단되고, 부상당한 개별은 일반적으로 완전히 6복구합니다. 대조적으로, 반복되는 miTBI 사건은 젊은 과 중년 성인에서 매우 널리 퍼진 때문에, 시간7에걸쳐 축적될 수 있고, 인지 발달을 손상시킬 수 있고, 신경 퇴행성 질환1,2,3,4,5,중등도 또는 중증 TBI8을경험하는 개인과 유사하게 증가하는 관심사가 되고 있다.
Zebrafish(Danio rerio)는중추 신경계9,10,11,12,13에걸쳐 분실 되거나 손상된 뉴런을 재생하는 기능을 포함하여 신경 과학에서 다양한 주제를 탐구하는 데 유용한 모델입니다. 신경 재생은 또한 등내 부위에 있는 아르치팔륨을 포함하는 텔렌스팔론에서 입증되었다. 이 신경 해부학 영역은 해마와 유사하며 물고기의 인식과인간14,15,16의짧은 메모리에 필요할 가능성이 있습니다. 또한, 제브라피쉬 의 행동은 광범위하게 특징지어지고카탈로그화되어 있다 17. 학습은 짧은 블록에서 수행 될 때 비 연관 학습의 빠른 형태를 나타낼 수있는 깜짝 반응(18)에대한 습관화를 포함하여 다양한 기술을 통해 연구되었으며, 급속한 부패 시간19에주의를기울입니다. T 박스, 플러스 미로 및 시각적 차별(20)및20과 같은 연관 학습의 더 복잡한 테스트가 사용되지만 종종 시간이 많이 걸리며 며칠 또는 몇 주 동안 준비가 필요하며 shoaling 또는 긍정적 인 보강에 의존합니다. 여기서는 연관 학습과 즉각적이거나 지연된 메모리를 모두 평가하는 빠른 패러다임을 설명합니다. 이 셔틀 박스 분석은 역경 자극과 부정적인 보강 컨디셔닝을 사용하여 무딘 힘 TBI에 따라 인지 적자와 회복을 평가합니다. 우리는 손상되지 않은 제어 성인 제브라피쉬 (8-24 개월)가 관찰자에 걸쳐 높은 수준의 일관성으로 셔틀 박스에서 20 번의 시험 (평가 <20 분)내에서 적색불을 피하는 법을 다시 배우는 것을 보여줍니다. 또한 셔틀 박스를 사용하면 성인(8-24개월)의 학습 능력과 기억 능력이 일관되며 TBI 가사 나 반복된 TBI 간에 상당한 장애가 있는 인지를 말하는 데 유용합니다. 더욱이, 이 방법은 성인 제브라피시의 인지 유지 또는 회복에 영향을 미치는 약물 내정간섭의 광범위한 질병 진행 또는 효능을 추적하는 지표로 급속하게 사용될 수 있었다.
여기서는 즉각적인 기억과 지연된 메모리 측면에서 복잡한 연관 학습(섹션 1)과 메모리를 모두 검사할 수 있는 신속한 인지 평가에 대한 교육 개요를 제공합니다. 이 패러다임은 학습 된 연관 인지 작업의 단기 및 장기 기억의 평가를 제공합니다 (섹션 2).
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Protocol
브라위피쉬는 프레이만 생명과학 센터의 노틀담 제브라피시 시설에서 자랐으며 유지되었습니다. 이 원고에 설명 된 방법은 노틀담 동물 관리 및 사용위원회 (동물 복지 보증 번호 A3093-01)의 대학에 의해 승인되었다.
1. 셔틀 박스 학습 패러다임(그림 1A)
참고: 학습 패러다임은 연관 학습에 관한 인식의 신속한 평가를 제공합니다.
- 30.5 x 19 x 7.5cm 젤 박스를 45° 각도로 양쪽에 추가한 5 x 19cm 크기의 수족관 급 플렉시글래스로 수정하여 셔틀 박스를 준비합니다. 물고기가 탱크의 중간을 교차 했을 때 평가 하는 탱크의 중간 지점을 표시 하는 선을 확인(그림 1B).
- 셔틀 박스에 800mL의 시스템 물을 추가합니다. 1 L의 탈온화 된 RO 물에 인스턴트 오션 60 mg을 용해하여이 물을 확인하십시오. 탱크 의 중앙에 물을 채우는 것은 5cm의 깊이로 채웁니다.
참고: 매 h~3마리의 물고기를 테스트한 후 매 h~c의 신선한 시스템 물로 대체하십시오. - 셔틀 박스 분석이 수행 될 어두운 방에위치한 시스템 물이 들어있는 홀딩 탱크에 2-3 물고기를 놓습니다.
- 어두운 방에는 1마리의 물고기를 셔틀박스 중앙에 놓고 뚜껑을 열고 전극을 전원 공급장치에 부착합니다.
참고: 적응 및 테스트 중에 방은 가능한 한 어둡게 유지되어야 합니다.
- 어두운 방에는 1마리의 물고기를 셔틀박스 중앙에 놓고 뚜껑을 열고 전극을 전원 공급장치에 부착합니다.
- 셔틀 박스에 물고기를 15분 동안 수용합니다.
참고: 조사관은 적응 기간 동안 방에 남아 있거나 시험 전에 충분한 시간으로 조용히 시험실로 돌아와 물고기가 조사관의 존재에 적응할 수 있도록 해야 합니다. 물고기가 자유롭게 탱크를 탐험 할 때 성공적인 적응을 고려할 수 있습니다.- 물고기가 탐험하지 못하면 추가로 15분 동안 계속 적응하십시오. 물고기가 여전히 셔틀 박스에 적응하지 못하는 경우, 물고기를 제거합니다. 이 물고기를 테스트하려면 사용하지 마십시오.
- 800루멘 레드 렌즈 손전등 ~2cm를 물고기가 점유한 측면의 젤 박스 벽에서 순출을 수동으로 비추는 다.
참고: 물고기가 셔틀 박스의 깊은 끝 근처 벽에 대한 백금 와이어 옆에 쉬고 있는 경우 재판을 시작하지 마십시오. - 물고기에 직접 빛 자극을 비추고 수동으로 자극의 지속적인 시각화를 보장하기 위해 빛과 물고기의 측면 움직임을 따르십시오(도 1C). 다음 조건 중 하나가 충족 될 때까지 빛 자극을 제공하기 위해 계속.
- 물고기가 15s의 광 노출 내에서 탱크의 중간 지점을 가로 질러 가는 경우 트레일이 성공적이라고 생각해 보십시오. 물고기가 중간 지점을 교차하면 즉시 빛 자극을 중지(그림 1D).
- 물고기가 15s의 상자 의 중간 지점을 가로 질러 교차하지 않는 경우 실패로 흔적을 고려하십시오. 이 경우, 전기전도 전원 공급 장치를 사용하여 음성 충격 자극(20mV:1 A)을 번갈아 가며 15s 기간 동안 Off 2 s, 또는 물고기가 상자의 중간 지점을 통과할 때까지 빛과 음극을 모두 종료합니다.
- 물고기가 30 s에 대한 휴식을 하자 및 반복 단계( 들) 1.5-1.6.2. 성공적인 시험 순서(1.6.1)와 실패한 시험(1.6.2)에 대한 자세한 기록을 보관하십시오.
참고: 여기에서 학습을 5회 연속 성공적인 시험의 완료로 정의했습니다. 학습이 입증되면, 물고기는 셔틀 박스에서 제거하고 인도적으로 안락사해야합니다.
2. 메모리 패러다임(그림 1A)
참고: 이 패러다임은 학습된 연관 인지 작업의 단기 및 장기 기억에 대한 평가를 제공합니다.
- 훈련 기간
- 셔틀 박스에 800mL의 시스템 물을 추가합니다. 1 L의 탈온화 된 RO 물에 인스턴트 오션 60 mg을 용해하여이 물을 확인하십시오. 탱크 의 중앙에 물을 채우는 것은 5cm의 깊이로 채웁니다.
참고 : 물은 매 h 또는 3 물고기를 테스트 한 후 28 °C에서 신선한 시스템 물로 대체해야합니다. - 셔틀 박스 분석이 수행 될 어두운 방에위치한 시스템 물이 들어있는 홀딩 탱크에 2-3 물고기를 놓습니다.
- 어두운 방에는 1마리의 물고기를 셔틀박스 중앙에 놓고 뚜껑을 열고 전극을 전원 공급장치에 부착합니다.
참고: 적응 및 테스트 중에 방은 가능한 한 어둡게 유지되어야 합니다. - 셔틀 박스에 물고기를 15분 동안 반갑게 합니다.
참고: 조사관은 적응 기간 동안 방에 남아 있거나 물고기가 조사관의 존재에 적응할 수 있도록 테스트하기 전에 충분한 시간을 가지고 조용히 시험실로 돌아와야 합니다. 물고기가 자유롭게 탱크를 탐험 할 때 성공적인 적응을 결정합니다. - 물고기가 탐험하지 못하면 추가로 15분 동안 계속 적응하십시오. 물고기가 여전히 셔틀 박스에 적응하지 못하는 경우, 물고기를 제거하고 테스트에 사용하지 마십시오.
- 성공적인 적응 후, 수작업으로 800 루멘 레드 렌즈 손전등 ~2cm 젤 박스 사이드 월에서, 물고기에 의해 점유 되는 셔틀 박스의 측면에 빛난다.
- 물고기에 직접 빛 자극을 비추고 물고기에 의해 자극의 지속적인 시각화를 보장하기 위해 빛과 물고기의 측면 움직임을 따르십시오.
- 물고기에 빛이 비추는 동안, 동시에 불리 한 충격 자극 (20 mV:1 A) 2 s On, 2 s Off 15 s (최대 4 충격)에 대 한 또는 물고기 상자의 중간 지점을 통과 할 때까지 적용 합니다. 일단 이것이 달성되면, 빛과 불리한 자극을 모두 종료합니다.
참고: 물고기가 30s동안 휴식을 취하도록 허용한 다음 25회 반복에 대해 2.1.6-2.1.8단계를 반복합니다(그림1A).
- 셔틀 박스에 800mL의 시스템 물을 추가합니다. 1 L의 탈온화 된 RO 물에 인스턴트 오션 60 mg을 용해하여이 물을 확인하십시오. 탱크 의 중앙에 물을 채우는 것은 5cm의 깊이로 채웁니다.
- 초기 테스트
- 훈련 기간 이후에 물고기에게 15분 의 휴식을 허용하십시오. 셔틀 박스에서 제거하지 마십시오. 이 휴식 기간 이후에 각 평가판을 엄격하게 통과/실패로 기록하여 초기 메모리 보존을 테스트합니다.
- 최대 15s의 라이트 자극만 적용하고 다음과 같이 응답을 기록합니다.
- 물고기가 빛 자극을 시작한 후 15 s 이내에 셔틀 박스의 중간 지점을 가로 질러 가는 경우 시험이 성공적이라고 생각해 보십시오. 물고기가 중간 지점을 교차 할 때 즉시 빛 자극을 중지합니다.
- 물고기가 빛 자극을 시작한 후 셔틀 박스 15s의 중간 지점을 가로질러 교차하지 않으면 시험이 실패한 것으로 간주하십시오. 15s 후 빛 자극을 중지합니다.
참고: 초기 테스트 중에 실패한 시도 에 따라 불리한 자극이 적용되지 않습니다.
- 반복 단계 2.2.2, 재판 사이의 30의 휴식 기간, 기록 성공적인 시험 (2.2.2.1) 및 실패 한 시험 (2.2.2.2) 에 걸쳐 25 재판. 이 값은 각 물고기에 대한 개별 참조 역할을 합니다.
- 즉각적인 메모리
- 바람직한 손상 패러다임에 의해 초기 시험 기간 직후에 부상을 유도한다(예를 들어, 수정된 Marmarou 체중 투하를 이용한 무딘 힘 외상). 쉽게 식별할 수 있는 생선을 개별적으로 보관할 수 있습니다. 초기 테스트 값을 기록하고 물고기를 동물 시설로 반환합니다.
참고 : 물고기는 이전에 설명 된 대로 무딘 힘 TBI에 의해부상했다 22. - 동물 시설에서 초기 테스트 및/또는 4h 후 부상 후(또는 문제의 실험 기간에) 2-3개의 손상되지 않은 또는 TBI 물고기를 수집합니다. 시스템 물이 들어있는 개별 탱크의 어두운 방에있는 모든 물고기를 유지하십시오.
- 셔틀 박스 의 중앙에 물고기를 배치 (1.1에 설명 된 대로 시스템 물로 준비), 한 번에 하나의 물고기, 뚜껑을 고정. 전원 공급 장치를 부착하고 물고기가 15 분 동안 적응 할 수 있습니다.
- 적응 후 최대 15s에 대한 광 자극만 적용하여 즉각적인 메모리(엄격하게 통과/실패)를 평가하고 다음과 같이 응답을 기록합니다.
- 물고기가 15의 시험 기간 내에 상자의 중간 지점을 가로 질러 가는 경우 시험이 성공적이라고 생각해 보십시오. 중간 지점을 건널 때 광 자극을 종료합니다.
- 물고기가 빛 자극을 시작하는 15 s 이내에 상자의 중간 지점을 교차하지 않는 경우 실패로 재판을 고려하십시오. 15의 기간이 끝난 후 빛 자극을 종료합니다.
참고: 이 부상 후 테스트 중에 실패한 시도 에 따라 불리한 충격 자극이 적용되지 않습니다.
- 시험 사이에 30의 휴식 기간을 가진 2.3.4단계를 반복하고, 25번의 시험에서 성공적인 시험(2.3.4.1)과 실패한 시험(2.3.4.2)의 수를 기록합니다.
- 방정식을 사용하여 부상 후 부상 후 성공적인 시험의 백분율 차이를 방정식을 사용하여 초기 테스트 기간의 백분율 차이를 계산합니다.
- 바람직한 손상 패러다임에 의해 초기 시험 기간 직후에 부상을 유도한다(예를 들어, 수정된 Marmarou 체중 투하를 이용한 무딘 힘 외상). 쉽게 식별할 수 있는 생선을 개별적으로 보관할 수 있습니다. 초기 테스트 값을 기록하고 물고기를 동물 시설로 반환합니다.
- 지연된 메모리
- 초기 테스트 기간 이후에 동물 시설로 쉽게 식별및 초기 테스트 값을 기록하기 위해 개별적으로 보관된 물고기를 반환합니다.
- 물고기 4 일 허용 (또는 문제의 실험 기간) 초기 테스트 및 부상 및/또는 지연 된 메모리 테스트 사이.
- 바람직한 손상 패러다임에 의해 부상을 유도한다(예: 수정된 마르마루 중량 저하와 같은 무딘 힘 외상을 유도한다). 집 어류는 개별적으로 개별적으로 초기 테스트 값을 쉽게 식별하고, 동물 시설로 물고기를 반환합니다.
참고 : 물고기는 이전에 설명 된 대로 무딘 힘 TBI에 의해부상했다 22. - 동물 시설에서 초기 테스트 및/또는 4h 후 부상 후(또는 문제의 실험 기간에) 2-3개의 손상되지 않은 또는 TBI 물고기를 수집합니다.
- 시스템 물을 포함하는 개별 탱크의 어두운 방에있는 모든 물고기를 유지하고 셔틀 박스 (1.1에 설명된 대로 시스템 물로 준비)의 중앙에 한 번에 하나를 놓고 뚜껑을 고정하고 전원 공급 장치를 부착하고 물고기가 15 분 동안 적응할 수 있도록하십시오.
- 다음 적응은 최대 15s에 대한 라이트 자극만 적용하여 즉각적인 메모리(엄격하게 통과/실패)를 평가하고 다음 응답을 기록합니다.
- 물고기가 15의 테스트 기간 내에 상자의 중간 지점을 가로 질러 가는 경우 트레일이 성공적이라고 생각해 보십시오. 중간 지점을 건널 때 광 자극을 종료합니다.
- 물고기가 빛 자극을 시작의 15 s 이내에 상자의 중간 지점을 교차하지 않는 경우 실패로 흔적을 고려, 빛 자극을 종료.
참고: 이 부상 후 테스트 중에 실패한 시도 에 따라 불리한 충격 자극이 적용되지 않습니다.
- 시험 사이에 30의 휴식 기간을 가진 2.4.6을 반복하고 25 번의 시험에서 성공적인 시험 (2.4.6.1)과 실패한 시험 (2.4.6.2)을 기록합니다.
- 방정식으로 초기 테스트 기간에 부상 후 의 성공적인 시험의 백분율 차이를 계산합니다.
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Representative Results
프로토콜 및 회로도(그림1)에설명된 학습 패러다임은 연관 학습에 대한 인식의 신속한 평가를 제공합니다. 또한, 이 패러다임은 학습을 5회 연속 양성 시험의 반복적이고 일관된 디스플레이로 정의함으로써 높은 수준의 스트링성을 가지고 있습니다. 이 패러다임은 또한 연령과 부상의 범위에 적용 할 수 있습니다. 8개월(청년 성인), 18개월(중년 성인), 24개월(고령자)의 손상되지 않은 물고기는 홍등(손상되지 않은 8m: 15.28 ± 4.92)을 피하는 행동을 배우기 위해 비슷한 수의 시험을 요구했습니다. 18m: 17.66 ± 5.5 시험, 24m: 16.2 ± 4.79 시험, 8 m 대 18 m p=0.92, 8 m vs. 24 m p=0.98, 18 m 대. 24 m p =0.97, 그림 2A). 우리는 또한 심한 무딘 힘 외상성 뇌 손상 (sTBI) 모델(22)를 활용하고 다른 연령대의 물고기가 부상 후 1-5 일 동안 분석기를 마스터하기 위해 유사한 수의 시험이 필요하다는 것을 관찰했습니다 (dpi; 8 m 대 18 m, p =0.09, 8 m vs 24 m, p=0.96, 18 m vs 24 m,p=0.96, 18 m vs 24 m, p=0.96, 18 m vs 24 m, p=0.96, 18 m vs 24 m). sTBI 다음 1일째, 모든 연령대의 생선(8, 18세, 및 24m) 행동을 배우기 위해 유사한 시험 (8 m : 73.3 ± 9.45 시험, 18 m : 79.33 ± 6.35 시험, 24 m : 68.25 ± 6.65 시험, 8 m 대 18 m p=0.71, 8 m 대 24 m p=0.7, 24 m p=0.7, 24 m.76, 24 m.76, 24 m.76, 24 m.76, 24 m.76, 24 m.76. 그림 2A) 손상되지 않은 컨트롤(p<0.01)보다 훨씬 컸습니다. 총체적으로, 이 데이터는 셔틀 박스가 나이 범위에 걸쳐 상해에 의한 인식 적자를 검사하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 보여주고 성인 제브라피쉬가 무딘 힘 상해 다음 인지적으로 복구할 수 있다는 것을 건의합니다.
반복되는 miTBI 이벤트는 점점 더 인지 기능을 손상시킬 수 있기 때문에, 우리는 반복적인 TBI를 사용하여 복용량 의존진행을 추적하는 지표로 셔틀 박스 분석법을 사용했습니다. 우리는 시간의 다른 길이에 대해 매일 반복되는 miTBI 무딘 힘 부상(22)에 따라 학습을 평가하기 위해이 분석법을 사용했습니다. 앞서 관찰한 바와 같이, 손상되지 않은 물고기는 16.4 ± 3.5시험(그림 2B)에서5회 연속 양성 시험을 달성한 셔틀박스를 빠르게 마스터했습니다. 단일 miTBI 다음 날, 물고기는 행동을 배울 수있는 시험의 수의 상당한 증가를 표시 (40.25 ± 12.65 시험, p<0.05, 그림 2B). 이 적자는 2 miTBI 이벤트 후 증가 (48 ± 14.9 재판) 3 miTBI 부상 후 더 상승 했다 (56.63 ± 12.75 재판, 그림 2B). 또한, 우리는 단수 부상을 받은 miTBI 물고기 와 3 부상 (p<0.05)사이 인지 장애에 있는 중요한 증가를 관찰했습니다.
또한 즉각적이고 지연된 메모리 패러다임(그림1A)에대한 프로토콜을 사용하여 반복되는 miTBI 이벤트에 따라 메모리가 어떻게 영향을 받는지 조사했습니다. 순진한 손상되지 않은 물고기는 훈련 기간과 초기 시험 기간을 부여받았고, 그 후 물고기의 일부가 즉각적인 기억으로 부상을 입었으며 다른 물고기는 지연 된 메모리(그림 2C)에액세스하기 위해 4 일 동안 물고기 시설로 반환되었습니다. 손상되지 않은 물고기는 초기 시험 기간 대비 즉각적인 기억(6.22% ± 4.7%)과 지연된 메모리(6.13%± 5.57%)에서 성공적인 시험의 퍼센트 차이가 약간 증가한 것으로 나타났습니다. 그런 다음 여러 무딘 힘 TBI 이벤트가 메모리에 미치는 영향을 조사했습니다. 즉각적인 메모리에서 miTBI 다음 에 따라 상당한 적자 관찰 되었다, 하지만 지연 된 메모리에. 단일 miTBI에 이어, 물고기는 손상되지 않은 물고기 (p<0.0001, 그림 2C)에비해 상당한 즉각적인 기억 적자 (-26.77 % ± 8.93 %)를 표시했다. 이러한 경향은 2배(-37.42% ± 10.01%)와 3배 미TBI(-39.71% ± 11.39%)에 이어 적자 증가와 함께 반복된 부상으로 이어졌다. 더욱이, 우리는 단일 (1x) miTBI와 3x miTBI (p<0.05, 도 2C)로처리된 물고기 사이 유사한 복용량 효력을 관찰했습니다. 이러한 데이터는 부상의 증가와 miTBI 물고기에서 학습및 메모리가 감소제안, 크게 적자와 위에서 설명 한 셔틀 박스 분석 및 프로토콜은 이러한 차이를 감지 할 만큼 민감증가.
그림 1: 셔틀 박스 분석. (A)인지 평가를 위한 학습 및 기억 패러다임에 대한 교육 개요. (B)셔틀 박스 분석용 변환된 대형 DNA 젤 박스의 회로도. (C,D) 시험 중에 자극 응용 프로그램의 그래픽 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 얼룩말피쉬는 무딘 힘 TBI에 따라 인지 적자를 표시합니다. (A)sTBI, 제브라피시 8, 18, 24개월 연령대의 학습 적자는 연령집단 간에 크게 다르지 않은 학습 적자를 나타낸다. 연령일치 컨트롤에 비해 셔틀 박스 패러다임을 배우는 시험 횟수가 크게 증가하여 1dpi에서 4-5 dpi로 손상되지 않은 수준으로 돌아오는 것을 관찰했습니다. (B,C) 반복 된 miTBI 물고기는 배움(B)과메모리(C)모두 복용량 의존 방식으로 적자를 표시. 평균 ± SEM은 A와 B로플롯되고 표준 편차가 C로±. 세 그래프의 각 데이터 포인트는 단일 성인 제브라피시를 나타냅니다. 통계 분석은 양방향 또는 양방향 ANOVA와 함께 수행되었으며 투키 후 Hoc 테스트를 수행했습니다. # p<0.05, ## p<0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인지 장애는 삶의 질에 크게 영향을 미칠 수 있습니다. 인구 전반에 걸쳐 뇌진탕과 외상성 뇌 손상의 가시성과 발생이 증가하기 때문에 인지 장애를 일으키는 방법과 손상을 최소화하거나 되돌릴 수있는 방법을 이해하는 것이 중요합니다. 이러한 이유로, 인지 감소에 대 한 테스트 할 수 있는 모델 유기 체 이러한 연구에서 중요 한 역할을. 설치류는 오랫동안 신경 행동 및 인식을 조사하는 주요 모델이지만, 제브라피쉬는 다양한 발달, 연령 관련 및 획득된 인지 적자17,20,23,24,25,26의다양한 별개의 행동을 가진 유용한 모델로 부상했습니다. 인식을 평가하는 다양한 방법은 습관의 형태로 1차원 학습에서 부터 복잡한 학습 및 공간 기억, 새로운 물체 및 위치 인식, 의사 결정18,19,20,21,27, 28에활용되었다. 그러나 이러한 인지 테스트는 연관이 없는 인식 테스트에 국한되거나 복잡한 설정, 장비에 대한 금융 투자 또는 테스트를 수행하기 전에 광범위한 시간 약정이 필요합니다. 대조적으로, 여기에 설명된 셔틀 박스와 학습 및 기억 패러다임은 비용 효율적이고, 빠르게 평가되고, 초보자 조사관에 의해 쉽게 채택되는 복잡한 연관 학습 분석법을 이용합니다. 가장 중요한 것은, 다른 인지 테스트와 일치, 우리의 분석은 손상되지 않은 물고기가 신속하게 연관 작업을 배우고 간헐적 인 훈련없이 나중에 작업을 기억 할 수 있음을 보여줍니다29.
분석의 적응성은 질병 진행 또는 기계론적 개입의 지표로서 학습과 기억의 다양한 시간 지점을 조사하는 방법을 제공합니다. 분석의 두 가지 주요 기능이 있습니다. 첫째, 방법은 간단합니다. 분석은 신속하게 설정되고 성공적이고 실패한 시험에 대해 명확하고 뚜렷한 엔드 포인트를 가지고 있어 다양한 조사관이 접근 할 수 있습니다. 우리는 이 분석의 단순성 때문에 셔틀 박스를 성공적으로 사용하는 데 필요한 문제 해결이 거의 없다는 것을 발견했습니다. 둘째, 분석법은 다른 인지 시험에 비해 매우 빠르며, 이는 하루 만에 많은 수의 물고기를 빠르게 검사할 수 있는 유연성이나 능력을 제공합니다. 학습을 평가하는 시간은 최소 19.75 분(그림1)이며, 물고기는 셔틀 박스 (탱크 탐사에 의해 결정됨)에 적응하기 위해 15 분이 소요되며, 단일 실패 시험 (15 s 광 자극, 15 s aversion 자극, 시험 사이의 30 s) 및 5 즉각적이고 연속적인 양성 시험 (<15 s 광 자극)이 뒤따릅니다. 실제로, 손상되지 않은 물고기는 6-30 시험 (19.75 분 - 43.75 분)이 필요한 반면 극단적 인 경우 (심한 무딘 힘의 외상에 따라) 가장 심각한 적자는 100 시험 (113.75 분)을 필요로 할 수 있습니다. 메모리 연구도 빠르게 수행됩니다. 프로토콜 개요에 따라 적응, 훈련 및 초기 테스트에 필요한 최소 시간은 67.5분(15분 적응, 15s에 대한 빛과 충격 25회 반복, 시험 간 휴식 30회, 불리한 자극 없이 초기 테스트를 위해 반복)입니다. 즉각적이거나 지연된 메모리를 재검사하려면 부상, 치료 또는 인지 적자에 관계없이 33.75분(15분 적응, 15s에 대한 가벼운 자극 25회, 시험 간 휴식 30회)만 필요합니다.
신경 행동을 평가 할 때, 다양 한 패러다임 긍정적인 또는 불리 한 자극을 활용. 종종 고전적인 T 박스 미로에서 사용되는 음식이나 사회적 상호 작용의 형태로 긍정적 인 자극은 학습 된 작업의 강력한 응답을 도울 수 있습니다. 그러나, 긍정적 인 협회를 활용하는 분석은 시간의 비용으로 그렇게. 대조적으로, 불리한 자극에 응하여 컨디셔닝은 급속한 연관및 강한 행동 반응을 제공하지만, 불리한 자극의 희생에 있습니다. 손상되지 않은 물고기는 종종 셔틀 박스 분석법을 빨리 배우고 따라서 충격의 최소한의 숫자를 받게되며, 결과적으로 부작용이없는 것 같습니다. 그러나, 신경학적으로 손상된 물고기 (TBI), 심각한 인지 적자와, 시험 및 전기 충격의 상당수를 필요로 한다. 이 다중 충격은 때때로 강장성 clonic 발작귀착되기 위하여 관찰되었습니다. 셔틀 박스 안에 있는 동안 강장제 발작을 경험하는 모든 물고기는 즉시 제거하고 윤리적으로 안락사해야합니다. 압수 이벤트를 포함하여 안락사 된 물고기에 대한 모든 시험은 통계 분석에서 제외되어야합니다. 또한, 신경학적으로 손상된 피사체에 대한 감전은 셔틀 박스에서 발생하지 않는 손상된 물고기 사이에 의도하지 않은 차이를 부과할 수 있다는 점에 주목할 필요가 있습니다. 이러한 이유로, 신경 행동 평가를 위해 복종하는 모든 물고기는 다른 정량적 메트릭(혈청 바이오마커, IHC 등)에 사용해서는 안 된다고 제안합니다. 또한 이 학습 방법은 시각적 자극을 기반으로 하며 결과를 혼동할 수 있으므로 시각적 회로를 손상시킬 수 있는 손상에 적합하지 않다는 것을 이해하는 것이 중요합니다.
우리의 결과는 무딘 힘 TBI에 따라, 제브라피쉬는 셔틀 박스 분석에서 연관 작업을 마스터하기 위해 증가 된 시험결과 빠른 인지 적자를 나타낸다는 것을 보여줍니다. TBI의 설치류 모델에서도 비슷한 즉각적인 적자가 나타나지만 이러한 적자는 감소할 수 있지만, 종종 지속되고30도에 유의하게 남아 있습니다. 대조적으로, 제브라피쉬는 부상 후 7일 이내에 인지 회복을 표시합니다. 성인 제브라피쉬의 재생 능력은 잘 문서화되어있으며,10,11,12,13,14,15,공지체/자뇌파 영역의 심실/심실 영역에서 공지된 신경질성 틈새가있는 31,32. TBI 다음 우리의 분석에서 관찰 된 인지 회복은 이러한 신경 질 틈새 가 자극 되고 조직 및 인지 회복에 역할을 하는지 확인하기 위해 필요한 시험에 대한 통찰력을 제공합니다.
결론적으로, 셔틀 박스는 연관 학습 및 메모리에 관한 인식의 신속한 평가를 제공합니다. 분석은 최소한의 주영장비를 활용하며 기술적으로 간단합니다. 미래의 응용 프로그램은 신경 보호뿐만 아니라 다른 부상 패러다임 이나 신경 퇴행성 모델과 관련하여 신경학적으로 모욕 물고기에 유전 및 약리학적 개입을 평가하는 데 활용 될 수있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 하이드 랩 회원들에게 사려 깊은 토론과 제브라피시 치료 및 축산에 대한 프레이만 생명 과학 센터 기술자에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 작품은 노틀담 대학의 제브라피시 연구 센터, 노틀담 대학의 줄기 세포 및 재생 의학 센터, NIH R01-EY018417 (DRH), 국립 과학 재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램 (JTH), 노트르 담 (JTH)의 LTC 닐 하이랜드 펠로우십의 국립 안과 연구소에서 보조금을 지원받았습니다. 자유 펠로우십(JTH)과 팻 틸만 장학금(JTH)의 센티넬. 그림 1은 BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
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