Summary
A aprendizagem e a memória são métricas potentes no estudo de prejuízos cognitivos induzidos pelo desenvolvimento, dependentes de doenças ou ambientalmente. A maioria das avaliações cognitivas requer equipamentos especializados e compromissos de tempo extensos. No entanto, o ensaio da caixa de transporte é uma ferramenta de aprendizagem associativa que utiliza uma caixa de gel convencional para avaliação rápida e confiável da cognição de zebrafish adulto.
Abstract
Déficits cognitivos, incluindo aprendizagem e memória prejudicadas, são um sintoma primário de várias doenças neurodegenerativas relacionadas ao desenvolvimento e à idade e lesão cerebral traumática (TCE). O zebrafish é um importante modelo de neurociência devido à sua transparência durante o desenvolvimento e robustas capacidades regenerativas após o neurotrauma. Embora existam vários testes cognitivos em zebrafish, a maioria das avaliações cognitivas que são rapidamente examinam o aprendizado não associativo. Ao mesmo tempo, ensaios de aprendizagem associativa geralmente requerem vários dias ou semanas. Aqui, descrevemos um teste rápido de aprendizagem associativa que utiliza um estímulo adverso (choque elétrico) e requer um tempo mínimo de preparação. O ensaio da caixa de transporte, apresentado aqui, é simples, ideal para investigadores iniciantes, e requer equipamento mínimo. Demonstramos que, após o TBI, este teste de caixa de transporte avalia de forma reprodutifica o déficit cognitivo e a recuperação de zebrafish jovens a velhos. Além disso, o ensaio é adaptável para examinar a memória imediata ou atrasada. Demonstramos que tanto um único TBI quanto repetidos eventos TBI afetam negativamente o aprendizado e a memória imediata, mas não a memória atrasada. Concluímos, portanto, que o ensaio da caixa de transporte rastreia de forma reprodutível a progressão e a recuperação do comprometimento cognitivo.
Introduction
O aprendizado e a memória são rotineiramente usados como métricas de comprometimento cognitivo, o que acontece devido ao envelhecimento, doença neurodegenerativa ou lesão. Lesões cerebrais traumáticas (TBIs) são a lesão mais comum que resulta em déficits cognitivos. Os TBIs são de crescente preocupação devido à sua associação com diversos distúrbios neurodegenerativos, como demência frontotemporal e doença de Parkinson1,2. Além disso, o aumento das agregações beta-amilóides observadas em alguns pacientes com TCE sugerem que também pode estar associado ao desenvolvimento da doença de Alzheimer3,4. As TBIs são frequentemente o resultado de um trauma de força bruta e abrangem uma série de gravidades5, com lesões cerebrais leves (miTBI) sendo as mais comuns. No entanto, os miTBIs são muitas vezes não relatados e mal diagnosticados porque resultam em pequenos prejuízos cognitivos por apenas um curto período, e os indivíduos feridos geralmente se recuperam plenamente6. Em contraste, os repetidos eventos miTBI têm sido uma preocupação crescente, pois é altamente prevalente em adultos jovens e de meia-idade, pode se acumular ao longo do tempo7, pode prejudicar o desenvolvimento cognitivo e exacerbar doenças neurodegenerativas1,2,3,4,5, semelhantes a indivíduos que experimentam um TBI8moderado ou grave .
O zebrafish (Danio rerio) é um modelo útil para explorar uma variedade de tópicos na neurociência, incluindo a capacidade de regenerar neurônios perdidos ou danificados em todo o sistema nervoso central9,10,11,12,13. A regeneração neural também foi demonstrada no telencephalon, que contém o arquepião na região dorsal-interior. Esta região neuroanatomética é análoga ao hipocampo e é provavelmente necessária para cognição em peixes e para a memória de curto tempo em humanos14,15,16. Além disso, o comportamento dos zebrafish tem sido amplamente caracterizado e catalogado17. A aprendizagem tem sido estudada por meio de diversas técnicas, incluindo a habituação à resposta do início18,que pode representar uma forma rápida de aprendizagem não associativa quando realizada em blocos curtos e com atenção ao rápido tempo de decadência19. Testes mais complexos de aprendizagem associativa, como caixas T, mais labirintos e discriminação visual20,21 sãousados,mas muitas vezes são demorados, exigem dias ou semanas de preparação e dependem de cardumes ou reforço positivo. Aqui, descrevemos um paradigma rápido para avaliar tanto o aprendizado associativo quanto a memória imediata ou atrasada. Este ensaio da caixa de transporte usa um estímulo aversivo e condicionamento de reforço negativo para avaliar déficits cognitivos e recuperação após tbi de força bruta. Demonstramos que o zebrafish adulto de controle não danificado (8-24 meses) aprende reproduivelmente a evitar a luz vermelha dentro de 20 ensaios (<20 minutos de avaliação) na caixa de transporte, com um alto grau de consistência entre os observadores. Além disso, usando a caixa de transporte demonstramos que as habilidades de aprendizagem e memória em adultos (8-24 meses de idade) são consistentes e são úteis para avaliar a cognição com prejuízos significativos entre diferentes gravidades de TCE ou TBI repetidas. Além disso, este método poderia ser rapidamente empregado como uma métrica para rastrear uma ampla gama de progressões da doença ou eficácia de intervenções medicamentosas que impactam a manutenção ou recuperação da cognição em zebrafish adultos.
Aqui, fornecemos uma visão geral instrutiva de uma rápida avaliação cognitiva que pode examinar tanto o aprendizado associativo complexo (seção 1) quanto a memória em termos de memória imediata e retardada. Esse paradigma fornece uma avaliação da memória de curto e longo prazo de uma tarefa cognitiva associativa aprendida (seção 2).
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Protocol
Os zebrafish foram criados e mantidos na instalação de zebrafish de Notre Dame no Centro de Ciências da Vida de Freimann. Os métodos descritos neste manuscrito foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso animal da Universidade de Notre Dame (Número de Garantia do Bem-Estar Animal A3093-01).
1. Paradigma de aprendizagem da caixa de transporte(Figura 1A)
NOTA: O paradigma de aprendizagem proporciona uma rápida avaliação da cognição em relação à aprendizagem associativa.
- Prepare a caixa de transporte modificando uma caixa de gel de 30,5 x 19 x 7,5 cm com uma peça de plexiglass de grau de aquário de 5 x 19 cm adicionada a cada lado em um ângulo de 45°. Faça uma linha marcando a metade do tanque para avaliar quando os peixes cruzaram o meio do tanque(Figura 1B).
- Adicione 800 mL de água do sistema à caixa de transporte. Faça essa água dissolvendo 60 mg de Oceano Instantâneo em 1 L de água desionizada ro. Encha a água até o meio do tanque a uma profundidade de 5 cm.
NOTA: Substitua por água fresca do sistema a 28 °C a cada h ou após o teste de 3 peixes. - Coloque 2-3 peixes em um tanque de retenção contendo água do sistema, localizado em uma sala escura onde o ensaio da caixa de transporte será realizado.
- Na sala escura, coloque 1 peixe no centro da caixa de transporte, fixe a tampa e conecte os eletrodos a uma fonte de alimentação.
NOTA: A sala deve permanecer o mais escura possível durante a aclimatação e os testes.
- Na sala escura, coloque 1 peixe no centro da caixa de transporte, fixe a tampa e conecte os eletrodos a uma fonte de alimentação.
- Aclimespe o peixe na caixa de transporte por 15 minutos.
NOTA: O investigador deve permanecer na sala durante o período de aclimatação ou retornar à sala de testes discretamente com tempo suficiente antes do teste para permitir que os peixes se ajustem à presença do investigador. A aclimatação bem sucedida pode ser considerada quando o peixe explora livremente o tanque.- Se o peixe não explorar, continue a aclimatação por mais 15 minutos. Se o peixe ainda não se aclimatar à caixa de transporte, remova os peixes. Não use este peixe para testes.
- Brilhe manualmente uma lanterna de lente vermelha de 800 lúmen ~2 cm da parede da caixa de gel ao lado ocupada pelo peixe, após a aclimatação.
NOTA: Não inicie um teste se o peixe estiver descansando ao lado do fio de platina contra a parede perto das extremidades profundas da caixa de transporte. - Brilhe o estímulo leve diretamente sobre o peixe e siga manualmente qualquer movimento lateral do peixe com a luz para garantir a visualização contínua do estímulo(Figura 1C). Continue fornecendo o estímulo leve até que qualquer uma das seguintes condições seja atendida.
- Considere a trilha bem sucedida se o peixe atravessar a metade do tanque dentro dos 15 s de exposição à luz. Uma vez que o peixe cruze a metade do caminho, pare imediatamente o estímulo leve(Figura 1D).
- Considere a trilha como falhada se o peixe não atravessar a metade da caixa em 15 s. Neste caso, use uma fonte de alimentação eletroforese para aplicar um estímulo de choque negativo (20 mV:1 A) alternando 2 s de On, 2 s de Off por um período de 15 s (máximo de 4 choques), ou até que o peixe passe no meio da caixa, momento em que termina tanto o estímulo leve quanto negativo.
- Deixe o peixe descansar por 30 s e repita passos(s) 1.5-1.6.2. Mantenha um registro detalhado da ordem dos ensaios bem-sucedidos (1.6.1) e ensaios fracassados (1.6.2).
NOTA: Aqui, definimos o aprendizado como a conclusão de 5 testes consecutivos de sucesso. Uma vez demonstrado o aprendizado, o peixe deve ser removido da caixa de transporte e humanamente eutanásiado.
2. Paradigma de memória(Figura 1A)
NOTA: Este paradigma fornece uma avaliação da memória de curto e longo prazo de uma tarefa cognitiva associativa aprendida.
- Período de treinamento
- Adicione 800 mL de água do sistema à caixa de transporte. Faça essa água dissolvendo 60 mg de Oceano Instantâneo em 1 L de água desionizada ro. Encha a água até o meio do tanque a uma profundidade de 5 cm.
NOTA: A água deve ser substituída por água fresca do sistema a 28 °C a cada hora ou após o teste de 3 peixes. - Coloque 2-3 peixes em um tanque de retenção que contenha água do sistema, localizado em uma sala escura onde o ensaio da caixa de transporte será realizado.
- Na sala escura, coloque 1 peixe no centro da caixa de transporte, fixe a tampa e conecte os eletrodos a uma fonte de alimentação.
NOTA: A sala deve permanecer o mais escura possível durante a aclimatação e os testes. - Peixe aclimate na caixa de transporte por 15 minutos.
NOTA: O investigador deve permanecer na sala durante o período de aclimatação ou retornar à sala de testes discretamente com tempo suficiente antes dos testes para permitir que os peixes se ajustem à presença do investigador. Determine a aclimatação bem sucedida quando o peixe estiver explorando livremente o tanque. - Se o peixe não explorar, continue a aclimatação por mais 15 minutos. Se o peixe ainda não se aclimatar à caixa de transporte, remova o peixe e não o use para testes.
- Após a aclimatação bem sucedida, brilhe manualmente uma lanterna de lente vermelha de 800 lúmen ~2 cm da parede lateral da caixa de gel, na lateral da caixa de transporte que é ocupada pelo peixe.
- Brilhe o estímulo leve diretamente sobre o peixe e siga qualquer movimento lateral do peixe com a luz para garantir a visualização contínua do estímulo pelos peixes.
- Enquanto a luz está brilhando sobre o peixe, aplique simultaneamente o estímulo de choque adverso (20 mV:1 A) alternando 2 s On, 2 s Off para 15 s (máximo de 4 choques), ou até que o peixe passe a metade da caixa. Uma vez que isso seja alcançado, termine tanto a luz quanto o estímulo adverso.
NOTA: Deixe o peixe descansar por 30 s e repita o passo 2.1.6-2.1.8 para 25 iterações(Figura 1A).
- Adicione 800 mL de água do sistema à caixa de transporte. Faça essa água dissolvendo 60 mg de Oceano Instantâneo em 1 L de água desionizada ro. Encha a água até o meio do tanque a uma profundidade de 5 cm.
- Testes iniciais
- Deixe 15 minutos de descanso para o peixe após o período de treinamento. Não os remova da caixa de transporte. Teste a retenção inicial de memória registrando cada ensaio como estritamente passar/falhar, imediatamente após este período de descanso.
- Aplique apenas o estímulo leve para até 15 s e regise as respostas da seguinte forma.
- Considere o teste bem sucedido se o peixe atravessar a metade da caixa de transporte dentro de 15 s depois de iniciar o estímulo de luz. Pare o estímulo leve imediatamente quando o peixe cruzar a metade do caminho.
- Considere o ensaio como falhou se o peixe não atravessar a metade da caixa de transporte 15 s depois de iniciar o estímulo de luz. Pare o estímulo leve depois dos 15 s.
NOTA: Durante o teste inicial, um estímulo adverso não é aplicado após uma tentativa fracassada.
- Repita a etapa 2.2.2, com um período de descanso de 30 s entre os ensaios, e grave testes bem-sucedidos (2.2.2.1) e testes fracassados (2.2.2.2) em 25 ensaios. Esse valor servirá como referência individual para cada peixe.
- Memória imediata
- Induzir lesão imediatamente após o período inicial de teste pelo paradigma de dano preferencial (por exemplo, um trauma por força bruta usando a queda de peso de Marmarou modificada). Peixes domésticos individualmente para uma identificação fácil. Regissuça seus valores iniciais de teste e devolva os peixes para a instalação animal.
NOTA: Os peixes foram feridos por TBI de força bruta como descrito anteriormente22. - Reúna 2-3 peixes não danificados ou TBI 4h após os testes iniciais e/ou 4h pós-lesão (ou no período experimental em questão) da instalação animal. Mantenha todos os peixes na sala escura em tanques individuais contendo água do sistema.
- Coloque os peixes no centro da caixa de transporte (preparado com água do sistema como descrito em 1.1), um peixe de cada vez, e proteja a tampa. Conecte a fonte de alimentação e deixe o peixe aclimatar por 15 minutos.
- Após a aclimatação, avalie a memória imediata (estritamente passar/falhar) aplicando apenas o estímulo leve para até 15 s e registre as respostas da seguinte forma.
- Considere o teste bem sucedido se o peixe atravessar a metade da caixa dentro do período de teste de 15 s. Termine o estímulo leve ao cruzar a metade do caminho.
- Considere o ensaio como falho se o peixe não cruzar a metade da caixa dentro de 15 s de iniciar o estímulo leve. Termine o estímulo leve após o término do período de 15 s.
NOTA: Durante este teste pós-lesão, o estímulo de choque adverso não é aplicado após uma tentativa fracassada.
- Repita a etapa 2.3.4, com um período de descanso de 30 s entre os ensaios, e regise o número de ensaios bem-sucedidos (2.3.4.1) e testes fracassados (2.3.4.2) em 25 ensaios.
- Calcule a diferença percentual em ensaios bem-sucedidos após a lesão no período inicial de teste usando a equação:
- Induzir lesão imediatamente após o período inicial de teste pelo paradigma de dano preferencial (por exemplo, um trauma por força bruta usando a queda de peso de Marmarou modificada). Peixes domésticos individualmente para uma identificação fácil. Regissuça seus valores iniciais de teste e devolva os peixes para a instalação animal.
- Memória atrasada
- Os peixes de retorno, alojados individualmente para fácil identificação e registro de seus valores iniciais de teste, para a instalação animal imediatamente após o período inicial de testes.
- Permitir aos peixes 4 dias (ou o período experimental em questão) entre os testes iniciais e o teste de memória e/ou atraso.
- Induzir lesão pelo paradigma de dano preferido (como a queda de peso modificada de Marmarou para induzir um trauma de força bruta). Peixes domésticos individualmente para fácil identificação dos valores iniciais de teste, e devolução de peixes para a instalação animal.
NOTA: Os peixes foram feridos por TBI de força bruta como descrito anteriormente22. - Reúna 2-3 peixes não danificados ou TBI 4h após os testes iniciais e/ou 4h pós-lesão (ou no período experimental em questão) da instalação animal.
- Mantenha todos os peixes na sala escura em tanques individuais contendo água do sistema, e coloque um de cada vez no centro da caixa de transporte (preparado com água do sistema como descrito em 1.1), proteja a tampa, conecte a fonte de alimentação e permita que os peixes 15 minutos se aclimatar.
- Após a aclimatação, avalie a memória imediata (estritamente passar/falhar) aplicando apenas o estímulo de luz para até 15 s e registre as seguintes respostas:
- Considere a trilha bem sucedida se o peixe atravessar a metade da caixa dentro do período de teste de 15 s. Termine o estímulo leve ao cruzar a metade do caminho.
- Considere a trilha como falhada se o peixe não atravessar a metade da caixa dentro de 15 s de iniciar o estímulo leve, terminar o estímulo leve.
NOTA: Durante este teste pós-lesão, um estímulo de choque adverso não é aplicado após uma tentativa fracassada.
- Repita a etapa 2.4.6, com um período de descanso de 30 s entre os ensaios, e regise o número de ensaios bem-sucedidos (2.4.6.1) e testes fracassados (2.4.6.2) em 25 ensaios.
- Calcule a diferença percentual em ensaios bem-sucedidos de pós-lesão ao período inicial de teste com a equação:
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Representative Results
O paradigma de aprendizagem, delineado no protocolo e no esquema (Figura 1),proporciona uma rápida avaliação da cognição no que diz respeito à aprendizagem associativa. Além disso, esse paradigma tem um alto nível de stringency, definindo o aprendizado como uma exibição repetida e consistente de 5 ensaios positivos consecutivos. Esse paradigma também é aplicável a uma série de idades e lesões. Peixes intactos aos 8 meses (adulto jovem), 18 meses (adulto de meia-idade) e 24 meses (idoso) exigiram um número semelhante de ensaios para aprender o comportamento de evitar a luz vermelha (Intacto 8 m: 15,28 ± 4,92 ensaios, 18 m: 17,66 ± 5,5 ensaios, 24 m: 16,2 ± 4,79 ensaios, 8 m vs. 18 m p=0,92, 8 m vs. 24 m p=0,98, 18 m vs. 24 m p=0,97, Figura 2A). Também utilizamos uma lesão cerebral traumática grave (sTBI) modelo22 e observamos que os peixes em diferentes idades exigiam um número semelhante de ensaios para dominar o ensaio durante 1-5 dias após a lesão (dpi; 8 m vs 18 m, p=0,09, 8 m vs 24 m, p=0,96, 18 m vs 24 m, p=0,12, Figura 2A). No primeiro dia seguinte ao STBI, peixes de todas as idades (8, 18 e 24 m) exigiram um número semelhante de ensaios para aprender o comportamento (8 m: 73,3 ± 9,45 ensaios, 18 m: 79,33 ± 6,35 ensaios, 24 m: 68,25 ± 6,65 ensaios, 8 m vs. 18 m p=0,71, 8 m vs. 24 m p=0,76, 18 m vs. 24 m p=0,28, Figura 2A) e todos foram significativamente maiores do que os controles não danificados (p<0,01). Coletivamente, esses dados demonstram que a caixa de transporte pode ser utilizada para examinar déficits cognitivos induzidos por lesões em todas as faixas etárias e sugerem que o zebrafish adulto pode se recuperar cognitivamente após lesões por força bruta.
Como eventos repetidos de miTBI podem prejudicar cada vez mais a função cognitiva, usamos o ensaio da caixa de transporte como uma métrica para rastrear a progressão dependente de dose usando TBI repetitivo. Nós utilizamos este ensaio para avaliar o aprendizado após uma lesão de força bruta miTBI22 que é repetida diariamente pelos diferentes períodos de tempo. Como observado anteriormente, os peixes não danificados dominaram rapidamente a caixa de transporte alcançando 5 ensaios positivos consecutivos em 16,4 ± 3,5 ensaios(Figura 2B). Um dia após um único miTBI, os peixes apresentam um aumento significativo no número de ensaios para aprender o comportamento (40,25 ± 12,65 ensaios, p<0,05, Figura 2B). Esse déficit aumentou após 2 eventos miTBI (48 ± 14,9 ensaios) e foi ainda mais elevado após 3 miTBI (56,63 ± 12,75 ensaios, Figura 2B). Além disso, observou-se um aumento significativo do comprometimento cognitivo entre os peixes miTBI que receberam uma lesão singular e 3 lesões (p<0,05).
Também examinamos como a memória foi afetada após repetidos eventos miTBI usando o protocolo para paradigmas de memória imediatos e atrasados(Figura 1A). Peixes ingênuos não danificados receberam um período de treinamento e um período inicial de testes, após o qual uma porção de peixes foi ferida para memória imediata e outros foram devolvidos à instalação de peixes por 4 dias para acessar a memória atrasada(Figura 2C). Os peixes não danificados apresentam um ligeiro aumento na diferença percentual de ensaios bem-sucedidos tanto na memória imediata (6,22% ± 4,7%) quanto na memória atrasada (6,13% ± 5,57%) em relação ao período inicial de testes. Nós examinamos o efeito de múltiplos eventos tbi de força bruta tiveram na memória. Déficits significativos foram observados após o MITBI na memória imediata, mas não em memória atrasada. Após um único miTBI, os peixes apresentaram déficits significativos de memória imediata (-26,77% ± 8,93%) em comparação com peixes não danificados (p<0,0001, Figura 2C). Essa tendência continuou com o prejuízo repetido, com déficits crescentes, seguindo tanto o 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) quanto o 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%). Além disso, observou-se um efeito de dose semelhante entre os peixes tratados com um único (1x) miTBI e 3x miTBI (p<0,05, Figura 2C). Esses dados sugerem que o aprendizado e a memória são reduzidos em peixes miTBI com o número crescente de lesões, aumentando significativamente o déficit e o ensaio e protocolos descritos acima são sensíveis o suficiente para detectar essas diferenças.
Figura 1: O ensaio da caixa de transporte. (A) Visão geral instrutiva dos paradigmas de aprendizagem e memória para avaliação cognitiva. (B) Esquema de uma caixa de gel de DNA grande convertida para o ensaio da caixa de transporte. (C,D) Representação gráfica da aplicação de estímulos durante os ensaios. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os zebrafish apresentam déficits cognitivos após a força bruta TBI. (A) Seguindo o STBI, os zebrafish aos 8, 18 e 24 meses de idade apresentam déficits de aprendizagem significativamente diferentes entre as faixas etárias. Aumentos significativos no número de ensaios para aprender o paradigma da caixa de transporte em comparação com os controles com correspondência etária foram observados em 1 dpi retornando a níveis não danificados por 4-5 dpi. (B,C) Os peixes miTBI repetidos apresentaram tanto déficits de aprendizagem (B) quanto de memória(C) de forma dependente de dose. A média ± SEM é plotada em A e B,enquanto a média ± desvio padrão é plotada em C. Cada ponto de dados nos três gráficos representa um único zebrafish adulto. As análises estatísticas foram realizadas com um ANOVA unidirecional ou bidirecional seguido de um teste pós-hoc de Tukey. # p<0,05, ## p<0.01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O comprometimento cognitivo pode impactar significativa e negativamente a qualidade de vida. Devido ao aumento da visibilidade e ocorrência de concussões e lesões cerebrais traumáticas em toda a população, é importante entender como causam comprometimento cognitivo e como os danos podem ser minimizados ou revertidos. Por essas razões, organismos modelo que podem ser testados para declínio cognitivo desempenham um papel crítico nesses estudos. Os roedores têm sido há muito tempo o modelo primário para investigar o neuroenhúrbio e a cognição, no entanto, os zebrafish emergiram como um modelo útil com numerosos comportamentos distintos para investigar uma gama de déficits cognitivos de desenvolvimento, relacionados à idade e adquiridos17,20,23,24,25,26. Vários métodos para avaliar a cognição têm sido utilizados desde a aprendizagem unidimensional na forma de habitação, até a aprendizagem complexa e memória espacial, novo reconhecimento de objetos e localização e tomada de decisões18,19,20,21,27,28. No entanto, esses testes cognitivos limitam-se a testar a cognição não associativa ou requerem uma configuração complexa, investimento financeiro em equipamentos ou um compromisso de tempo extensivo antes que os testes possam ser realizados. Em contraste, a caixa de transporte e os paradigmas de aprendizagem e memória descritos aqui utilizam um ensaio de aprendizagem associativo complexo que é econômico, rapidamente avaliado e facilmente empregado por um investigador novato. Mais importante, consistente com os outros testes cognitivos, nosso ensaio demonstra que peixes não danificados aprendem rapidamente a tarefa associativa e podem se lembrar da tarefa dias depois sem treinamento intermitente29.
A adaptabilidade do ensaio fornece caminhos para investigar vários pontos de tempo de aprendizado e memória como uma métrica de progressão da doença ou intervenções mecanicistas. Há duas características primárias do ensaio. Primeiro, o método é simples. O ensaio é rapidamente configurado e tem pontos finais claros e distintos em relação a testes bem-sucedidos e fracassados, tornando-o acessível a uma gama de investigadores. Descobrimos que devido à simplicidade deste ensaio, há muito pouca solução de problemas necessária para usar a caixa de transporte com sucesso. Em segundo lugar, o ensaio é extremamente rápido em comparação com outros exames cognitivos, o que proporciona flexibilidade ou a capacidade de examinar um grande número de peixes rapidamente em um único dia. O tempo para avaliar o aprendizado é de no mínimo 19,75 min(Figura 1),com o peixe exigindo 15 minutos para se adaptar à caixa de transporte (determinada pela exploração de tanques), seguida de um único teste falho (estímulo de luz de 15 s, estímulo de aversão de 15 s, 30 s entre ensaios) e 5 ensaios positivos imediatos e consecutivos (<15 estímulos leves). Na prática, observou-se que os peixes não danificados requerem 6-30 ensaios (19,75 min-43,75 min), enquanto em casos extremos (após um trauma grave por força bruta), os déficits mais graves podem exigir 100 ensaios (113,75 min). Estudos de memória também são realizados rapidamente. Seguindo o esboço do protocolo, o tempo mínimo necessário para aclimatação, treinamento e testes iniciais é de 67,5 min (aclimatação de 15 min, 25 iterações de luz e choque para 15 s, 30 s de descanso entre os ensaios e repetição para testes iniciais sem os estímulos adversos). Enquanto reteste a memória imediata ou atrasada requer apenas 33,75 min (aclimatação de 15 minutos, 25 iterações de apenas estímulo leve para 15 s e repouso de 30 s entre os ensaios), independentemente de lesão, tratamento ou déficit cognitivo.
Ao avaliar o comportamento neurobeh, vários paradigmas utilizam estímulos positivos ou adversos. Estímulos positivos na forma de comida ou interação social, muitas vezes usados em labirintos clássicos de t-box, podem ajudar em uma forte resposta de uma tarefa aprendida. No entanto, os ensaios utilizando associação positiva o fazem às custas do tempo. Em contraste, enquanto o condicionamento em resposta a um estímulo adverso proporciona uma rápida associação e forte resposta comportamental, é às custas do estímulo adverso. Peixes não danificados muitas vezes aprendem o ensaio da caixa de transporte rapidamente e, portanto, são submetidos a um número mínimo de choques, e como resultado parecem não ter eventos adversos. No entanto, peixes neurologicamente comprometidos (TCE), com déficits cognitivos graves, requerem um número significativo de ensaios e choques elétricos. Estes múltiplos choques têm sido observados ocasionalmente resultando em convulsões tônica-clonic. Qualquer peixe que experimente uma convulsão tônica-clonic enquanto estiver dentro da caixa de transporte deve ser imediatamente removido e eticamente eutanizado. Todos os ensaios para o peixe eutanizado, até e incluindo o evento de apreensão, devem ser excluídos em qualquer análise estatística. Além disso, vale a pena notar que o choque elétrico a um sujeito neurologicamente danificado poderia impor diferenças não intencionais entre peixes danificados que são e não são resultantes da caixa de transporte. Por essa razão, sugerimos que todos os peixes submetidos à avaliação do neuroenfogo não devem ser utilizados para qualquer outra métrica quantitativa (biomarcador de soro, IHC, etc.). Também é importante entender que esse método de aprendizagem é baseado em um estímulo visual e não é adequado para danos que possam comprometer circuitos visuais, pois confundirá os resultados.
Nossos resultados demonstram que, após tbi de força bruta, os zebrafish exibem um rápido déficit cognitivo que resulta em testes aumentados para dominar uma tarefa associativa no ensaio da caixa de transporte. Déficits imediatos semelhantes são vistos em modelos de roedores de TCE, porém esses déficits podem diminuir, muitas vezes persistem e permanecem significativos30. Em contraste, os zebrafish apresentam recuperação cognitiva dentro de 7 dias após a lesão. A capacidade regenerativa do zebrafish adulto está bem documentada9,10,11,12,13,14,15, com nichos neurogênicos conhecidos nas zonas ventriculares/subventriculares do telencephalon31,32. A recuperação cognitiva observada em nosso ensaio após o TBI fornece uma visão dos exames necessários para identificar se esses nichos neurogênicos são estimulados e desempenham um papel na recuperação tecidual e cognitiva.
Em conclusão, a caixa de transporte fornece uma rápida avaliação da cognição em relação ao aprendizado associativo e memória. O ensaio utiliza equipamentos mínimos e conventuais e é tecnicamente simples. Aplicações futuras poderiam ser utilizadas para avaliar intervenções genéticas e farmacológicas a peixes neurologicamente insultados em relação à neuroproteção, bem como outros paradigmas de lesões ou modelos neurodegenerativos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer aos membros do laboratório Hyde por suas discussões pensativas e aos técnicos do Centro freimann de ciências da vida para cuidados e criação de zebrafish. Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Pesquisa de Zebrafish da Universidade de Notre Dame, pelo Centro de Células-Tronco e Medicina Regenerativa da Universidade de Notre Dame, e bolsas do National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinelas da Sociedade da Liberdade (JTH) e a Bolsa Pat Tillman (JTH). Figura 1 feita com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
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