Summary
Læring og hukommelse er potente beregninger ved studier av enten utviklingsmessige, sykdomsavhengige eller miljøinduserte kognitive svekkelser. De fleste kognitive vurderinger krever spesialisert utstyr og omfattende tidsforpliktelser. Shuttle box-analysen er imidlertid et assosiativt læringsverktøy som bruker en konvensjonell gelboks for rask og pålitelig vurdering av voksen sebrafiskkognisjon.
Abstract
Kognitive underskudd, inkludert nedsatt læring og hukommelse, er et primært symptom på ulike utviklings- og aldersrelaterte nevrodegenerative sykdommer og traumatisk hjerneskade (TBI). Sebrafisk er en viktig nevrovitenskapsmodell på grunn av deres åpenhet under utvikling og robuste regenerative evner etter neurotrauma. Mens ulike kognitive tester eksisterer i sebrafisk, undersøker de fleste kognitive vurderinger som er raske ikke-assosiativ læring. Samtidig krever assosiative læringsanalyser ofte flere dager eller uker. Her beskriver vi en rask assosiativ læringstest som benytter en negativ stimulans (elektrisk støt) og krever minimal forberedelsestid. Shuttle box-analysen, presentert her, er enkel, ideell for nybegynnere etterforskere, og krever minimalt utstyr. Vi viser at denne shuttle box-testen, etter TBI, reproduserer kognitivt underskudd og utvinning fra ung til gammel sebrafisk. I tillegg kan analysen tilpasses for å undersøke enten umiddelbar eller forsinket minne. Vi viser at både en enkelt TBI og gjentatte TBI-hendelser påvirker læring og umiddelbar hukommelse negativt, men ikke forsinket minne. Vi konkluderer derfor med at shuttle box-analysen reproduserer progresjonen og utvinningen av kognitiv svikt.
Introduction
Læring og hukommelse brukes rutinemessig som beregninger av kognitiv svikt, noe som skjer på grunn av aldring, nevrodegenerativ sykdom eller skade. Traumatiske hjerneskader (TBIer) er den vanligste skaden som resulterer i kognitive underskudd. TBIer er av økende bekymring på grunn av deres tilknytning til flere nevrodegenerative lidelser, som frontotemporal demens og Parkinsons sykdom1,2. I tillegg tyder de økte beta-amyloid aggregasjonene som observeres hos noen TBI-pasienter, at det også kan være forbundet med utviklingen av Alzheimers sykdom3,4. TBIer er ofte et resultat av stump kraft traumer og spenner over en rekkealvorlighetsgrader 5, med milde hjerneskader (miTBI) som den vanligste. Imidlertid blir miTBIer ofte urapportert og feildiagnostisert fordi de resulterer i mindre kognitive svekkelser i bare en kort periode, og de skadede individer gjenoppretter vanligvis fullt6. I motsetning til dette har gjentatte miTBI-hendelser vært en økende bekymring fordi det er svært utbredt hos unge og middelaldrende voksne, kan akkumuleres over tid7, kan svekke kognitiv utvikling og forverre nevrodegenerative sykdommer1,2,3,4,5, som ligner på personer som opplever enten en moderat eller alvorlig TBI8.
Sebrafish (Danio rerio) er en nyttig modell for å utforske en rekke emner innen nevrovitenskap, inkludert evnen til å regenerere tapte eller skadede nevroner i sentralnervesystemet9,10,11,12,13. Nevral regenerering ble også demonstrert i telencephalon, som inneholder arkipallium i dorsal-indre regionen. Denne nevroanatomiske regionen er analog med hippocampus og er sannsynligvis nødvendig for kognisjon i fisk og for korttidsminnet hos mennesker14,15,16. Videre har sebrafiskadferd blitt omfattende karakterisert og katalogisert17. Læring har blitt studert gjennom ulike teknikker, inkludert habituation til startle response18, som kan representere en rask form for ikke-assosiativ læring når den utføres i korte blokker og med oppmerksomhet på den raske forfallstiden19. Mer komplekse tester av assosiativ læring, for eksempel T-bokser, pluss-labyrinter og visuell diskriminering20,21 brukes,men er ofte tidkrevende, krever dager eller uker med forberedelse, og er avhengige av shoaling eller positiv forsterkning. Her beskriver vi et raskt paradigme for å vurdere både assosiativ læring og enten umiddelbar eller forsinket hukommelse. Denne shuttle box-analysen bruker en aversiv stimulans og negativ forsterkningskondisjonering for å vurdere kognitive underskudd og utvinning etter stump kraft TBI. Vi viser at uskadet kontroll voksen sebrafisk (8-24 måneder) reprodusere lære å unngå rødt lys innen 20 studier (<20 min vurdering) i shuttle boksen, med en høy grad av konsistens på tvers av observatører. I tillegg viser vi at læring og hukommelsesevner på tvers av voksne (8-24 måneder) er konsistente og er nyttige for å analyse av kognisjon med betydelige funksjonshemninger mellom enten forskjellige TBI-alvorlighetsgrader eller gjentatt TBI. Videre kan denne metoden raskt brukes som en beregning for å spore et bredt spekter av sykdomsprogresjoner eller effekt av legemiddelintervensjoner som påvirker vedlikehold eller gjenoppretting av kognisjon hos voksne sebrafisk.
Her gir vi en instruksjonsoversikt over en rask kognitiv vurdering som kan undersøke både kompleks assosiativ læring (avsnitt 1) og hukommelse når det gjelder både umiddelbar og forsinket hukommelse. Dette paradigmet gir en vurdering av kort og langsiktig hukommelse av en lært assosiativ kognitiv oppgave (avsnitt 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafisk ble oppdratt og vedlikeholdt i Notre Dame Zebrafish-anlegget i Freimann Life Sciences Center. Metodene beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av University of Notre Dame Animal Care and Use Committee (Animal Welfare Assurance Number A3093-01).
1. Shuttle box læringsparadigme (Figur 1A)
MERK: Læringsparadigmet gir en rask vurdering av kognisjon angående assosiativ læring.
- Forbered shuttle-boksen ved å endre en plexiglass på 30,5 x 19 x 7,5 cm med et 5 x 19 cm stykke akvariumkvalitet plexiglass lagt til hver side i en 45 ° vinkel. Lag en linje som markerer tankens halvveis for å vurdere når fisken har krysset midten av tanken (Figur 1B).
- Tilsett 800 ml systemvann i skyttelkassen. Lag dette vannet ved å oppløse 60 mg Instant Ocean i 1 L deionisert RO-vann. Fyll vannet til midten av tanken til en dybde på 5 cm.
MERK: Skift ut med ferskvann ved 28 °C hver time eller etter testing av 3 fisk. - Plasser 2-3 fisk i en lagertank som inneholder systemvann, plassert i et mørkt rom hvor shuttle box-analysen skal utføres.
- I det mørke rommet plasserer du 1 fisk i midten av skyttelkassen, fester lokket og fester elektrodene til en strømforsyning.
MERK: Rommet skal forbli så mørkt som mulig under akklimatisering og testing.
- I det mørke rommet plasserer du 1 fisk i midten av skyttelkassen, fester lokket og fester elektrodene til en strømforsyning.
- Akklimatisere fisken i skyttelkassen i 15 min.
MERK: Etterforskeren bør forbli i rommet i akklimatiseringsperioden eller gå tilbake til testrommet stille med god tid før testingen for å la fisken tilpasse seg undersøkerens tilstedeværelse. Vellykket akklimatisering kan vurderes når fisken fritt utforsker tanken.- Hvis fisken ikke klarer å utforske, fortsett akklimatisering i ytterligere 15 min. Hvis fisken fortsatt ikke klarer å akklimatisere seg til skyttelkassen, fjern fisken. Ikke bruk denne fisken til testing.
- Skinn manuelt en 800-lumen rød linse lommelykt ~ 2 cm fra gelboksveggen på siden okkupert av fisken, etter akklimatisering.
MERK: Ikke start en prøve hvis fisken hviler ved siden av platinatråden mot veggen nær de dype endene av romfergekassen. - Skinn lys stimulansen direkte på fisken og følg manuelt enhver lateral bevegelse av fisken med lyset for å sikre kontinuerlig visualisering av stimulansen (Figur 1C). Fortsett å gi lys stimulansen til en av følgende betingelser er oppfylt.
- Tenk på stien vellykket hvis fisken krysser over halvveis i tanken innen 15 s lyseksponering. Når fisken krysser halvveis, må du stoppe lys stimulansen umiddelbart (Figur 1D).
- Se på stien som mislykket hvis fisken ikke krysser halvveis i boksen i 15 s. I dette tilfellet, bruk en elektroforese strømforsyning for å bruke en negativ støt stimulus (20 mV: 1 A) vekslende 2 s på, 2 s av av i en 15 s periode (maksimalt 4 støt), eller til fisken passerer halvveis i boksen, og da avslutte både lys og negativ stimulans.
- La fisken hvile i 30 s og gjenta trinn (er) 1,5-1,6,2. Føre en detaljert oversikt over rekkefølgen på vellykkede forsøk (1.6.1) og mislykkede forsøk (1.6.2).
MERK: Her definerte vi læring som fullføring av 5 påfølgende vellykkede forsøk. Når læringen er demonstrert, bør fisken fjernes fra skyttelkassen og humant avlives.
2. Minneparadigme (Figur 1A)
MERK: Dette paradigmet gir en vurdering av kort og langsiktig minne om en lært assosiativ kognitiv oppgave.
- Opplæringsperiode
- Tilsett 800 ml systemvann i skyttelkassen. Lag dette vannet ved å oppløse 60 mg Instant Ocean i 1 L deionisert RO-vann. Fyll vannet til midten av tanken til en dybde på 5 cm.
MERK: Vann bør skiftes ut med ferskvann ved 28 °C hver time eller etter testing av 3 fisk. - Plasser 2-3 fisk i en lagertank som inneholder systemvann, plassert i et mørkt rom hvor shuttle box-analysen skal utføres.
- I det mørke rommet plasserer du 1 fisk i midten av skyttelkassen, fester lokket og fester elektrodene til en strømforsyning.
MERK: Rommet skal forbli så mørkt som mulig under akklimatisering og testing. - Akklimatisere fisk i skyttelkassen i 15 min.
MERK: Etterforskeren bør forbli i rommet i akklimatiseringsperioden eller gå stille tilbake til testrommet med god tid før testing for å la fisken tilpasse seg undersøkerens tilstedeværelse. Bestem vellykket akklimatisering når fisken fritt utforsker tanken. - Hvis fisken ikke klarer å utforske, fortsett akklimatisering i ytterligere 15 min. Hvis fisken fortsatt ikke klarer å akklimatisere seg til skyttelkassen, fjern fisken og ikke bruk den til testing.
- Etter vellykket akklimatisering skinner manuelt en 800-lumen rød linse lommelykt ~ 2 cm fra gelboksveggen, på siden av shuttle-boksen som er okkupert av fisken.
- Skinn lys stimulansen direkte på fisken og følg enhver lateral bevegelse av fisken med lyset for å sikre kontinuerlig visualisering av fiskens stimulans.
- Mens lyset skinner på fisken, påfør samtidig den ugunstige støtremulansen (20 mV: 1 A) vekslende 2 s På, 2 s Av i 15 s (maksimalt 4 støt), eller til fisken passerer halvveis i esken. Når dette er oppnådd, avslutt både lyset og den negative stimulansen.
MERK: La fisken hvile i 30 s og gjenta deretter trinn 2.1.6-2.1.8 for 25 gjentakelser (Figur 1A).
- Tilsett 800 ml systemvann i skyttelkassen. Lag dette vannet ved å oppløse 60 mg Instant Ocean i 1 L deionisert RO-vann. Fyll vannet til midten av tanken til en dybde på 5 cm.
- Første testing
- Tillat 15 min hvile til fisken etter treningsperioden. Ikke fjern dem fra romfergekassen. Test den første minneoppbevaringen ved å registrere hver prøveversjon som strengt bestått/mislykket, umiddelbart etter denne hvileperioden.
- Påfør bare lys stimulansen i opptil 15 s og registrer svarene som følger.
- Tenk på studien vellykket hvis fisken krysser over halvveis i skyttelkassen innen 15 s etter å ha startet lys stimulansen. Stopp lys stimulansen umiddelbart når fisken krysser halvveis.
- Se på studien som mislykket hvis fisken ikke krysser over halvveis i skyttelkassen 15 s etter å ha startet lys stimulansen. Stopp lys stimulansen etter 15 s.
MERK: Under den første testingen påføres ikke en negativ stimulus etter et mislykket forsøk.
- Gjenta trinn 2.2.2, med en hvileperiode på 30 sekunder mellom forsøk, og registrer vellykkede forsøk (2.2.2.1) og mislykkede forsøk (2.2.2.2) i 25 forsøk. Denne verdien vil fungere som en individuell referanse for hver fisk.
- Øyeblikkelig minne
- Induser skade umiddelbart etter den første testperioden ved foretrukket skadeparadigme (f.eks. et stump krafttraume ved hjelp av det modifiserte Marmarou-vektfallet). Husfisk individuelt for en enkel identifikasjon. Registrer de første testverdiene og returner fisk til dyreanlegget.
MERK: Fisk ble skadet av stump kraft TBI som tidligere beskrevet22. - Samle 2-3 uskadet eller TBI fisk 4 t etter første testing og/eller 4 t etterskade (eller på den aktuelle eksperimentelle tidsrammen) fra dyreanlegget. Hold all fisk i det mørke rommet i individuelle tanker som inneholder systemvann.
- Plasser fisk i midten av skyttelkassen (tilberedt med systemvann som beskrevet i 1,1), en fisk om gangen, og fest lokket. Fest strømforsyningen og la fisken akklimatisere seg i 15 min.
- Etter akklimatisering, vurder øyeblikkelig minne (strengt bestått / mislykket) ved å bruke bare lys stimulans for opptil 15 s og registrere svarene som følger.
- Vurder studien vellykket hvis fisken krysser over halvveis i boksen innen 15-s testperioden. Avslutt lys stimulansen ved å krysse halvveis.
- Se på studien som mislykket hvis fisken ikke krysser over halvveis i boksen innen 15 s etter å ha startet lys stimulansen. Avslutt lys stimulansen etter 15 s periode er over.
MERK: Under denne testingen etter skaden påføres ikke negativ støtdemping etter et mislykket forsøk.
- Gjenta trinn 2.3.4, med en hvileperiode på 30 mellom forsøk, og registrer antall vellykkede forsøk (2.3.4.1) og mislykkede forsøk (2.3.4.2) i 25 forsøk.
- Beregn prosentforskjellen i vellykkede forsøk etter skade på den første testperioden ved hjelp av ligningen:
- Induser skade umiddelbart etter den første testperioden ved foretrukket skadeparadigme (f.eks. et stump krafttraume ved hjelp av det modifiserte Marmarou-vektfallet). Husfisk individuelt for en enkel identifikasjon. Registrer de første testverdiene og returner fisk til dyreanlegget.
- Forsinket minne
- Returner fisk, plassert individuelt for enkel identifisering og registrering av deres opprinnelige testverdier, til dyreanlegget umiddelbart etter den første testperioden.
- Tillat fisk 4 dager (eller den aktuelle eksperimentelle tidsrammen) mellom den første testingen og skade og/eller forsinket minnetesting.
- Induser skade av det foretrukne skadeparadigmet (for eksempel det modifiserte Marmarou-vektfallet for å indusere et stump krafttraume). Husfisk individuelt for enkel identifisering av innledende testverdier, og returner fisk til dyreanlegget.
MERK: Fisk ble skadet av stump kraft TBI som tidligere beskrevet22. - Samle 2-3 uskadet eller TBI fisk 4 t etter første testing og/eller 4 t etterskade (eller på den aktuelle eksperimentelle tidsrammen) fra dyreanlegget.
- Hold all fisk i det mørke rommet i individuelle tanker som inneholder systemvann, og plasser en om gangen i midten av skyttelkassen (tilberedt med systemvann som beskrevet i 1.1), fest lokket, fest strømforsyningen og la fisk 15 min akklimatisere seg.
- Etter akklimatisering, vurder øyeblikkelig minne (strengt bestått / mislykket) ved å bruke bare lys stimulans for opptil 15 s og registrere følgende svar:
- Tenk på stien vellykket hvis fisken krysser over halvveis i boksen innen 15-s testperioden. Avslutt lys stimulansen ved å krysse halvveis.
- Se på stien som mislykket hvis fisken ikke krysser over halvveis i boksen innen 15 s etter å ha startet lysstimulansen, avslutt lysstimulansen.
MERK: Under denne testingen etter skaden påføres ikke en negativ støtdemping etter et mislykket forsøk.
- Gjenta trinn 2.4.6, med en hvileperiode på 30 mellom forsøk, og registrer antall vellykkede forsøk (2.4.6.1) og mislykkede forsøk (2.4.6.2) i 25 forsøk.
- Beregn prosentforskjellen i vellykkede studier av etterskade til den første testperioden med ligningen:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Læringsparadigmet, skissert i protokollen og skjematisk (figur 1), gir en rask vurdering av kognisjon med hensyn til assosiativ læring. I tillegg har dette paradigmet et høyt nivå av strenghet, ved å definere læring som en gjentatt og konsekvent visning av 5 påfølgende positive studier. Dette paradigmet gjelder også for en rekke aldre og skader. Uskadet fisk ved 8 måneder (ung voksen), 18 måneder (middelaldrende voksen) og 24 måneder (eldre voksen) krevde et lignende antall forsøk for å lære oppførselen til å unngå det røde lyset (Uskadet 8 m: 15,28 ± 4,92 studier, 18 m: 17,66 ± 5,5 forsøk, 24 m: 16,2 ± 4,79 forsøk, 8 m mot 18 m p=0,92, 8 m mot 24 m p=0,98, 18 m i forhold til 24 m p=0,97, figur 2A). Vi brukte også en alvorlig stump-force traumatisk hjerneskade (sTBI) modell22 og observerte at fisk i forskjellige aldre krevde lignende antall studier for å mestre analysen over 1-5 dager etter skade (dpi; 8 m mot 18 m, p=0,09, 8 m mot 24 m, p=0,96, 18 m vs. 24 m, p=0,12, figur 2A). På dag 1 etter sTBI krevde fisk i alle aldre (8, 18 og 24 m) et lignende antall forsøk for å lære atferden (8 m: 73,3 ± 9,45 studier, 18 m: 79,33 ± 6,35 forsøk, 24 m: 68,25 ± 6,65 forsøk, 8 m mot 18 m p=0,71, 8 m mot 24 m p=0,76, 18 m vs. 24 m p=0,28, Figur 2A) og de var alle betydelig større enn de uskadede kontrollene (s<0,01). Samlet viser disse dataene at shuttle-boksen kan brukes til å undersøke skadeinduserte kognitive underskudd på tvers av aldersgrupper og antyde at voksen sebrafisk kan gjenopprette kognitivt etter stump kraftskade.
Fordi gjentatte miTBI-hendelser i økende grad kan svekke kognitiv funksjon, brukte vi shuttle box-analysen som en beregning for å spore doseavhengig progresjon ved hjelp av repeterende TBI. Vi brukte denne analysen til å vurdere læring etter en miTBI stump kraftskade22 som gjentas daglig i de forskjellige tidsperiodene. Som tidligere observert mestret uskadet fisk raskt shuttle-boksen og oppnådde 5 påfølgende positive studier i 16,4 ± 3,5 studier (figur 2B). En dag etter en enkelt miTBI viser fisk en betydelig økning i antall forsøk for å lære atferden (40,25 ± 12,65 studier, p<0,05, figur 2B). Dette underskuddet økte etter 2 miTBI-hendelser (48 ± 14,9 studier) og ble ytterligere forhøyet etter 3 miTBI-skader (56,63 ± 12,75 studier, figur 2B). I tillegg observerte vi en betydelig økning i kognitiv svikt mellom miTBI fisk som fikk en singulær skade og 3 skader (p<0,05).
Vi undersøkte også hvordan minnet ble påvirket etter gjentatte miTBI-hendelser ved hjelp av protokollen for umiddelbare og forsinkede minneparadigmer (figur 1A). Naiv uskadet fisk fikk en treningsperiode og en innledende testperiode, hvoretter en del fisk ble skadet for umiddelbar hukommelse og andre ble returnert til fiskeanlegget i 4 dager for å få tilgang til forsinket minne (Figur 2C). Uskadet fisk viser en liten økning i prosentforskjellen av vellykkede studier i både umiddelbar hukommelse (6,22% ± 4,7%) og forsinket minne (6,13% ± 5,57%) i forhold til den første testperioden. Vi undersøkte deretter effekten av flere stumpe TBI-hendelser hadde på hukommelsen. Betydelige underskudd ble observert etter miTBI i umiddelbar hukommelse, men ikke i forsinket minne. Etter en enkelt miTBI viste fisk betydelige umiddelbare hukommelsesunderskudd (-26,77 % ± 8,93 %) sammenlignet med uskadet fisk (p<0,0001, figur 2C). Denne trenden fortsatte med gjentatte skader med økende underskudd etter både 2x miTBI (-37,42% ± 10,01%) og 3x miTBI (-39,71% ± 11,39%). Videre observerte vi en lignende doseeffekt mellom fisk behandlet med en enkelt (1x) miTBI og 3x miTBI (p<0,05, figur 2C). Disse dataene tyder på at læring og hukommelse reduseres i miTBI-fisk med det økende antallet skader, noe som øker underskuddet betydelig og shuttle box-analysen og protokollene beskrevet ovenfor er følsomme nok til å oppdage disse forskjellene.
Figur 1: Shuttle Box-analysen. (A) Instruksjonsoversikt over lærings- og hukommelsesparadigmer for kognitiv vurdering. (B) Skjematisk for en konvertert stor DNA gel boks for shuttle boksen analysen. (C,D) Grafisk fremstilling av stimuli-søknad under forsøk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Sebrafisk viser kognitive underskudd etter stump kraft TBI. (A) Etter sTBI viser sebrafisk ved 8, 18 og 24 måneders alder læringsunderskudd som ikke er signifikant forskjellige mellom aldersgrupper. Betydelige økninger i antall forsøk for å lære shuttle box paradigmet sammenlignet med alderstilpassede kontroller ble observert ved 1 dpi tilbake til uskadede nivåer med 4-5 dpi. (B,C) Gjentatt miTBI fisk viste både læring (B) og minne (C) underskudd på en doseavhengig måte. Gjennomsnittet ± SEM tegnes inn i A og B, mens gjennomsnittet ± standardavviket tegnes inn i C. Hvert datapunkt på alle tre grafene representerer en enkelt voksen sebrafisk. Statistiske analyser ble utført med enten en One-Way eller Two-Way ANOVA etterfulgt av en Tukey post-hoc-test. # p<0,05, ## p<0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kognitiv svikt kan betydelig og negativt påvirke livskvaliteten. På grunn av økt synlighet og forekomst av hjernerystelser og traumatiske hjerneskader i hele befolkningen, er det viktig å forstå hvordan de forårsaker kognitiv svikt og hvordan skaden kan minimeres eller reverseres. Av disse grunnene spiller modellorganismer som kan testes for kognitiv nedgang en kritisk rolle i disse studiene. Gnagere har lenge vært den primære modellen for å undersøke nevrobehavior og kognisjon, men sebrafisk har dukket opp som en nyttig modell med mange forskjellige atferd for å undersøke en rekke utviklingsmessige, aldersrelaterte og oppkjøpte kognitive underskudd17,20,23,24,25,26. Ulike metoder for å vurdere kognisjon har blitt brukt fra endimensjonal læring i form av habituation, til kompleks læring og romlig minne, nytt objekt og stedsgjenkjenning, og beslutningstaking18,19,20,21,27,28. Imidlertid er disse kognitive testene begrenset til å teste ikke-assosiativ kognisjon eller kreve et komplekst oppsett, økonomisk investering i utstyr eller en omfattende tidsforpliktelse før tester kan utføres. I motsetning til dette bruker shuttle-boksen og lærings- og minneparadigmene som er beskrevet her, en kompleks assosiativ læringsanalyse som er kostnadseffektiv, en raskt vurdert og lett ansatt av en nybegynner. Viktigst, i samsvar med de andre kognitive testene, viser vår analyse at uskadet fisk raskt lærer den assosiative oppgaven og kan minne oppgaven dager senere uten periodisk trening29.
Analysens tilpasningsevne gir muligheter til å undersøke ulike tidspunkter for læring og hukommelse som en beregning av sykdomsprogresjon eller mekanistiske intervensjoner. Det er to hovedtrekk ved analysen. For det første er metoden enkel. Analysen er raskt satt opp og har klare og tydelige sluttpunkter med hensyn til vellykkede og mislykkede forsøk, noe som gjør den tilgjengelig for en rekke etterforskere. Vi fant ut at på grunn av enkelheten i denne analysen, er det svært lite feilsøking som trengs for å bruke shuttle-boksen med hell. For det andre er analysen ekstremt rask i forhold til andre kognitive eksamener, noe som gir fleksibilitet eller evnen til å undersøke et stort antall fisk raskt på en enkelt dag. Tiden for å vurdere læring er minst 19,75 min (figur 1), med fisken som krever 15 minutter for å akklimatisere seg til skyttelkassen (bestemt av tankutforskning), etterfulgt av en enkelt mislykket studie (15 s lys stimulans, 15 s aversjon stimulans, 30 s mellom forsøk) og 5 umiddelbare og påfølgende positive studier (<15 lys stimulans). I praksis observerte vi at uskadet fisk krever 6-30 studier (19,75 min-43,75 min), mens i ekstreme tilfeller (etter et alvorlig stump-force traumer), kan de mest alvorlige underskuddene kreve 100 studier (113,75 min). Hukommelsesstudier utføres også raskt. Etter protokolldisposisjonen er minimumstiden som er nødvendig for akklimatisering, trening og første testing 67,5 min (15 min akklimatisering, 25 gjentakelser av lys og støt i 15 s, 30 s hvile mellom forsøk og gjenta for første testing uten de negative stimuliene). Under retesting enten umiddelbar eller forsinket minne krever bare 33.75 min (15 min akklimatisering, 25 iterasjoner av bare lys stimulus for 15 s, og 30 s hvile mellom studier), uavhengig av skade, behandling eller kognitivt underskudd.
Ved vurdering av nevrobehavior bruker ulike paradigmer enten positive eller negative stimuli. Positive stimuli i form av mat eller sosial interaksjon, ofte brukt i klassiske T-boks labyrinter, kan hjelpe i en sterk respons av en lært oppgave. Analyser som bruker positiv tilknytning, gjør det imidlertid på bekostning av tid. I motsetning, mens kondisjonering som svar på en negativ stimulans gir en rask assosiasjon og sterk atferdsrespons, er det på bekostning av den negative stimulansen. Uskadet fisk lærer ofte shuttle box-analysen raskt og blir derfor utsatt for et minimalt antall støt, og som et resultat ser det ut til å ikke ha noen uønskede hendelser. Imidlertid krever nevrologisk kompromittert fisk (TBI), med alvorlige kognitive underskudd, et betydelig antall studier og elektriske støt. Disse flere sjokkene har blitt observert for å av og til resultere i tonisk-kloniske anfall. Enhver fisk som opplever et tonisk-klonisk anfall mens de er i romfergekassen, bør umiddelbart fjernes og etisk avlives. Alle studier for den euthanized fisken, opp til og inkludert beslaghendelsen, bør utelukkes i enhver statistisk analyse. Videre er det verdt å merke seg at elektrisk støt på et nevrologisk skadet emne kan pålegge utilsiktede forskjeller mellom skadet fisk som er og ikke er et resultat av skyttelkassen. Av den grunn foreslår vi at all fisk som utsettes for nevrobehavior vurdering ikke skal brukes til noen annen kvantitativ metrikk (serumbiomarkør, IHC, etc.). Det er også viktig å forstå at denne læringsmetoden er basert på en visuell stimulans og ikke er egnet for skade som kan kompromittere visuelle kretser, da det vil forvirre resultatene.
Våre resultater viser at etter stump kraft TBI viser sebrafisk et raskt kognitivt underskudd som resulterer i økte studier for å mestre en assosiativ oppgave i shuttle box-analysen. Lignende umiddelbare underskudd ses i gnagermodeller av TBI, men disse underskuddene kan avta, de vedvarer ofte og forblir betydelige30. Sebrafisk viser derimot kognitiv utvinning innen 7 dager etter skade. Den regenerative kapasiteten til den voksne sebrafisken er godt dokumentert9,10,11,12,13,14,15, med kjente nevrogene nisjer i ventrikulære / subventrikulære soner i telencephalon31,32. Den kognitive utvinningen som observeres i vår analyse etter TBI gir innsikt i nødvendige eksamener for å identifisere om disse nevrogene nisjene stimuleres og spiller en rolle i vev og kognitiv utvinning.
Til slutt gir shuttle-boksen en rask vurdering av kognisjon med hensyn til assosiativ læring og hukommelse. Analysen benytter minimalt og klosterlig utstyr og er teknisk enkelt. Fremtidige anvendelser kan brukes til å vurdere genetiske og farmakologiske intervensjoner på nevrologisk fornærmet fisk med hensyn til nevrobeskyttelse samt andre skadeparadigmer eller nevrodegenerative modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Hyde lab-medlemmene for deres gjennomtenkte diskusjoner og Freimann Life Sciences Center-teknikere for sebrafiskpleie og husdyrhold. Dette arbeidet ble støttet av Center for Zebrafish Research ved University of Notre Dame, Center for Stem Cells and Regenerative Medicine ved University of Notre Dame, og tilskudd fra National Eye Institute of NIH R01-EY018417 (DRH), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship of Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) og Pat Tillman Scholarship (JTH). Figur 1 laget med BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flashlight | Ultrafire | 9145 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Large DNA Gel Box | Fisher Scientific | FB-SB-1316 | Shuttle Box |
| Power Supply | Fisher Scientific | FB-105 |
References
- Deutsch, M., Mendez, M., Teng, E. Interactions between traumatic brain injury and frontotemporal degeneration. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders. 39, 143-153 (2015).
- Gardner, R., et al. Traumatic brain injury in later life increases risk for Parkinson disease. Annals in Neurology. 77, 987 (2015).
- Fleminger, S., Oliver, D., Lovestone, S., Rabe-Hesketh, S., Giora, A. Head injury as a risk factor for Alzheimer's disease: the evidence 10 years on; a partial replication. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry. 74, 857-886 (2003).
- Johnson, V., Stewart, W., Smith, D. Traumatic brain injury and amyloid-β pathology: a link to Alzheimer's disease. Nature Reviews Neurosciences. 11, 361-370 (2010).
- Korley, F. K., Kelen, G. D., Jones, C. M., Diaz-Arrastia, R. Emergency department evaluation of traumatic brain injury in the United States, 2009-2010. The Journal of Head Trauma Rehabilitation. 31, 379-387 (2016).
- Corrigan, J. D., Selassie, A. W., Orman, J. A. L.
- Levin, H., Arrastia, R. Diagnosis, prognosis, and clinical management of mild traumatic brain injury. The Lancet Neurology. 14, 506-517 (2015).
- GBD 2016 Traumatic Brain Injury and Spinal Cord Injury Collaborators. Global, regional, and national burden of traumatic brain injury and spinal cord injury, 1990-2016: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet, Neurology. 18 (1), 56-87 (2019).
- Campbell, L. J., et al. Notch3 and DeltaB maintain Müller glia quiescence and act as negative regulators of regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Glia. 69 (3), 546-566 (2021).
- Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. Microglia exit the CNS in spinal root avulsion. PLoS Biology. 17 (2), 3000159 (2019).
- Hentig, J., Byrd-Jacobs, C. Exposure to zinc sulfate results in differential effects on olfactory sensory neuron subtypes in the adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 17 (9), 1445 (2016).
- Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Oshima, T. Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum. Developmental Biology. 342, 26-38 (2010).
- Lahne, M., Nagashima, M., Hyde, D. R., Hitchcock, P. F. Reprogramming Muller glia to regenerate retinal neurons. Annual Reviews of Vision Sciences. 6, 171-193 (2020).
- Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), Cambridge, England. 4831-4841 (2011).
- Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Disease Models & Mechanisms. 5 (2), 200-209 (2012).
- Bhattarai, P., et al. Neuron-glia interaction through Serotonin-BDNF-NGFR axis enables regenerative neurogenesis in Alzheimer's model of adult zebrafish brain. PLoS Biology. 18 (1), 3000585 (2020).
- Kalueff, A., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Chanin, S., et al. Assessing startle responses and their habituation in adult zebrafish. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Humana Press. (2012).
- López-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 54, 134-139 (2019).
- Maheras, A. L., et al. Genetic pathways of neuroregeneration in a novel mild traumatic brain injury model in adult zebrafish. eNeuro. 5 (1), (2018).
- Gaspary, K. V., Reolon, G. K., Gusso, D., Bonan, C. D. Novel object recognition and object location tasks in zebrafish: Influence of habituation and NMDA receptor antagonism. Neurobiology of Learning and Memory. 155, 249-260 (2018).
- Hentig, J., Cloghessy, K., Dunseath, C., Hyde, D. R. A scalable model to study the effects of blunt-force injury in adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2021).
- Wu, Y. J., et al. Fragile X mental retardation-1 knockout zebrafish shows precocious development in social behavior. Zebrafish. 14 (5), 438-443 (2017).
- Rea, V., Van Raay, T. J. Using zebrafish to model autism spectrum disorder: A Comparison of ASD risk genes between zebrafish and their mammalian counterparts. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 575575 (2020).
- Zhdanova, I. V., et al. Aging of the circadian system in zebrafish and the effects of melatonin on sleep and cognitive performance. Brain Research Bulletin. 75 (2-4), 433-441 (2008).
- Yu, L., Tucci, V., Kishi, S., Zhdanova, I. V.
- Bahl, A., Engert, F. Neural circuits for evidence accumulation and decision making in larval zebrafish. Nature Neuroscience. 23 (1), 94-102 (2020).
- Ngoc Hieu, B. T., et al. Development of a modified three-day t-maze protocol for evaluating learning and memory capacity of adult zebrafish. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1464 (2020).
- Williams, F. E., White, D., Messer, W. S. A simple spatial alternation task for assessing memory function in zebrafish. Behavioural Processes. 58 (3), 125-132 (2002).
- Zohar, O., et al. Closed-head minimal traumatic brain injury produces long-term cognitive deficits in mice. Neuroscience. 118 (4), 949-955 (2003).
- Becker, C., Becker, T. Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration. Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).
- Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration, and cell fate. Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).
