Summary
オープンソースのロボット液体処理システムを操作して、半自動タンパク質サンプル調製を行い、洗剤の除去、タンパク質消化、ペプチド脱塩のステップをカバーするための詳細なプロトコルと3つのPythonスクリプトが提供されています。
Abstract
質量分析ベースの散弾銃プロテオミクス実験では、酵素タンパク質消化やクリーンアップなど、複数のサンプル調製ステップが必要であり、ベンチ労働の時間を要し、バッチ間の変動の原因を提示することができます。ピペットロボットによるラボの自動化により、手作業を削減し、スループットを最大化し、研究の再現性を向上させることができます。それでも、標準的なオートメーションステーションの急激な開始価格は、多くの学術研究所にとって手頃な価格ではありません。この記事では、半自動タンパク質還元、アルキル化、消化、およびクリーンアップ手順を設定するための指示を含む、手頃な価格のオープンソースオートメーションシステム(Opentrons OT-2)を使用したプロテオミクスサンプル調製ワークフローについて説明します。OT-2システムをアプリケーションプログラミングインタフェースでプログラミングするためのオープンソースのPythonスクリプトを伴います。
Introduction
質量分析ベースの散弾銃プロテオミクスは、生物学的サンプル中の多くのタンパク質の存在量を同時に測定する強力なツールです。バイオインフォマティクス解析を用いたプロテオミクス実験は、バイオマーカーを同定し、病理学的メカニズムを支える関連する生物学的複合体および経路を発見するために日常的に使用されています。高い分析物特異性と潜在的な定量精度により、ショットガンプロテオミクスは、抗体に頼ることなく臨床サンプル分析のための研究施設や診断ラボで採用される優れた可能性を秘めています1,2。
ショットガンプロテオミクス分析用のタンパク質サンプルを調製するには、通常、生体サンプルから抽出したタンパク質(細胞や組織)は、サンプルタンパク質濃度の測定、タンパク質還元、アルキル化、ペプチドへの酵素消化など、長いプロトコルを使用して処理する必要があります。さらに、洗剤を含む一般的な溶解バッファーで抽出されたタンパク質は、多くの場合、分析の前にバッファー交換または洗剤除去の追加のステップを必要とするため、洗剤はトリプシン消化を妨げ、下流の液体クロマトグラフィータンデム質量分析(LC-MS/MS)分析の性能を著しく低下させる可能性があります3.ペプチドは、典型的には、さらに脱塩、乾燥、および酵素消化に続くLC-MS/MS適合溶媒で再構成される。これらのタンパク質の生化学手順は、労働集約的で時間がかかる場合があります。したがって、彼らはプロテオミクスワークフローのスループットを制限し続け、取得したデータ4,5の変動に貢献します。人為的ミスとバイアスは、データの分散と再現性に影響を与える重要な要因として認識されてきました 6,7.質量分析サンプル調製ワークフローにおける人為的ミスを最小限に抑えるために、自動ピペットロボットシステムは、ショットガンプロテオミクスおよび標的質量分析によるタンパク質同定と定量のスループットと再現性を向上させるために利用され、そのような進歩は重要な研究および臨床現場でのプロテオミクス技術の普及を続けるためのインストゥルメンタルとして賞賛されている8 9,10,11,12,13.しかし、ほとんどの既存のプロトコルは、多額の投資とトレーニングを必要とするロボット液体処理プラットフォームを利用しており、学術環境の多くの研究室での有用性を制限したり、予算が限られているりします。
この記事では、低コストのオープンソースのロボット液体処理システムOT-2を利用して、典型的なショットガンプロテオミクスサンプル調製ワークフローを半自動化するプロトコルについて説明します。OT-2は他の多くのロボット液体ハンドリングシステムよりも低コストで、執筆時点では約5,000米ドルの費用がかかります。異なるモジュールやラボウェアの価格を考慮すると、執筆時点でこのプロトコルで実験を設定するための総コストは約$ 10,000であり、より高価なオプションよりもかなり広範なラボセットに手頃な価格になります。OT-2はPythonスクリプトを通したオープンソースプログラミングと互換性があり、ユーザー定義のDIYプロトコル設計に大きな柔軟性を提供します。3つの社内開発スクリプトを使用して、以下のプロトコルは、典型的なショットガンプロテオミクスサンプル調製ワークフローを、典型的なタンパク質標準(ウシ血清アルブミン)でOT-2ステーションで実行することをカバーしています。BSA)と正常なヒト心臓のタンパク質サンプルをライセート(図1)とした。(1)BSAサンプルおよび(2)複雑な心臓ライセートサンプルを処理する手順は、それぞれプロトコルセクション1、2、5、6および4、5、6で詳述されている。Sera-Magカルボキシレート変性磁気ビーズは、タンパク質およびペプチドサンプル中の洗剤および塩を除去するために、単一ポット固相強化サンプル調製(SP3)で利用されます。ウシ血清アルブミンおよびヒト心臓タンパク質からのトリプティック消化は、SP3ビーズによってさらに洗浄され、LC-MS/MS分析のために提出される。質量スペクトルは、ペプチドおよびタンパク質同定のためのMaxQuantソフトウェアを使用して分析されます。我々が行う代表的な結果は、プロトコルがベンチ時間を節約しながら、変動の優れた技術的係数(CV)を達成し、手の消化に劣り、示しています。
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Protocol
開発された Python スクリプトは GitHub に入金されました: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons。スクリプトのコピーは 、補足ファイル 1 に記載されています。最新バージョンについては、GitHub リポジトリを参照してください。
1. 実験準備
- プロトコルを開始する前に、必要なハードウェアを確認してください。
注:次のハードウェアコンポーネントが必要です:OT-2ピペット、ピペットチップ、4-in-1チューブラックセット、アルミニウムブロックセット、磁気モジュール、温度モジュール、96-ウェル2 mL深層ウェルプレート( 材料表を参照)。
2. 単一タンパク質ウシ血清アルブミン(BSA)を用いた質量分析(MS)サンプル調製
- テキスト エディタで NoSP3_digestion.py スクリプトを開き、[ここでのみカスタマイズ] セクションで必要に応じて実験固有の変数を指定します。
注: 実験固有の変数には、サンプル数と反復数が含まれます。サンプル濃度;試薬の量は、ジチオトライトール - DTT、ヨウドアセトアミド - IAA、およびトリプシン;DTTおよびIAAのインキュベーション時間、およびピペットP20/P50およびP300のための開始先端)。- Opentronsアプリケーションを開き、Opentronsアプリケーションの [プロトコル ]タブにスクリプトをアップロードします。
注:Opentronsアプリは、Reference14 からローカルコンピュータにダウンロードできます。執筆時点では、Opentrons P50電子ピペットはOpentronsストアで購入できません。P20シングルチャネル電子ピペットとプロトコルで指定されたボリュームと互換性があります。P50ピペットをP20ピペットに置き換えるため、スクリプト内にメモと指示がなされています。Opentrons API 命令に従って、特定のピペットとこのプロトコルとの互換性をテストして検証する必要があります。
- Opentronsアプリケーションを開き、Opentronsアプリケーションの [プロトコル ]タブにスクリプトをアップロードします。
- 「ROBOT」タブを開き、Opentrons Appのステップバイステップの画面上の指示に従って、ROBOTタブでロボットデッキキャリブレーションキャリブレーションデッキを実行します。
注: この手順は、以前に実装されていない場合、または最近ロボットが再配置された場合にのみ必要です。 - チップ長のキャリブレーションを実行するには 、[PIPETTESの管理 ]ボタンをクリックし、ピペットオフセットキャリブレーションを実行してデフォルトのチップとピペットの組み合わせ位置をキャリブレーションします。
注: この手順は、ピペットを初めて使用する場合に必要です。 - 必要なラボウェアとピペットを、Python スクリプトで指定された OT-2 デッキの対応する場所に配置します(図 2)。
メモ:温度モジュールが接続され、電源がオンになっていて、アルミニウムブロックが温度モジュールの上に置かれていることを確認してください。 - [CALIBRATE] タブを開き、この Python スクリプトで必要なラボウェアとピペットの組み合わせに対して調整を実行します。
注:Opentronsアプリは、同じラボウェアとピペットを持つ将来のアプリケーションのために必要ではないキャリブレーションパラメータを記録します。 - 15 mL の円錐管で 5 mL の合計 5 mL に質量分析グレードの水に 39.53 mgの ABC を溶解して、100 mM 重炭酸アンモニウム (ABC) (pH 〜8.0) 溶液を 5 mL 調製します。4-in-1チューブラックのA1ウェルに15 mL + 50 mLチューブホルダートップを入れます。
- 2.0 mLタンパク質の低結合チューブに1 mLのウシ血清アルブミン(BSA)タンパク質を調製します( 材料表を参照)。サンプルを2 mLチューブホルダートップの4-in-1チューブラックのA1ウェルに入れします。
- 温度モジュールの上にアルミニウムブロックにA1、B1、C1、D1、E1、F1、A2などのウェルに2.0 mLタンパク質低結合チューブを手動で配置します。
注: ロボットピペットは、デフォルトで A1 (最初のサンプル) から最後のサンプルまで、垂直順序でサンプルを分配します。水平塗布を指定できます。詳細は15 を参照してください。準備が必要なチューブの総数は、サンプルの総数(すなわち、生物学的サンプルの数にサンプルごとの技術的反復の数を掛けたもの)と等しくする必要があります。 - 質量分析グレード水に9.26mgのDTT固形分を1mLの合計体積に溶解して、60mM DTTの1mLを調製します。DTTを2 mLチューブホルダートップの4-in-1チューブラックのA6ウェルに配置します。
注意:DTTは、人間の目、皮膚、および呼吸器系に有害です。PPEを着用し、化学フードの下でそれを処理します。適切な手順については、製造元の安全データシートを参照してください。 - ロボットが適切な量のABCバッファをアルミニウムブロックのサンプルチューブに転送している間に観察します。
注:各チューブのABCとタンパク質ミックスの総体積は100μLで、スクリプトでABCバッファの体積が計算されます(V = 100 μLからタンパク質サンプルの体積100μgを差し引いた量)。 - ロボットがABCバッファを持つ各チューブに100 μgのBSAタンパク質を転送することを確認します。
注:典型的な実験では、このBSAサンプルに対して、タンパク質消化に最大100μgのタンパク質、すなわち2.0 μg/μLの50 μLを使用する場合があります。 - ロボットプログラムが一時停止していることを手動で確認し、プロトコルを再開する前に、スロット4にある2 mLチューブラックのA6にDTTがロードされていることを確認します。DTTチューブがA6ウェルに配置されていることを確認し、キャップを開きます。Opentrons アプリの [再開] ボタンをクリックして続行します。ロボットが各サンプルに10 μLのDTT溶液を適切に転送し、その後に5回のミキシングラウンドを行うことを確認します。
- ロボットプログラムが一時停止していることを確認し、「サンプルチューブのキャップを閉じるようにする」というメッセージが表示されていることを確認します。手動でチューブのキャップを閉じて、続行するには 、再開 をクリックします。ロボットの温度モジュールがアルミニウムブロックを加熱し始めるまで待ってから、温度が55°Cに達するまで、5分のインキュベーションを行い、サンプルを55°Cにします。
注:ロボットは、インキュベーション中にDTTによるタンパク質の還元を可能にするために、30分間55°Cの温度を保持します。 - DTTインキュベーションの30分の間に、ABCバッファーに34.68mgのIAAを1mLの総容量に溶解させることにより、187.5 mMのIodoacetamide(IAA)の1mLを調製します。IAA溶液をアルミニウム箔で手動でラップして、光への暴露を避けます。
注意:IAAは重度の眼および呼吸刺激を引き起こす可能性がある。適切なPPEを身に着けている化学フードの下でそれを処理します。 - 30分DTTインキュベーションステップを完了すると、ロボットの温度モジュールが冷却されることを確認します。
メモ:モジュールの温度が22°Cに達した後、モジュールは5分間の温度を維持し、サンプルを完全に冷却できるようにします。 - ロボットのプログラムが一時停止しているときにサンプルチューブのキャップを解除し、警告メッセージを表示します:サンプルチューブのキャップを開くようにします。 [再開 ] をクリックして続行します。
- ロボットのプログラムが警告メッセージで一時停止されていることを手動で確認する:プロトコルを再開する前に、スロット4にある2 mLチューブラックのB6にIAAがロードされていることを確認します。IAAチューブのラック位置を確認し、チューブキャップを開きます。 [再開 ] をクリックして続行します。ロボットが各サンプルチューブに10 μLのIAAを転送し、その後に5回のミキシングラウンドを行うことを確認します。
- ロボットのプログラムが一時停止しているときにサンプルチューブをキャップし、「サンプルチューブのキャップを閉じ、サンプルチューブをホイルで覆う」というメッセージを表示します。きれいなホイルでアルミニウムブロック全体を覆います。 [再開 ] をクリックして続行します。サンプルが22°Cで30分間インキュベートされるまで待ちます。IAAインキュベーションが完了したら、ロボットの温度モジュールが非アクティブになっていることを確認します。
- IAAインキュベーション中にトリプシン溶液の混合物を調製(ステップ2.19)最終濃度の0.2 μg/μL:MSグレード水の100 μLに20μgの質量分析/シーケンシンググレードのトリプシンを溶解します。
- ロボットのプログラムが一時停止しているときにチューブキャップを開いた状態で、2 mLチューブラックのC6ウェルにトリプシン溶液を置き、警告メッセージを表示します:プロトコルを再開する前に、スロット4にある2mLチューブラックのC6にトリプシンが積み込まれたことを確認します。[再開] をクリックして続行します。
- ロボットのプログラムが一時停止していることを確認し、警告メッセージが表示されていることを確認します: 温度モジュールのサンプルチューブのキャップを開きます。サンプルチューブのキャップを解除し、 再開 をクリックして続行します。ロボットが各サンプルチューブに10 μLのトリプシンを移し、その後5回のミキシングラウンドを行う間、スタンバイします。
- サンプルチューブキャップをパラフィンフィルムで包み、すべてのサンプルを温度調節されたミキサーに移し、600rpmの揺れで16〜20時間37°Cでインキュベートします。
メモ:トリプシン消化は、37°Cの温度モジュールで直接行うこともできます。
3. SP3常磁性ビーズを用いたペプチドのクリーンアップ
- 翌日のトリプシン消化の翌日、ベンチトップマイクロ遠心分離機(≤2,000 x g)を使用してサンプルを簡単に回転させ( 材料表を参照)、サンプルを磁気チューブラックに置きます。サンプルを2分間放置します。
- 上清をピペットで慎重に、低結合マイクロ遠心チューブの新しいセットに移します。サンプルを冷蔵庫に保管し、手順3.2~3.9に進みます。
注:長期保存のため、サンプルは-80 °Cで保管してください。
- 上清をピペットで慎重に、低結合マイクロ遠心チューブの新しいセットに移します。サンプルを冷蔵庫に保管し、手順3.2~3.9に進みます。
- テキスト エディタで SP3_peptide_cleanup.py Python スクリプトを開き、[ここでのみカスタマイズ] セクションで必要に応じて指定します。
注:実験固有の変数には、サンプルと複製の数、転送されるペプチドの量、試薬の量(ビーズ、アセトニトリル、DMSO)、P20/P50およびP300ピペットの開始チップ、磁気モジュールの深層プレートから順調に開始が含まれます。各BSAダイジェストサンプルには約120μLの消化量が含まれており、各反復で55μLの2つの技術的複製に分け入れられます。ダイジェストの半分だけをクリーンアップするには、レプリケート番号変数を 1 に変更します。 - Opentrons アプリの [プロトコル] タブにスクリプトをアップロードします。
- 必要なラボウェアとピペットを、Python スクリプトで指定された OT-2 デッキの対応する場所に配置します(図 3)。磁気モジュールの電源がオンになっていて、ロボットに接続されていることを確認します。磁気モジュールの上部に新しい 2 mL 96 ウェル深層ウェルプレート( 材料表を参照)を配置します。
- [CALIBRATE] タブを開き、この Python スクリプトに必要なラボウェアとピペットの組み合わせに対して調整を実行します。
注:同じラボウェアとピペットの組み合わせのためのキャリブレーションは、一度実行する必要があり、Opentronsアプリは、キャリブレーションパラメータを記録します。 - 消化サンプル(ステップ3.1で収集した上澄み)を、2.0 mLチューブラックをウェルA1、B1..の垂直順に配置します。
- LC-MS/MS互換アセトニトリル15mLを50 mLの円錐形チューブに用意し、15mL + 50 mLチューブホルダートップを備えた4-in-1チューブラックのウェルA3にチューブを配置します。
- 15 mLの円錐管に4.9 mL質量分析等級水を加えて100 μL DMSOを加えて、2%DMSOの5 mLを準備します。チューブを15mL + 50mLチューブラックのウェルA1に入れ。
- 空の50 mL円錐形チューブに廃棄物のラベルを付け、15mL + 50mLチューブラックのウェルB3に配置します。
- 参照16に続いてSP3ビーズを準備します。
- 2.0 mLマイクロ遠心チューブに適量の混合ビーズを用意します。
注:ペプチドのクリーンアップ反応ごとに10 μLの混合ビーズが必要です。例えば、4回のクリーンアップ反応のために、最低40μLの混合ビーズを調製します。 - ビーズ混合物を磁気スタンドに2分間置きます。ピペットで上清を慎重に取り出し、ピペットで上清の体積を測定します。
- ビーズの残量を計算し、質量分析グレードの水(例えば、ビーズ20 μLの100〜200 μL水)と渦(速度10)を10秒に5〜10倍加えます。2分間磁気スタンドにビーズを置きます。
- 合計3回の洗浄に対して水洗工程を繰り返します。
- MSグレードの水の最終ビーズを50 μg/μLの最終濃度まで再懸濁し、洗浄したマグネットビーズをウェルA6の2.0 mLチューブラックに入れます。
注:ビーズは、10 μg/μL16の濃度で再中断することを推奨します。現在の最適化の取り組みでは、最終濃度を50 μg/μLに変更して、ビーズ-ペプチド-アセトニトリル混合物の総体積を最小限に抑えました。
- 2.0 mLマイクロ遠心チューブに適量の混合ビーズを用意します。
- ロボットが、消化したサンプルの55 μLを磁気モジュールの深い井戸プレートのウェルに転送するようにします。
- ロボットプロトコルが一時停止し、メッセージが表示されることを確認する:準備されたビーズが、プロトコルを再開する前にスロット4にある2 mLチューブラックのA6にロードされていることを確認します。ビーズを渦巻きし、ミニベンチトップ遠心分離機で5 s回転し、キャップを開けた2 mLチューブラックのA6ウェルにビーズを置きます。ロボットが上下にピペットを回してビーズを5ラウンド10回混ぜている間にスタンバイします。
注:ロボットは深い井戸の版の各消化されたサンプルに10 μLのビーズを移し、続いて5回混合する。 - ロボットが各ウェルに1,292 μLのアセトニトリルを転送し、すぐにペプチドとビーズの結合を容易にするために上下にピペット処理して10回混合することを確認します。
注:P300ピペットは一度に300 μLまでしか転送できないため、各転送は複数のラウンドで完了します。 - 深層プレートで上下にピペットを入れ、ロボットがすべてのサンプルを5回混合するようにします。
- 磁気モジュールが取り付けられており、サンプルがモジュール上で2分間インキュベートされるまで待ちます。
- ピペット吸引とディスペンス速度がデフォルトの150 μL/秒から25 μL/秒で遅くなる間は待機します。
注:ロボットはゆっくりと各ウェルから上澄み物を取り除き、磁気モジュールが係合している間、それを廃棄物管に捨てます。 - ピペット吸引と分配速度がデフォルト設定に戻るまで待ちます。磁気モジュールが外れます。
- ロボットのプログラムが一時停止され、メッセージが表示されることを確認します:ACNチューブキャップがオフになっていることを確認します。手動でアセトニトリルチューブをアンキャップし、チューブラックに戻します。 [再開 ] をクリックして続行します。ロボットが1mLのアセトニトリルを1mずつ送って各サンプルを洗浄し、すぐに10回混合するようにします。
- ロボットがサンプルを洗浄するためにすべてのサンプルを10回混合することを確認します。
- 磁気モジュールが係合されている間待機し、2分間サンプルをインキュベートします。
- ロボットがピペット吸引速度を変えて、上清をゆっくり取り除き、廃管に分配するまで待ちます。
- ロボットが磁気モジュール上のサンプルを60sでインキュベートして残留アセトニトリルが蒸発するのを可能にしながら観察し、ピペット吸引速度をデフォルトに戻します。磁気モジュールが外れるのを観察してください。
- ロボットのプログラムが一時停止していることを確認し、メッセージを表示します: Vortex DMSO再び、キャップを開きます。手動で10 sの2%DMSOをボルテックスし、15 mL-50 mLチューブラック内のA1ウェルに戻します。 [再開 ] をクリックして続行します。
- ロボットが2%DMSOの80 μLを各ウェルに転送し、すぐに10回混合するようにします。
- ロボットがすべてのサンプルを10回混合し、さらに5ラウンドを行うことを確認します。
- 磁気モジュールが係合されている間待機し、2分間サンプルをインキュベートします。
- ロボットがピペット吸引速度を遅く(25 μL/s)に変え、深層プレートの空の井戸にゆっくりと上清を移す間に観察します。
- ロボットが磁気モジュール上のサンプルを2分間インキュベートしてサンプル中の残留ビーズを取り除くまで待ちます。
- ロボットのプログラムが一時停止され、メッセージが表示されることを確認する:2 mLチューブラックに新しい2 mLチューブを配置し、チューブの数がサンプルの総数と一致することを確認します。
- 最初の2 mLマイクロ遠心分離チューブを最終BSA消化サンプルの直後にウェルに入れ。 [再開 ] をクリックして続行します。
注: たとえば、このプロトコルでテストされた 6 つの BSA ダイジェスト サンプルは、ウェル A1、B1、C1、D1、A2、B2 にあります。したがって、2.0 mLチューブの新しいセットは、ウェルB3、C3、D3、..などなど。 - ロボットが深層プレートのウェルから2.0 mLチューブの新しいセットにサンプル88 μLを転送している間に観察します。
注:プロトコル内の転送されたボリューム(1.1 x 80 μL)は、サンプルの全容がピペットチップに吸引されるように最適化されています。 - ロボットがピペット吸引速度をデフォルトに変更し、磁気モジュールを外している間待機します。
- 真空エバポレーターでクリーンアップされたペプチドを手動で乾燥させ( 材料表を参照)、セクション5に進むか、または-20°Cで乾燥したサンプルを保管します。
4. ヒト心臓のタンパク質の糖質(5 mg/mL)をSP3常磁性ビーズで調製したMSサンプル調製
- SP3_digestion.py Python スクリプトを開き、[ここでのみカスタマイズする] セクションで変数の値を指定します。
注:変数には、サンプル数と複製数、サンプル濃度、試薬の量(DTT、IAA、トリプシン、ビーズ、100%および80%エタノール)、DTTおよびIAAインキュベーション時間、ピペットP20/P50およびP300の開始チップ、および磁気モジュールの深いウェルプレートで良好に開始することが含まれます。 - DTTおよびIAAインキュベーション用の単一タンパク質ウシ血清アルブミンを用いたMSサンプル調製のセクション2.2-2.23のステップ2.2-2.23に従ってください。これらのステップでのロボットデッキの設定については 、図1 を参照してください。
- DTT および IAA インキュベーションステップ (ステップ 2.15 および 2.19) の間に、タンパク質のクリーンアップ (ステップ 3.10 で指定されている) に対して、新鮮な SP3 ビーズ ミックス (クリーンアップ反応ごとに 20 μL ビーズ) を準備します。2 mL チューブラックの D6 ウェルにビーズを置きます。
- 「開いたチューブキャップ」というメッセージが表示され、ロボットのプログラムが一時停止されていることを確認します。温度モジュールの上にあるアルミニウムブロックのサンプルチューブを手動でアンキャップし、 再開 をクリックして続行します。
- ロボットが2.0 mLチューブから磁気モジュールの上の新しい深い井戸プレートにすべてのサンプルを転送することを確認します。
- ロボットのプログラムが一時停止していることを確認し、メッセージを表示する:準備されたビーズがプロトコルを再開する前にスロット4にある2 mLチューブラックのD6にロードされていることを確認します。ビーズチューブキャップを開き、 再開 をクリックして続行します。
- ロボットが深い井戸プレートの各ウェルに20 μLのビーズを移し、ビーズを5ラウンド混合し、サンプルビーズ混合物を5ラウンド混合しながら観察します。
- ロボットのプログラムが一時停止され、メッセージが表示されることを確認する:プロトコルを再開する前にスロット5にある15 mL-50 mLチューブラックのA3に100%エタノールがロードされていることを確認します。100%エタノール(すなわち、200の証拠エタノール、 材料表を参照)の10-20 mLを50 mL円錐形の管に準備し、ラックのA3ウェルに入れる。 [再開 ] をクリックして続行します。
- ロボットが100%エタノールの140 μLをプレート内の各ウェルに移し、その後10ラウンドの混合を行い、ペプチドのビーズへの結合を容易にします。
- 各ラウンドを上下に10回ピペットして、合計5ラウンドの混合を行い、ロボットが各サンプルを混合することを確認します。
- 磁気モジュールが係合されている間待機し、モジュール上のサンプルを2分間インキュベートします。
- ロボットがピペットの速度を遅く(25 μL/s)に変え、各ウェルから上澄み物を吸引し、それを廃棄物管に分配する間観察します。
- ロボットがピペットの速度をデフォルトに戻し、磁気モジュールを外すまで待ちます。
- ロボットのプログラムが一時停止され、メッセージが表示されることを確認する:80%のエタノールがプロトコルを再開する前にスロット5にある15 mL-50 mLチューブラックのA4にロードされていることを確認します。MSグレード水4 mLを100%エタノールの16 mL(すなわち200プルーフ)と混合して、20 mLの80%エタノールを手動で調製します。80%エタノールをチューブラック内のA4ウェルに入れ、 [再開 ] をクリックして続行します。ロボットが各ウェルに1mLの80%エタノールを移し、すぐに10回混合することを確認してください。
- ロボットがピペット速度を遅く(25 μL/s)に変え、各ウェルから上澄み物を吸引し、廃棄物管に分配する間に観察します。ロボットがピペットの速度をデフォルトに戻し、磁気モジュールを外すまで待ちます。
- ロボットのプログラムが一時停止しているときに ABC ソリューションのキャップを開き、ABC チューブのオープン キャップというメッセージを表示します。 [再開 ] をクリックして続行します。ロボットが磁気モジュールを外している間に待機し、各ウェルに250 μLのABCを転送し、すぐに10回混合します。
注:このステップは、ABCでサンプルを洗浄することです。 - ロボットが磁気モジュールをエンゲージし、モジュール上のサンプルを2分間インキュベートすることを確認します。
- ロボットがピペット速度を遅く(25 μL/s)に変え、各ウェルから廃棄物管に上清を移します。ロボットが各ウェルに100 μLのABCバッファを転送し、すぐに10回混ぜるまで待ちます。
- ロボットのプログラムが一時停止していることを確認し、メッセージを表示します:プロトコルを再開する前に、新しいコレクションチューブが2.0 mLアルミニウムブロックに配置されていることを確認します。最後のサンプルチューブの直後に、低タンパク質保持マイクロ遠心チューブを最初にブロックに入れます。 [再開 ] をクリックして続行します。ロボットがABCバッファ内の各サンプルを新しい2.0 mLチューブに移す間待機します。
注:ウェルを調べ、必要に応じて残りのサンプルをチューブに手動で転送します。 - MSグレードのトリプシン20 μgをMSグレードの水に溶解して、適切な量のMSグレードのトリプシン(1サンプルあたり10 μL)を準備し、ロボットのプログラムが一時停止し、メッセージを表示する際に、MSグレードの水に20 μgを溶解し、メッセージを表示します: トリプシン(0.2 μg/μL)が事前に位置する2mLの積管のC6にロードされていることを確認します。ロボットが各サンプルチューブに10μLのトリプシンを移し、その後に5ラウンドの混合を行うことを確認します。
- サンプルチューブキャップをパラフィンフィルムで包み、すべてのサンプルを温度制御ミキサーに移し、37°Cで1,000rpmの振盪で16〜20時間インキュベートします。
注:1,000 rpmの揺れで消化を行うことは、一晩のインキュベーション中のビーズの降水量を最小限に抑えることをお勧めします。
5. SP3常磁性ビーズを用いたペプチドのクリーンアップ
- ステップ2のステップワイズの指示に従って、SP3常磁性ビーズを使用したペプチドのクリーンアップ。
6. 液体クロマトグラフィーと質量分析
- BSA(ステップ2〜3)および心臓リセート(ステップ4)ペプチドを0.1%のギ酸で再懸濁し、MS水中の99%のギ酸を総体積1Lに加える。
注意:酸酸は強酸です。眼、皮膚、呼吸器系に対して腐食性が高い。PPEを身に着けている化学フードの下で注意してハンドル。 - 定量ペプチドアッセイキット17 を用いて、ポスト・ダイジェストペプチド濃度を定量化し、LC-MS/MS分析用に0.5μgのBSAダイジェストと1.5μgの心臓消化を注入します。
- LC-MS/MS解析用の液体クロマトグラフィープログラムを設定します。
注:典型的なセットアップでは、ペプチドの消化は、補助ファイル2に記載されているパラメータを使用して、逆相C18カラム(3μm粒子;100Å孔;75μm x 150mm;材料表を参照)にロードされる場合があります。 - 補足ファイル3に記載されているパラメータを使用して、質量分析計(材料表を参照)を使用してショットガンプロテオミクスデータを取得します。
- タンパク質データベースでタンパク質の同定を検索します。
- 必要なソフトウェア MaxQuant をダウンロードしてインストールします。
注: MaxQuant ソフトウェア(v.1.6.10.43)は、以下の手順で使用されました( 資料一覧を参照)。 - 高品質のタンパク質配列データベース(UniProt/SwissProt)からキュレーションされたヒトプロテオームデータベースをダウンロードします( 材料表を参照)。 [ダウンロード ]ボタンをクリックし、[ FASTA(標準)]を選択します。
注: 必要に応じて、FASTA (非正規) をダウンロードして、必要に応じて、各遺伝子のタンパク質アイソフォームをデータベースに含めます。 - MaxQuant ソフトウェアインターフェイスで、タンパク質データベースとして使用する FASTA ファイルを指定するには、[ グローバル パラメータ] パネルに移動し、[ シーケンス ] タブをクリックします。次に、[ 追加 ]ボタンをクリックして、FASTAファイルへのファイルパスを指定します。
- MaxQuant ソフトウェアインターフェイスで、Raw データ パネルに移動して ロード ボタンをクリックし、生ファイルを選択して、解析する取得済みの未加工のマススペクトルファイルを指定します。
- 表 1 に示すように、検索パラメータを設定します。必要に応じて、ラベルなし定量 (LFQ) を有効にします。
- 検索が完了するまで待ち、/combined/txt フォルダーの msms.txt ファイルで FDR 1% のしきい値を通過するペプチドスペクトル一致 (PSM) の数を探します。
注: 代表的な結果セクションでここで行われた比較では、複数のタンパク質にマッピングされた PSM を除外し、1 つの一意のタンパク質にマッピングされた PSM を保持して PSM、ペプチド、およびタンパク質の数をカウントしました (図 4 および 図 5)。
- 必要なソフトウェア MaxQuant をダウンロードしてインストールします。
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Representative Results
OT-2ロボットと互換性があり、単一のタンパク質標準ウシ血清アルブミン(技術的複製n = 5消化)と洗剤含有ヒト心臓ライセートサンプル(n = 5消化)を用いた質量分析プロテオミクスのサンプル調製を行う3つのPythonスクリプトが提供されています。各消化産物は、2つのペプチドのクリーンアップ反応に分割されます。BSAおよび心臓サンプルの各ランにおける同定されたペプチドスペクトルマッチ(PSM)、ペプチド、およびタンパク質の数を 図4 および 図5に示す。BSAサンプルでは、728個のPSMと65個のペプチドの中央値をそれぞれ5.2%および3.2%の変動係数(CV)で同定した。複合心臓サンプルでは、7.6%、5.9%、3.6%の変動係数を持つ10回で、9,526 PSM、7,558個のペプチド、1,336個のタンパク質の中央値が同定されました。合計1,935個のタンパク質が心臓サンプルの10回から同定され、その中で1,677個のタンパク質が2回以上同定された。ペプチド定量における変動性を決定するために、抽出されたイオンクロマトグラム(XIC)強度のCVを、ユニークなタンパク質にマッピングした10個のペプチドについて計算した(表2)。タンパク質濃度測定に関するヒト(手パイプ)対ロボット実験結果の変動を、BCAアッセイと3つのタンパク質標準サンプルを用いてさらに比較した。ロボットBCAアッセイの平均CV(7.57%)は、人間のマニュアルBCAアッセイ(9.22%)よりも低いことがわかった(補足表1)。
記載されたプロトコルは、BSA消化プロトコルが2ヶ月離れて実行され、同等の結果を生み出した場合、時間の経過とともに一貫したパフォーマンスを示した。 図2 の固有のPSMとペプチドの中央値は、それぞれ728と65です。OT-2系で2ヶ月前に行った同じ実験は、平均647PSMおよび54ペプチド(n=2)を生成した(補足表2)。長期安定性も同様に推定され得る。
手動ベンチ処理時間(インキュベーション時間は含まない)は、ロボットプロトコルと人間処理18 の間で、サンプル調製毎に計算される。洗浄剤除去なしの消化プロトコルとペプチド脱塩を伴う場合、手動処理時間はロボットシステムと61分で41分です。洗浄剤の除去、消化、およびペプチド脱塩プロトコルでは、手動処理時間は、ロボットシステムと手で79分で54分です。そのため、半自動プロトコルは、サンプル当たりのハンズオンベンチ処理時間を約20~25分短縮します。この時間短縮は、多くのサンプルが処理されるとかなり向上し、複数のOT-2ロボットを並列に使用するとさらに改善される可能性があります。
図 1: スケマティック ワークフロー 洗剤の助けを使って抽出されたタンパク質は、消化前に洗剤除去の余分なステップで処理を必要とします。タンパク質サンプルを消化し、OT-2ロボットシステム上でペプチドを脱塩します。ペプチドの消化は、ナノLCと結合されたQ-Exactive HF質量分析計に注入される。MSスペクトルは、タンパク質同定のためにタンパク質データベースに対して検索される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:タンパク質消化用に設置されたロボットデッキ チップラック、サンプル、ゴミ、温度モジュール、磁気モジュールの指定された位置を示します。アスタリスクは、洗浄剤除去ステップを備えた消化プロトコルにのみ必要なラボウェアと試薬を示します。数字が付いたボックスは、占有されていないデッキの位置を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ペプチドクリーンアップスクリプト用に設置されたロボットデッキ チップラック、サンプル、ゴミ箱、磁気モジュールの指定された位置が表示されます。数字が付いたボックスは、占有されていないデッキの位置を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:BSAタンパク質の消化で検出されたペプチドスペクトルマッチ(PSM)とペプチドの数(n=5)。 各ダイジェストは、技術的複製ペプチドのクリーンアップ(R1およびR2)のために2つに分割された。変動係数: PSM の場合は 5.2%ペプチドの場合は3.2%。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ヒトの心臓リセートから同定されたPSM、ペプチド、およびタンパク質の数。 SP3洗剤除去で5回の消化を行った。ペプチドのクリーンアップ(R1およびR2)について、各ダイジェストを2つに分割した。変動係数: PSM の場合は 7.6%ペプチドの場合は5.9%タンパク質の場合は3.6% この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 消化酵素 | トリプシン/P |
| 最大の切断を逃した | 2 |
| 修正の修正 | システインのカルバミドメチル化 |
| 変数の変更 | N末端タンパク質アセチル化;メチオニンの酸化 |
| ペプチド長範囲 | 7 – 25 aa |
| 前駆体質量公差 | ± 4.5 ppm |
| MS/MSイオン質量公差 | ± 20 ppm |
| ラベルなしの定量化 | LFQ |
| ペプチドスペクトル一致(PSM)の偽発見率(FDR) | 0.01 |
表1:ペプチドデータベース(MaxQuant)検索パラメータ。
| ペプチド | タンパク質ID | PEP | 中央値 XIC 強度 | CV | |
| LSTSQIPQQIR | Q92523 | 7.72E-08 | 1.96E+07 | 6.70% | |
| セドフスルペイムドル | P13073 | 9.64E-17 | 8.05E+08 | 7.30% | |
| イルケイインスンク | P02679 | 2.76E-23 | 9.69E+08 | 7.60% | |
| TDDCHPWVLPVVK | P17174 | 4.51E-14 | 4.60E+08 | 8.60% | |
| ヴィヴフヴェンタントンクルタスク | P40925 | 7.90E-29 | 1.17E+09 | 8.70% | |
| ダイウントルンスグル | O75390 | 1.63E-15 | 1.38E+08 | 8.80% | |
| ブップスペアVGDASLTVVK | P13611 | 1.86E-09 | 6.77E+07 | 9.10% | |
| クヴァエクフランムル | P22695 | 3.25E-08 | 1.09E+08 | 9.30% | |
| トフフDVDグスフトフピュール | Q9UI09 | 2.05E-11 | 4.00E+07 | 9.60% | |
| サスドルトドゥンルク | P02787 | 5.29E-11 | 1.92E+09 | 9.80% | |
表2:抽出したイオンクロマトグラム(XIC)10個のペプチドの強度定量。
補足表1:手動および自動BCAアッセイの比較このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表2:BSA消化は、図4で処理されたサンプルから2ヶ月離れて行った。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: 開発された Python スクリプトのコピー。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2: LC-MS/MS分析のための液体クロマトグラフィープログラムのメソッドパラメータ。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足ファイル3:質量分析計を使用してショットガンプロテオミクスデータをアキシングするための方法パラメータ。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
プロトコル内の重要なステップ
最高のパフォーマンスを得るため、OT-2と互換性のあるOpentrons検証済みのラボウェア、モジュール、および消耗品を使用する必要があります。カスタムラボウェアは、Reference14でのOpentronsの指示に従って作成できます。OT-2デッキ、ピペット、ラボウェアを初めて使用する場合は必ず調整してください。また、ペプチドおよびタンパク質のクリーンアップのためのビーズを準備するために、SP3ビーズのメーカーのガイドラインに従うことは重要です。特に、ビーズとペプチド結合反応の間、結合反応におけるアセトニトリルの体積は≥95%である必要があり、ビーズ濃度は≥0.1 μg/μLである必要があります。ここでのペプチドクリーンアップスクリプトの最適化されたパラメータにより、アセトニトリル体積比は95%、ビーズ濃度は0.37 μg/μL、ペプチド濃度は14~37μg/mLの範囲です。ペプチド質量は、我々の経験から消化反応の100 μLで40〜100 μgと推定されます。SP3タンパク質のクリーンアップでは、5~10 μg~1μgのタンパク質を使用し、タンパク質結合時の最小ビーズ濃度が0.5 μg/μLであることが保証されました。推奨タンパク質濃度は10 μg/mL-5 mg/mLの範囲です。提供されたスクリプトのデフォルトパラメータでは、1mgのビーズが100μgのタンパク質に使用され、結合時のビーズ濃度は3.75μg/μLですが、タンパク質濃度は0.35mg/mLです。
変更とトラブルシューティング
Python スクリプトのデフォルト変数は、当研究室の標準ワークフロー用に最適化されています。必要に応じて、ユーザーは変数を調整して、スクリプトをアプリケーションと互換性を持てる必要があります。低MS強度が観察された場合、タンパク質BCAアッセイおよび定量ペプチドアッセイを用いて各重要なプロトコルセクションの後にタンパク質またはペプチドの損失がないか確認してください。OT-2のプロトコルを初めて使用する場合は、各ステップのロボットハンドリングを観察し、ロボットが期待どおりに手順を実行することを確認します。執筆時点では、P50電子ピペットはOpentronsストアで利用できなくなりました。P20ピペットがどこで使用されるのかを示すために、現在のスクリプトが修正されました。ユーザーは、必要に応じて、Opentrons API を参照して、他のピペットを使用するようにスクリプトを変更することができます。
テクニックの制限
ロボット式液体処理システムを使用する利点にもかかわらず、技術的な複製間の流体移動のパフォーマンスには注意が必要です。初期設定と液体処理手順の間にロボットを監視することを強くお勧めします。ロボット液体移動後、サンプル損失を回避し、変動を減らすために、残量の手動回収が必要になることがあります。
既存の方法に関する意義
このプロトコルは、低コストおよびオープンソースOT-2液体ハンドリングロボットを用いた半自動化質量分析ベースのサンプル調製方法を記述する。ごく最近では、他の作品もプロテオミクスアプリケーション11にOT-2を使用し始めています。既存の方法と比較して、このプロトコルの特徴は比較的低コストでPythonプログラム可能なロボットの使用を含みます。サンプル調製プロトコルの2つのステップでの半自動SP3ビーズの組み込み、すなわち、タンパク質サンプル洗剤除去ステップとペプチド脱塩/クリーンアップステップ;さらに開発をサポートするオープンソースの Python スクリプトの利用可能性も同様です。SP3常磁性ビーズは、タンパク質とペプチドを効率的に結合し、MSサンプル調製11,13で酵素消化する前にタンパク質クリーンアップ/洗剤除去の用途に向けて、自動液体処理システムと結合されています。
このプロトコルとともに、3つのオープンソースのPythonスクリプトが研究者に提供されています。スクリプトは、個々の実験条件(例えば、サンプル数、反復数、インキュベーション温度および時間など)に合わせてカスタマイズ可能であり、修正されたワークフローのさらなる開発を可能にします。プロトコルは、他の液体取扱システム(<20%)9,11の以前の研究と比較して、MSラン間のペプチドおよび/またはタンパク質同定の数で優れた3%-6%の技術的なCVを提供しました。
今後のアプリケーション
このプロトコルは、サンプル処理の効率を向上させるために質量分析の実験室やコア施設に適用できる、半自動プロテオミクスサンプル調製用のSP3ビーズと組み合わせた低コストのプログラマブル液体処理システムの有用性を示しています。
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Disclosures
著者には宣言する競合はありません。
Acknowledgments
この作品は、YHに対するNIH賞F32-HL149191によって部分的にサポートされました。R00-HL144829 から EL;R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 to MPL. 図1、 図2、 図3 は、ウェブベースの科学イラストレーションツールの助けを借りて作成された、BioRender.com。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
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