Summary
Detailliertes Protokoll und drei Python-Skripte werden für den Betrieb eines Open-Source-Roboter-Liquid-Handling-Systems bereitgestellt, um eine halbautomatische Proteinprobenvorbereitung für Massenspektrometrie-Experimente durchzuführen, die die Entfernung von Reinigungsmitteln, die Proteinverdauung und die Peptidentsalzungsschritte abdecken.
Abstract
Massenspektrometrie-basierte Shotgun-Proteomik-Experimente erfordern mehrere Probenvorbereitungsschritte, einschließlich enzymatischer Proteinverdauung und -reinigung, die erhebliche Arbeitsstunden am Labor in Anspruch nehmen und eine Quelle der Variabilität von Charge zu Charge darstellen können. Die Laborautomatisierung mit Pipettierrobotern kann die manuelle Arbeit reduzieren, den Durchsatz maximieren und die Reproduzierbarkeit der Forschung erhöhen. Dennoch machen die hohen Startpreise von Standard-Automatisierungsstationen sie für viele akademische Labore unerschwinglich. Dieser Artikel beschreibt einen Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow unter Verwendung eines erschwinglichen Open-Source-Automatisierungssystems (The Opentrons OT-2), einschließlich Anweisungen zum Einrichten von halbautomatischen Proteinreduktions-, Alkylierungs-, Verdauungs- und Reinigungsschritten; sowie begleitende Open-Source-Python-Skripte zur Programmierung des OT-2-Systems über seine Anwendungsprogrammierschnittstelle.
Introduction
Die auf Massenspektrometrie basierende Shotgun-Proteomik ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Häufigkeit vieler Proteine in biologischen Proben gleichzeitig zu messen. Proteomik-Experimente mit bioinformatischer Analyse werden routinemäßig eingesetzt, um Biomarker zu identifizieren und assoziierte biologische Komplexe und Signalwege zu entdecken, die pathologischen Mechanismen zugrunde liegen. Mit ihrer hohen Analytspezifität und potenziellen quantitativen Genauigkeit hat die Shotgun-Proteomik auch ein hervorragendes Potenzial, von Forschungseinrichtungen und diagnostischen Labors für die klinische Probenanalyse übernommen zu werden, ohne sich auf Antikörper verlassen zu müssen1,2.
Um Proteinproben für die Shotgun-Proteomik-Analyse vorzubereiten, müssen Proteine, die aus biologischen Proben (z. B. Zellen und Geweben) extrahiert werden, typischerweise zuerst unter Verwendung langwieriger Protokolle verarbeitet werden, einschließlich der Messung der Probenproteinkonzentration, der Proteinreduktion und -alkylierung sowie des enzymatischen Aufschlusses in Peptide. Darüber hinaus erfordern Proteine, die in herkömmlichen Lysepuffern extrahiert werden, die Detergenzien enthalten, vor der Analyse häufig zusätzliche Schritte des Pufferaustauschs oder der Reinigungsmittelentfernung, da Detergenzien die Trypsinaufschluss stören und die Leistung der nachgeschalteten Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) -Analyse erheblich beeinträchtigen können3. Peptide werden typischerweise nach enzymatischem Aufschluss weiter entsalzt, getrocknet und in LC-MS/MS-kompatiblen Lösungsmitteln rekonstituiert. Diese proteinbiochemischen Verfahren können arbeitsintensiv und zeitaufwendig sein. Somit begrenzen sie weiterhin den Durchsatz von Proteomik-Workflows und tragen zur Variabilität der erfassten Daten bei4,5. Menschliche Fehler und Verzerrungen wurden als entscheidende Faktoren erkannt, die die Datenvarianz und Reproduzierbarkeit beeinflussen6,7. Um menschliche Fehler bei der Massenspektrometrie-Probenvorbereitung zu minimieren, wurden automatisierte Pipettierrobotersysteme eingesetzt, um den Durchsatz und die Reproduzierbarkeit der Proteinidentifizierung und -quantifizierung aus der Schrotflintenproteomik und der gezielten Massenspektrometrieanalyse zu verbessern, wo solche Fortschritte als entscheidend für die Fortsetzung des Vorstoßes für eine weit verbreitete Einführung von Proteomik-Technologien in kritischen Forschungs- und klinischen Umgebungen gefeiert wurden8. 9,10,11,12,13. Die meisten bestehenden Protokolle verwenden jedoch robotergestützte Liquid-Handling-Plattformen, die erhebliche Investitionen und Schulungen erfordern, was ihren Nutzen in vielen Labors im akademischen Umfeld oder anderweitig mit einem begrenzten Budget einschränkt.
Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das ein kostengünstiges Open-Source-Roboter-Liquid-Handling-System, das OT-2, verwendet, um einen typischen Shotgun-Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflow zu halbautomatisieren. Das OT-2 hat niedrigere Kosten als viele andere Roboter-Liquid-Handling-Systeme und kostet zum Zeitpunkt des Schreibens etwa 5.000 US-Dollar. Wenn man die Preise verschiedener Module und Laborgeräte berücksichtigt, betragen die Gesamtkosten für die Einrichtung von Experimenten in diesem Protokoll zum Zeitpunkt des Schreibens etwa 10.000 US-Dollar, was es für eine wesentlich breitere Gruppe von Labors erschwinglicher macht als teurere Optionen. Der OT-2 ist kompatibel mit Open-Source-Programmierung durch Python-Skripte und bietet große Flexibilitäten im benutzerdefinierten DIY-Protokolldesign. Unter Verwendung von drei intern entwickelten Skripten decken die folgenden Protokolle die Ausführung eines typischen Shotgun-Proteomik-Probenvorbereitungs-Workflows auf der OT-2-Station mit einem archetypischen Proteinstandard (Rinderserumalbumin; BSA) und eine komplexe Proteinprobe eines normalen menschlichen Herzlysat (Abbildung 1). Die Verfahren zur Verarbeitung (1) einer BSA-Probe und (2) einer komplexen Herzlysatprobe sind in den Protokollabschnitten 1, 2, 5, 6 und 3, 4, 5, 6 beschrieben. Sera-Mag-Carboxylat-modifizierte Magnetperlen werden in der Eintopf-Festphasen-verstärkten Probenvorbereitung (SP3) verwendet, um Reinigungsmittel und Salze in den Protein- und Peptidproben zu entfernen. Tryptische Digests aus Rinderserumalbumin und menschlichen Herzproteinen werden durch SP3-Kügelchen weiter gereinigt und zur LC-MS/MS-Analyse eingereicht. Massenspektren werden dann mit der MaxQuant-Software zur Peptid- und Proteinidentifizierung analysiert. Repräsentative Ergebnisse, die von uns durchgeführt wurden, zeigen, dass das Protokoll hervorragende technische Variationskoeffizienten (CV) erreicht, gleichzeitig Bankzeit spart und der Handverdauung nicht unterlegen ist.
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Protocol
Die entwickelten Python-Skripte wurden auf GitHub hinterlegt unter: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Eine Kopie der Skripte finden Sie in Der Ergänzungsdatei 1. Die neuesten Versionen finden Sie im GitHub-Repository.
1. Versuchspräparate
- Überprüfen Sie die erforderliche Hardware, bevor Sie das Protokoll starten.
HINWEIS: Die folgenden Hardwarekomponenten werden benötigt: OT-2 Pipetten, Pipettenspitzen, 4-in-1-Rohrracksatz, Aluminiumblocksatz, Magnetmodul, Temperaturmodul, 96-Well 2 ml Tiefbrunnenplatten (siehe Materialtabelle).
2. Massenspektrometrische (MS) Probenvorbereitung mit einem einzigen Protein Rinderserumalbumin (BSA)
- Öffnen Sie die NoSP3_digestion.py Skripts in einem Texteditor und geben Sie die experimentspezifischen Variablen nach Bedarf im Abschnitt NUR HIER ANPASSEN an.
HINWEIS: Die experimentspezifischen Variablen umfassen die Anzahl der Proben und die Replikation; die Probenkonzentration; das Volumen der Reagenzien Dithiothreitol - DTT, Iodoacetamid - IAA und Trypsin; B. die DTT- und IAA-Inkubationszeit und die Startspitze für Pipette P20/P50 und P300).- Öffnen Sie die Opentrons App und laden Sie das Skript auf die Registerkarte PROTOKOLL in der Opentrons App hoch.
HINWEIS: Die Opentrons App kann von Reference14 auf einen lokalen Computer heruntergeladen werden. Zum Zeitpunkt des Schreibens ist die elektronische Pipette Opentrons P50 nicht im Opentrons Store erhältlich. Sie wurde durch die einkanalige elektronische Pipette P20 ersetzt, die mit den im Protokoll angegebenen Volumina kompatibel ist. Im Skript wurden Hinweise und Anweisungen gemacht, um die P50 Pipette durch die P20 Pipette zu ersetzen. Benutzer müssen möglicherweise die Kompatibilität der jeweiligen Pipette mit diesem Protokoll gemäß den Opentrons-API-Anweisungen testen und überprüfen.
- Öffnen Sie die Opentrons App und laden Sie das Skript auf die Registerkarte PROTOKOLL in der Opentrons App hoch.
- Öffnen Sie die Registerkarte ROBOT und führen Sie die Roboterdeckkalibrierung durch Kalibrieren Sie Deck auf der Registerkarte ROBOT , indem Sie den Schritt-für-Schritt-Anweisungen auf dem Bildschirm in der Opentrons App folgen.
HINWEIS: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn er zuvor nicht implementiert wurde oder der Roboter kürzlich verschoben wurde. - Klicken Sie auf die Schaltfläche PIPETTEN VERWALTEN , um eine Kalibrierung der Spitzenlänge durchzuführen, gefolgt von einer Pipetten-Offset-Kalibrierung, um die Standardposition der Spitzen- und Pipettenkombination zu kalibrieren.
HINWEIS: Dieser Schritt ist erforderlich, wenn zum ersten Mal eine Pipette verwendet wird. - Platzieren Sie die erforderliche Labware und Pipetten an der entsprechenden Stelle im OT-2-Deck, das im Python-Skript angegeben ist (Abbildung 2).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Temperaturmodul angeschlossen und eingeschaltet ist und der Aluminiumblock oben auf dem Temperaturmodul platziert ist. - Öffnen Sie die Registerkarte CALIBRATE und führen Sie eine Kalibrierung für die Kombination aus Labware und Pipetten durch, die in diesem Python-Skript erforderlich ist.
HINWEIS: Die Opentrons App zeichnet die Kalibrierparameter auf, was für zukünftige Anwendungen mit derselben Laborware und denselben Pipetten nicht erforderlich ist. - Bereiten Sie 5 ml 100 mM Ammoniumbicarbonat (ABC) (pH ~ 8,0) Lösung vor, indem Sie 39,53 mg ABC in Massenspektrometrie-Wasser zu einem Gesamtvolumen von 5 ml in einem konischen 15-ml-Röhrchen auflösen. Legen Sie den Ammoniumbicarbonatpuffer mit der 15 mL + 50 mL Rohrhalterplatte in die A1-Vertiefung des 4-in-1-Rohrgestells.
- Bereiten Sie 1 ml Rinderserumalbumin (BSA) Protein in einem 2,0 ml Protein-Low-Bind-Röhrchen vor (siehe Materialtabelle). Legen Sie die Probe in die A1-Vertiefung des 4-in-1-Röhrchengestells mit 2 mL Rohrhalterplatte.
- Platzieren Sie manuell 2,0 ml Protein-Low-Bind-Röhrchen in den Vertiefungen von A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2 usw. im Aluminiumblock auf der Oberseite des Temperaturmoduls.
HINWEIS: Die Roboterpipette gibt standardmäßig Proben in der vertikalen Reihenfolge ab A1 (erste Probe) bis zur letzten Probe aus. Horizontale Dosierung kann spezifiziert werden. Weitere Informationen finden Sie unter15 . Die Gesamtzahl der Röhrchen, die vorbereitet werden müssen, sollte der Gesamtzahl der Proben entsprechen (d. h. der Anzahl der biologischen Proben multipliziert mit der Anzahl der technischen Replikate pro Probe). - Bereiten Sie 1 ml 60 mM DTT vor, indem Sie 9,26 mg DTT-Feststoffe in massenspektrometrischem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 mL auflösen. Platzieren Sie das DVB-T mit der 2-ml-Rohrhalterplatte im A6-Well des 4-in-1-Rohrgestells.
VORSICHT: DTT ist schädlich für die menschliche Augen, die Haut und die Atemwege. Tragen Sie PSA und handhaben Sie sie unter einer chemischen Haube. Informationen zu den ordnungsgemäßen Verfahren finden Sie im Sicherheitsdatenblatt des Herstellers. - Beobachten Sie, während der Roboter ein entsprechendes Volumen an ABC-Puffer in die Probenröhrchen im Aluminiumblock überträgt.
HINWEIS: Das Gesamtvolumen der ABC- und Proteinmischung in jedem Röhrchen beträgt 100 μL, und das Volumen des ABC-Puffers wird im Skript berechnet (V = 100 μL abzüglich des Volumens von 100 μg Proteinprobe). - Stellen Sie sicher, dass der Roboter 100 μg BSA-Protein in jedes Röhrchen mit ABC-Puffer überträgt.
HINWEIS: Ein typisches Experiment kann bis zu 100 μg Proteine für den Proteinaufschluss verwenden, d.h. 50 μL von 2,0 μg/μL für diese BSA-Probe. - Überprüfen Sie manuell, ob das Roboterprogramm angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass DTT in A6 des 2-ml-Rohrracks in Steckplatz 4 geladen wurde, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Stellen Sie sicher, dass ein DVB-T-Rohr im A6-Brunnen platziert ist, und öffnen Sie seine Kappe. Klicken Sie in der Opentrons-App auf die Schaltfläche Fortsetzen, um fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass der Roboter 10 μL DTT-Lösung in jede Probenbohrung überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden.
- Stellen Sie sicher, dass das Roboterprogramm angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass die Kappen auf probenröhrchen geschlossen werden. Schließen Sie die Kappen der Röhren manuell und klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren. Warten Sie, bis das Temperaturmodul des Roboters beginnt, den Aluminiumblock zu erwärmen, bis die Temperatur 55 ° C erreicht, gefolgt von einer 5-minütigen Inkubation, damit die Proben auf 55 ° C gelangen können.
HINWEIS: Der Roboter hält die Temperatur 30 Minuten lang bei 55 °C, um eine Proteinreduktion durch DTT während der Inkubation zu ermöglichen. - Bereiten Sie während der 30 min DTT-Inkubation 1 ml 187,5 mM Iodoacetamid (IAA) vor, indem Sie 34,68 mg IAA im ABC-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 1 ml auflösen. Verpacken Sie die IAA-Lösung manuell mit Aluminiumfolie, um Lichteinwirkung zu vermeiden.
VORSICHT: IAA kann schwere Augen- und Atemwegsreizungen verursachen. Behandeln Sie es unter einer chemischen Haube und tragen Sie die richtige PSA. - Stellen Sie sicher, dass das Temperaturmodul des Roboters nach Abschluss des 30-minütigen DTT-Inkubationsschritts abkühlt.
HINWEIS: Nachdem die Temperatur des Moduls 22 °C erreicht hat, hält das Modul die Temperatur für 5 Minuten aufrecht, damit die Proben vollständig abkühlen können. - Heben Sie die Kappe der Probenröhrchen auf, wenn das Programm des Roboters angehalten ist, und zeigen Sie die Warnmeldung an: Stellen Sie sicher, dass die Kappen auf den Probenröhrchen geöffnet werden. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren.
- Überprüfen Sie manuell, ob das Programm des Roboters mit einer Warnmeldung angehalten wurde: Stellen Sie sicher, dass IAA in B6 des 2-ml-Rohrracks in Steckplatz 4 geladen wurde, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Bestätigen Sie die Rackposition des IAA-Rohrs und öffnen Sie die Rohrkappe. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass der Roboter 10 μL IAA in jedes Probenröhrchen überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden.
- Verschließen Sie die Probenröhrchen, wenn das Programm des Roboters angehalten ist, und zeigen Sie die Meldung an: Schließen Sie die Kappen auf den Probenröhrchen und bedecken Sie die Probenröhrchen mit Folie. Decken Sie den gesamten Aluminiumblock mit einem sauberen Stück Folie ab. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren. Warten Sie, bis die Proben bei 22 °C 30 min inkubiert sind. Stellen Sie sicher, dass das Temperaturmodul des Roboters nach Abschluss der IAA-Inkubation deaktiviert wird.
- Während der IAA-Inkubation (Schritt 2.19) ist eine Mischung aus Trypsinlösung in der Endkonzentration von 0,2 μg/μL herzustellen: 20 μg Massenspektrometrie-/Sequenzierungs-Trypsin in 100 μL MS-Wasser aufzulösen.
- Platzieren Sie die Trypsin-Lösung in der C6-Vertiefung des 2-ml-Rohrracks mit geöffneter Rohrkappe, wenn das Programm des Roboters angehalten wird, und zeigen Sie die Warnmeldung an: Stellen Sie sicher, dass Trypsin in C6 des 2-ml-Rohrracks in Steckplatz 4 geladen wurde, bevor Sie das Protokoll wieder aufnehmen. Klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren.
- Überprüfen Sie, ob das Programm des Roboters angehalten ist und die Warnmeldung anzeigt: Öffnen Sie Kappen auf Probenröhrchen auf dem Temperaturmodul. Entpacken Sie die Probenröhrchen und klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren. Stehen Sie bereit, während der Roboter 10 μL Trypsin in jedes Probenröhrchen überträgt, gefolgt von fünf Mischrunden.
- Wickeln Sie die Probenröhrchenkappen mit Paraffinfolie ein, geben Sie alle Proben in einen temperaturgesteuerten Mischer und inkubieren Sie bei 37 °C für 16-20 h mit 600 U / min Schütteln.
HINWEIS: Der Trypsinaufschluss kann auch direkt am Temperaturmodul bei 37 °C durchgeführt werden.
3. Peptidreinigung mit paramagnetischen SP3-Kügelchen
- Am nächsten Tag nach dem Trypsinaufschluss über Nacht drehen Sie die Proben kurz mit einer Tischmikrozentrifuge (≤2.000 x g) (siehe Materialtabelle) und legen Sie die Proben auf ein Magnetrohrgestell. Lassen Sie die Proben 2 Min. stehen.
- Übertragen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in einen neuen Satz proteinarmer Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie die Proben im Kühlschrank auf und fahren Sie mit den Schritten 3.2-3.9 fort.
HINWEIS: Für die Langzeitlagerung lagern Sie die Proben bei -80 °C.
- Übertragen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in einen neuen Satz proteinarmer Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie die Proben im Kühlschrank auf und fahren Sie mit den Schritten 3.2-3.9 fort.
- Öffnen Sie das SP3_peptide_cleanup.py Python-Skripts in einem Texteditor und geben Sie dies bei Bedarf im Abschnitt NUR HIER ANPASSEN an.
HINWEIS: Zu den experimentspezifischen Variablen gehören die Anzahl der Proben und Replikate, das Volumen der zu übertragenden Peptide, das Volumen der Reagenzien (Perlen, Acetonitril, DMSO), die Startspitze für P20/P50- und P300-Pipetten und der Beginn gut in der Deep-Well-Platte auf dem Magnetmodul. Jede BSA-Verdauprobe enthält etwa 120 μL Aufschlussvolumen, das in zwei technische Replikate mit 55 μL in jedem Replikat aliquotediert wird. Um nur die Hälfte des Digests zu bereinigen, ändern Sie die Replikationszahlvariable in 1. - Laden Sie das Skript auf die Registerkarte PROTOKOLL in der Opentrons-App hoch.
- Platzieren Sie die erforderliche Labware und Pipetten an der entsprechenden Stelle im OT-2-Deck, das im Python-Skript angegeben ist (Abbildung 3). Stellen Sie sicher, dass das Magnetmodul eingeschaltet und mit dem Roboter verbunden ist. Platzieren Sie eine neue 2 ml 96-Well-Deep-Well-Platte (siehe Materialtabelle) auf der Oberseite des Magnetmoduls.
- Öffnen Sie die Registerkarte CALIBRATE und führen Sie eine Kalibrierung für die Kombination aus Labware und Pipetten durch, die in diesem Python-Skript erforderlich ist.
HINWEIS: Die Kalibrierung für die gleichen Labor- und Pipettenkombinationen muss nur einmal durchgeführt werden, und die Opentrons App zeichnet die Kalibrierparameter auf. - Legen Sie die verdauten Proben (Überstand, der in Schritt 3.1 gesammelt wurde) in vertikaler Reihenfolge in den Vertiefungen A1, B1 in das 2,0 ml Röhrchengestell....
- Bereiten Sie 15 ml LC-MS/MS-kompatibles Acetonitril in einem konischen 50 mL-Rohr vor und legen Sie das Rohr in den Brunnen A3 im 4-in-1-Rohrgestell mit der 15 mL + 50 mL Rohrhalterplatte.
- Bereiten Sie 5 ml 2% DMSO vor, indem Sie 100 μL DMSO mit 4,9 ml Massenspektrometrie-Wasser in einem konischen 15-ml-Röhrchen zugeben. Legen Sie das Rohr in den Brunnen A1 in das 15mL + 50mL Rohrgestell.
- Beschriften Sie ein leeres 50 mL konisches Rohr als Waste und legen Sie es in den Brunnen B3 im 15mL + 50mL Rohrgestell.
- Bereiten Sie die SP3-Perlen gemäß Referenz16 vor.
- Bereiten Sie eine geeignete Menge gemischter Perlen in einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor.
HINWEIS: Jede Peptidreinigungsreaktion erfordert 10 μL Mischperlen. Bereiten Sie beispielsweise mindestens 40 μL Mischperlen für vier Reinigungsreaktionen vor. - Lassen Sie die Perlenmischung 2 min auf dem Magnetständer ruhen. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette und messen Sie das Volumen des Überstandes mit einer Pipette.
- Berechnen Sie das verbleibende Volumen der Perlen und fügen Sie das 5-10-fache des Massenspektrometrie-Wassers (z. B. 100-200 μL Wasser für 20 μL Perlen) und den Wirbel (Geschwindigkeit 10) für 10 s hinzu. Setzen Sie die Perlen für 2 min auf den Magnetständer.
- Wiederholen Sie die Wasserwaschschritte für insgesamt drei Wäschen.
- Die endgültigen Kügelchen in MS-Wasser auf eine Endkonzentration von 50 μg/μL resuspendieren. Legen Sie die gewaschenen Magnetperlen in die Vertiefung A6 im 2,0 ml Rohrgestell.
HINWEIS: Es wird empfohlen, die Kügelchen in einer Konzentration von 10 μg/μL16 zu resuspenieren. Im Rahmen der aktuellen Optimierung wurde die Endkonzentration auf 50 μg/μL modifiziert, um das Gesamtvolumen des Perlen-Peptid-Acetonitril-Gemisches zu minimieren.
- Bereiten Sie eine geeignete Menge gemischter Perlen in einem 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen vor.
- Stellen Sie sicher, dass der Roboter 55 μL der verdauten Proben in die Vertiefungen in den Tiefbrunnenplatten des Magnetmoduls überträgt.
- Stellen Sie sicher, dass das Roboterprotokoll angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass vorbereitete Perlen in A6 des 2-ml-Rohrracks in Steckplatz 4 geladen wurden, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Wirbeln Sie die Perlen und drehen Sie dann kurz für 5 s auf einer Mini-Tischzentrifuge nach unten und legen Sie die Perlen bei geöffneter Kappe in den A6-Brunnen des 2-ml-Rohrgestells. Stehen Sie bereit, während der Roboter die Perlen 10 Mal für fünf Runden mischt, indem er auf und ab pipettet.
HINWEIS: Der Roboter überträgt 10 μL Perlen an jede verdaute Probe in den Tiefbrunnenplatten, gefolgt von fünfmaligem Mischen. - Stellen Sie sicher, dass der Roboter 1.292 μL Acetonitril in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt, indem er auf und ab pipettet, um die Bindung von Peptiden und Perlen zu erleichtern.
HINWEIS: Jeder Transfer erfolgt über mehrere Runden, da die P300 Pipette nur bis zu 300 μL gleichzeitig übertragen kann. - Stellen Sie sicher, dass der Roboter alle Proben fünfmal mischt, indem er in der Deep-Well-Platte auf und ab pipettet.
- Warten Sie, bis das magnetische Modul eingerastet ist und die Proben 2 Minuten lang auf dem Modul inkubiert sind.
- Stehen Sie bereit, während die Pipettierabsaug- und Dosiergeschwindigkeiten bei 25 μL/s von der Standardeinstellung von 150 μL/s verlangsamt werden.
HINWEIS: Der Roboter entfernt den Überstand langsam aus jeder Vertiefung und entsorgt ihn im Abfallrohr, während das Magnetmodul eingeschaltet ist. - Warten Sie, bis die Pipettierabsaug- und Dosiergeschwindigkeiten wieder auf die Standardeinstellung eingestellt sind. Beachten Sie, dass sich das Magnetmodul löst.
- Stellen Sie sicher, dass das Programm des Roboters angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass die ACN-Röhrenkappe ausgeschaltet ist. Lösen Sie das Acetonitrilrohr manuell und legen Sie es wieder in das Rohrgestell. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass der Roboter 1 ml Acetonitril überträgt, um jede Probe zu waschen und sofort 10 Mal zu mischen.
- Stellen Sie sicher, dass der Roboter alle Proben 10 Mal mischt, um die Proben zu waschen.
- Stehen Sie bereit, während das Magnetmodul eingeschaltet ist und die Proben für 2 min inkubiert.
- Warten Sie, bis der Roboter die Aspirationsgeschwindigkeit des Pipettierens ändert, um den Überstand langsam und langsam zu entfernen und in das Abfallrohr abzugeben.
- Beobachten Sie, während der Roboter die Proben auf dem Magnetmodul für 60 s inkubiert, damit Restacetonitril verdampfen kann, und dann die Pipettierabsauggeschwindigkeiten wieder auf den Standardwert ändert. Beachten Sie, dass sich das magnetische Modul löst.
- Stellen Sie sicher, dass das Programm des Roboters angehalten ist und die Folgenden Meldung anzeigt: Vortex DMSO erneut und öffnen Sie die Kappen. Schwenken Sie das 2% DMSO manuell für 10 s und legen Sie es zurück in die A1-Vertiefung im 15 ml-50 ml Rohrgestell. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren.
- Stellen Sie sicher, dass der Roboter 80 μL 2% DMSO in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt.
- Stellen Sie sicher, dass der Roboter alle Proben 10 Mal für weitere fünf Runden mischt.
- Stehen Sie bereit, während das Magnetmodul eingeschaltet ist und die Proben für 2 min inkubiert.
- Beobachten Sie, wie der Roboter die Aspirationsgeschwindigkeit der Pipette auf langsam (25 μL/s) ändert und den Überstand langsam in leere Vertiefungen in der Tiefbrunnenplatte überträgt.
- Warten Sie 2 Minuten, bis der Roboter Proben auf dem Magnetmodul inkubiert hat, um Restperlen in den Proben zu entfernen.
- Stellen Sie sicher, dass das Programm des Roboters angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Legen Sie neue 2-ml-Röhrchen in das 2-ml-Röhrchengestell und stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Röhrchen mit der Gesamtzahl der Proben übereinstimmt.
- Das erste 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen direkt nach der endgültigen BSA-Aufschlussprobe in die Vertiefung geben. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren.
HINWEIS: Beispielsweise befinden sich die sechs in diesem Protokoll getesteten BSA-Digest-Proben in den Vertiefungen A1, B1, C1, D1, A2 und B2. Daher wird der neue Satz von 2,0 ml Rohren in den Bohrlöchern B3, C3, D3, ... Und so weiter. - Beobachten Sie, wie der Roboter 88 μL Proben aus den Vertiefungen in der Tiefbrunnenplatte in den neuen Satz von 2,0 ml Röhrchen überträgt.
HINWEIS: Das übertragene Volumen (1,1 x 80 μL) im Protokoll ist optimiert, um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen der Probe in Pipettenspitzen abgesaugt wird. - Stehen Sie bereit, während der Roboter die Aspirationsgeschwindigkeit der Pipette auf standardisiert und das Magnetmodul abschaltet.
- Trocknen Sie die gereinigten Peptide manuell in einem Vakuumverdampfer (siehe Materialtabelle) und fahren Sie mit Abschnitt 5 fort oder lagern Sie getrocknete Proben bei -20 °C.
4. MS-Probenvorbereitung mit Proteinlysat des menschlichen Herzens (5 mg/ml) mit SP3 paramagnetischen Kügelchen
- Öffnen Sie das SP3_digestion.py Python-Skript und geben Sie die Werte der Variablen im Abschnitt NUR HIER ANPASSEN an.
HINWEIS: Zu den Variablen gehören die Anzahl der Proben und das Replizieren, die Probenkonzentration, das Volumen der Reagenzien (DTT, IAA, Trypsin, Kügelchen, 100% und 80% Ethanol), die DTT- und IAA-Inkubationszeit, die Startspitze für die Pipetten P20 / P50 und P300 und der Beginn in der Deep-Well-Platte auf dem Magnetmodul. - Befolgen Sie die Schritte 2.2-2.23 in Abschnitt 2 für die MS-Probenvorbereitung mit einem einzigen Protein Rinderserumalbumin für die DTT- und IAA-Inkubation. Siehe Abbildung 1 für die Einrichtung des Roboterdecks in diesen Schritten.
- Bereiten Sie eine frische SP3-Perlenmischung (20 μL Perlen pro Reinigungsreaktion) für die Proteinreinigung (gemäß Schritt 3.10) während der DTT- und IAA-Inkubationsschritte (Schritte 2.15 und 2.19) vor. Legen Sie die Perlen in den D6-Brunnen auf das 2-ml-Rohrgestell.
- Stellen Sie sicher, dass das Programm des Roboters mit der Folgenden Meldung angehalten ist: Röhrenkappen öffnen. Lösen Sie die Probenröhrchen manuell im Aluminiumblock oben auf dem Temperaturmodul und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren .
- Stellen Sie sicher, dass der Roboter alle Proben von 2,0 ml Rohren auf eine neue Deep-Well-Platte auf dem Magnetmodul überträgt.
- Überprüfen Sie, ob das Programm des Roboters angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass vorbereitete Perlen in D6 des 2-ml-Rohrracks in Steckplatz 4 geladen wurden, bevor Sie das Protokoll wieder aufnehmen. Öffnen Sie die Perlenröhrenkappe und klicken Sie auf Fortsetzen, um fortzufahren .
- Beobachten Sie, während der Roboter 20 μL Perlen zu jeder Vertiefung in der Tiefbrunnenplatte mit fünf Runden Mischen der Perlen und fünf Runden Mischen der Proben-Perlen-Mischung überträgt.
- Stellen Sie sicher, dass das Programm des Roboters angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass 100 Prozent Ethanol in A3 des 15 ml-50 ml rohrförmigen Racks in Steckplatz 5 geladen wurde, bevor sie das Protokoll wieder aufnehmen. Bereiten Sie 10-20 ml 100% Ethanol (d. h. 200 Proof-Ethanol, siehe Materialtabelle) in einem konischen 50-ml-Rohr vor und legen Sie es in die A3-Vertiefung des Racks. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren.
- Stehen Sie bereit, während der Roboter 140 μL 100% Ethanol in jede Vertiefung in der Platte überträgt, unmittelbar gefolgt von 10 Runden Mischen, um die Bindung der Peptide an die Perlen zu erleichtern.
- Stellen Sie sicher, dass der Roboter jede Probe mischt, indem er 10 Mal pro Runde nach oben und unten pipettet, um insgesamt fünf Runden zu mischen.
- Stehen Sie bereit, während das magnetische Modul eingeschaltet ist und die Proben auf dem Modul für 2 Minuten inkubiert.
- Beobachten Sie, während der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit auf langsam (25 μL/s) ändert und den Überstand aus jeder Vertiefung absaugt und in das Abfallrohr abgibt.
- Warten Sie, bis der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit wieder auf standardisiert und das Magnetmodul abschaltet.
- Stellen Sie sicher, dass das Programm des Roboters angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass 80 Prozent Ethanol in A4 des 15 ml-50 ml rohrförmigen Racks in Steckplatz 5 geladen wurden, bevor sie das Protokoll wieder aufnehmen. Bereiten Sie manuell 20 ml 80% Ethanol vor, indem Sie 4 ml MS-Wasser mit 16 ml 100% Ethanol mischen (d. h. 200 Proof). Legen Sie das 80% Ethanol in die A4-Vertiefung in das Rohrgestell. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren. Stellen Sie sicher, dass der Roboter 1 ml 80% Ethanol in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt.
- Beobachten Sie, wie der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit auf langsam (25 μL/s) ändert, den Überstand aus jeder Vertiefung absaugt und in das Abfallrohr abgibt. Warten Sie, bis der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit wieder auf standardisiert und das Magnetmodul abschaltet.
- Öffnen Sie die Kappe der ABC-Lösung, wenn das Programm des Roboters angehalten wird und die Meldung angezeigt wird: Kappe auf ABC-Rohr öffnen. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren. Stehen Sie bereit, während der Roboter das Magnetmodul ausschaltet, 250 μL ABC in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt.
HINWEIS: In diesem Schritt werden die Proben mit ABC gewaschen. - Stellen Sie sicher, dass der Roboter das Magnetmodul einrastet und Proben auf dem Modul für 2 Minuten inkubiert.
- Beobachten Sie, während der Roboter die Pipettiergeschwindigkeit auf langsam (25 μL/s) ändert und den Überstand von jedem Bohrloch in das Abfallrohr überträgt. Warten Sie, bis der Roboter 100 μL ABC-Puffer in jede Vertiefung überträgt und sofort 10 Mal mischt.
- Stellen Sie sicher, dass das Programm des Roboters angehalten ist und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass neue Sammelrohre in einen 2,0-ml-Aluminiumblock gelegt wurden, bevor Sie das Protokoll wieder aufnehmen. Legen Sie unmittelbar nach dem letzten Probenröhrchen, das sich zunächst im Block befand, einen neuen Satz proteinretenarmer Mikrozentrifugenröhrchen in den Aluminiumblock. Klicken Sie auf Fortsetzen , um fortzufahren. Stehen Sie bereit, während der Roboter jede Probe im ABC-Puffer in die neuen 2,0-ml-Röhrchen überträgt.
HINWEIS: Untersuchen Sie die Vertiefungen und übertragen Sie bei Bedarf die Restproben manuell in die Röhrchen. - Bereiten Sie eine angemessene Menge an MS-Trypsin (10 μL pro Probe) vor, indem Sie 20 μg MS-Trypsin in MS-Wasser auf eine Endkonzentration von 0,2 μg/μL auflösen, wenn das Programm des Roboters angehalten wird und die folgende Meldung anzeigt: Stellen Sie sicher, dass Trypsin (0,2 μg/μL) in C6 des 2-ml-Röhrenracks in Steckplatz 4 geladen wurde, bevor das Protokoll wieder aufgenommen wird. Stellen Sie sicher, dass der Roboter 10 μL Trypsin in jedes Probenröhrchen überträgt, gefolgt von fünf Runden Mischen.
- Wickeln Sie die Probenröhrchenkappen mit Paraffinfolie ein, geben Sie alle Proben in einen temperaturgesteuerten Mischer und inkubieren Sie bei 37 ° C für 16-20 h mit 1.000 U / min Schütteln.
HINWEIS: Die Durchführung der Verdauung mit 1.000 U / min Schütteln wird empfohlen, um die Ausfällung der Perlen während der nächtlichen Inkubation zu minimieren.
5. Peptidreinigung mit paramagnetischen SP3-Kügelchen
- Befolgen Sie die schrittweisen Anweisungen in Schritt 2, Peptidreinigung mit paramagnetischen SP3-Perlen.
6. Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie
- Resuspendieren Sie die BSA (Schritte 2-3) und Herzlysat (Schritt 4) Peptide in 0,1% Ameisensäure durch Zugabe von 1 ml LC-MS-Klasse 99% Ameisensäure in MS-Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 L.
VORSICHT: Ameisensäure ist eine starke Säure. Es ist sehr ätzend für die Augen, die Haut und die Atemwege. Vorsichtig unter einer chemischen Kapuze handhaben und PSA tragen. - Quantifizieren Sie die Post-Digest-Peptidkonzentration mit einem quantitativen Peptid-Assay-Kit17 und injizieren Sie 0,5 μg BSA-Digest und 1,5 μg Herz-Digest für die LC-MS/MS-Analyse.
- Richten Sie das Flüssigkeitschromatographieprogramm für die LC-MS/MS-Analyse ein.
HINWEIS: In einem typischen Aufbau können Peptid-Digests unter Verwendung der in Ergänzungsdatei 2 angegebenen Parameter auf eine C18-Säule mit umgekehrter Phase (3 μm Partikel; 100 Å Pore; 75 μm x 150 mm; siehe Materialtabelle) geladen werden. - Erfassen Sie Schrotflintenproteomikdaten mit einem Massenspektrometer (siehe Materialtabelle) unter Verwendung der in der Ergänzungsdatei 3 angegebenen Parameter.
- Durchsuchen Sie die Proteindatenbank nach Proteinidentifikation.
- Laden Sie die erforderliche Software MaxQuant herunter und installieren Sie sie.
HINWEIS: Die MaxQuant-Software (v.1.6.10.43) wurde hier für die folgenden Schritte verwendet (siehe Materialtabelle). - Laden Sie die kuratierte Humanproteom-Datenbank aus einer hochwertigen Proteinsequenzdatenbank (UniProt/SwissProt) herunter (siehe Materialverzeichnis). Klicken Sie auf die Schaltfläche Download und wählen Sie FASTA (canonical) aus.
HINWEIS: Laden Sie optional FASTA (nicht kanonisch) herunter, um bei Bedarf Proteinisoformen jedes Gens in die Datenbank aufzunehmen. - Geben Sie in der MaxQuant-Softwareoberfläche die FASTA-Datei an, die als Proteindatenbank verwendet werden soll, indem Sie zum Bereich Globale Parameter navigieren und auf die Registerkarte Sequenzen klicken. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Hinzufügen , um den Dateipfad zur FASTA-Datei anzugeben.
- Geben Sie in der MaxQuant-Softwareoberfläche die zu analysierenden rohen Massenspektrumdateien an, indem Sie zum Raw Data-Bedienfeld gehen, auf die Schaltfläche Load klicken und die RAW-Datei(en) auswählen.
- Richten Sie suchparameter wie in Tabelle 1 dargestellt ein. Aktivieren Sie bei Bedarf die markierungsfreie Quantifizierung (LFQ).
- Warten Sie, bis die Suche abgeschlossen ist, und suchen Sie die Anzahl der Peptidspektrumübereinstimmungen (PSMs), die die FDR-Schwellenwerte von 1% in der Datei msms.txt im Ordner /combined/txt überschreiten.
HINWEIS: In den Vergleichen, die hier für den repräsentativen Ergebnisabschnitt durchgeführt wurden, wurden PSMs, die mehreren Proteinen zugeordnet waren, herausgefiltert, und PSMs, die einem einzigartigen Protein zugeordnet waren, wurden beibehalten, um die Anzahl der PSMs, Peptide und Proteine zu zählen (Abbildung 4 und Abbildung 5).
- Laden Sie die erforderliche Software MaxQuant herunter und installieren Sie sie.
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Representative Results
Hier werden drei Python-Skripte bereitgestellt, die mit dem OT-2-Roboter kompatibel sind und die Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie-Proteomik mit einem einzigen Proteinstandard-Rinderserumalbumin (technische Replikate n = 5 Aufschlüsse) und einer waschmittelhaltigen menschlichen Herzlysatprobe (n = 5 Verdauungen) durchführen. Jedes Verdauungsprodukt ist in zwei Peptidreinigungsreaktionen unterteilt. Die Anzahl der identifizierten Peptidspektrumübereinstimmungen (PSMs), Peptide und Proteine in jedem Durchlauf der BSA- und Herzproben ist in Abbildung 4 und Abbildung 5 dargestellt. Ein Median von 728 PSMs und 65 Peptiden wurde mit der BSA-Probe identifiziert, mit 5,2% bzw. 3,2% Variationskoeffizienten (CV). Mit der komplexen Herzprobe wurde ein Median von 9.526 PSMs, 7.558 Peptiden und 1.336 Proteinen in 10 Durchläufen mit einem Variationskoeffizienten von 7,6%, 5,9% und 3,6% identifiziert. Insgesamt wurden 1.935 Proteine aus 10 Läufen der Herzprobe identifiziert, und unter diesen wurden 1.677 Proteine in zwei oder mehr Durchläufen identifiziert. Um die Variabilität der Peptidquantifizierung zu bestimmen, wurde der CV der extrahierten Ionenchromatogrammintensitäten (XIC) für 10 Peptide berechnet, die einem einzigartigen Protein zugeordnet waren (Tabelle 2). Die Variabilitäten der experimentellen Ergebnisse von Mensch (handpipettet) und Robotern bei der Messung der Proteinkonzentration wurden unter Verwendung von drei Proteinstandardproben mit dem BCA-Assay weiter verglichen. Der durchschnittliche CV (7,57%) des Roboter-BCA-Assays war niedriger als der des manuellen BCA-Assays für Menschen (9,22%) (ergänzende Tabelle 1).
Das beschriebene Protokoll zeigte eine konsistente Leistung im Laufe der Zeit, wenn das BSA-Verdauungsprotokoll im Abstand von 2 Monaten durchgeführt wurde und vergleichbare Ergebnisse lieferte. Die mediane Anzahl der eindeutigen PSMs und Peptide in Abbildung 2 beträgt 728 bzw. 65. Die gleichen Experimente, die 2 Monate zuvor am OT-2-System durchgeführt wurden, erzeugten durchschnittlich 647 PSMs und 54 Peptide (n = 2) (Ergänzende Tabelle 2). Die längerfristige Stabilität kann ähnlich geschätzt werden.
Die manuelle Laborbearbeitungszeit (Inkubationszeit nicht inbegriffen) wird zwischen dem Roboterprotokoll und der menschlichen Verarbeitung18 pro Probenvorbereitung berechnet. Mit dem Verdauungsprotokoll ohne Waschmittelentfernung gefolgt von der Peptidentsalzung beträgt die manuelle Verarbeitungszeit 41 minuten mit dem Robotersystem gegenüber 61 Minuten von Hand. Bei der Entfernung von Reinigungsmitteln, der Verdauung und dem Peptidentsalzungsprotokoll beträgt die manuelle Verarbeitungszeit mit dem Robotersystem 54 Minuten gegenüber 79 Minuten von Hand. Daher reduziert das halbautomatische Protokoll etwa 20-25 Minuten praktische Bearbeitungszeit pro Probe. Diese Zeitverkürzung wird beträchtlich, wenn viele Proben verarbeitet werden, und kann durch den parallelen Einsatz mehrerer OT-2-Roboter weiter verbessert werden.
Abbildung 1: Schematischer Workflow. Proteine, die mit Waschmittel extrahiert werden, müssen vor der Verdauung mit einem zusätzlichen Schritt der Waschmittelentfernung verarbeitet werden. Proteinproben werden verdaut und Peptide auf dem OT-2-Robotersystem entsalzt. Die Peptidverdauungen werden in ein Q-Exactive HF-Massenspektrometer injiziert, das mit einem Nano-LC gekoppelt ist. MS-Spektren werden anhand einer Proteindatenbank zur Proteinidentifizierung durchsucht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Roboterdeck für die Proteinverdauung eingerichtet. Die angegebenen Positionen von Spitzengestellen, Proben, Müll, Temperaturmodul und Magnetmodul werden angezeigt. Sternchen bezeichnen Laborwaren und Reagenzien, die nur für das Verdauungsprotokoll mit Waschmittelentfernungsschritten benötigt werden. Boxen mit Zahlen bezeichnen unbesetzte Deckpositionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Roboterdeck für das Peptid-Bereinigungsskript eingerichtet. Die angegebenen Positionen von Spitzengestellen, Proben, Papierkorb und Magnetmodul werden angezeigt. Boxen mit Zahlen bezeichnen unbesetzte Deckpositionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Anzahl der Peptid-Spektrum-Matches (PSMs) und Peptide, die bei den Verdauungen von BSA-Protein nachgewiesen wurden (n = 5). Jeder Digest wurde für technische Replikationspeptid-Aufräumarbeiten in zwei Teile geteilt (R1 und R2). Variationskoeffizient: 5,2 % für PSMs; 3,2% für Peptide. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Anzahl der PSMs, Peptide und Proteine, die aus einem menschlichen Herzlysat identifiziert wurden. Fünf Verdauungen wurden mit SP3-Reinigungsmittelentfernung durchgeführt. Jeder Digest wurde für Peptidreinigungen in zwei Teile aufgeteilt (R1 und R2). Variationskoeffizienten: 7,6 % für PSMs; 5,9% für Peptide; 3,6% für Proteine. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Verdauungsenzym | Trypsin/P |
| Maximal verpasstes Dekolleté | 2 |
| Feste Änderung | Carbamidomethylierung von Cystein |
| Variable Modifikation | N-terminale Proteinacetylierung; Oxidation von Methionin |
| Peptidlängenbereich | 7 – 25 aa |
| Massentoleranz des Vorläufers | ± 4,5 S./Min. |
| Massentoleranz von MS/MS-Ionen | ± 20 Seiten pro Minute |
| Markierungsfreie Quantifizierung | LFQ |
| False Discovery Rate (FDR) für Peptid-Spektrum-Match (PSM) | 0.01 |
Tabelle 1: Die Suchparameter der Peptiddatenbank (MaxQuant).
| Peptid | Protein-ID | PEP | Mediane XIC-Intensität | CV | |
| LSTSQIPQSQIR | Q92523 | 7.72E-08 | 1.96E+07 | 6.70% | |
| SEDFSLPAYMDR | Nr. P13073 | 9.64E-17 | 8.05E+08 | 7.30% | |
| YLQEIYNSNNQK | Nr. P02679 | 2.76E-23 | 9.69E+08 | 7.60% | |
| TDDCHPWVLPVVK | Nr. P17174 | 4.51E-14 | 4.60E+08 | 8.60% | |
| VIVVGNPANTNCLTASK | Nr. P40925 | 7.90E-29 | 1.17D+09 | 8.70% | |
| DYIWNTLNSGR | O75390 | 1.63E-15 | 1.38E+08 | 8.80% | |
| VSVPTHPEAVGDASLTVVK | Nr. P13611 | 1.86E-09 | 6.77E+07 | 9.10% | |
| QVAEQFLNMR | Nr. P22695 | 3.25E-08 | 1.09E+08 | 9.30% | |
| NTFWDVDGSMVPPEWHR | Q9UI09 | 2.05E-11 | 4.00E+07 | 9.60% | |
| SASDLTWDNLK | Nr. P02787 | 5.29E-11 | 1.92E+09 | 9.80% | |
Tabelle 2: Extraktionschromatogramm (XIC) Intensitätsquantifizierung von 10 Peptiden.
Ergänzende Tabelle 1: Vergleich von manuellen und automatisierten BCA-Assays. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Tabelle 2: Der BSA-Aufschluss wurde 2 Monate im Abstand von den in Abbildung 4 verarbeiteten Proben durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Ergänzende Datei 1: Eine Kopie der entwickelten Python-Skripte. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: Methodenparameter für das Flüssigkeitschromatographie-Programm zur LC-MS/MS-Analyse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 3: Methodenparameter für den Erwerb von Shotgun-Proteomik-Daten mit einem Massenspektrometer. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls
Für die beste Leistung sollten von Opentrons verifizierte Laborgeräte, Module und Verbrauchsmaterialien verwendet werden, die mit OT-2 kompatibel sind. Benutzerdefinierte Labware kann nach den Anweisungen von Opentrons unter Reference14 erstellt werden. Stellen Sie sicher, dass Sie das OT-2-Deck, die Pipetten und das Labormaterial kalibrieren, wenn Sie es zum ersten Mal verwenden. Es ist auch wichtig, die Richtlinien des Herstellers von SP3-Perlen zu befolgen, um Perlen für die Peptid- und Proteinreinigung vorzubereiten. Insbesondere muss während der Perlen- und Peptidbindungsreaktion das Volumen von Acetonitril in der Bindungsreaktion ≥95% und die Perlenkonzentration ≥0,1 μg / μL betragen. Halten Sie die Peptidkonzentration im Bereich von 10 μg / ml-5 mg / ml. Mit den optimierten Parametern im Peptid-Clean-up-Skript beträgt das Acetonitril-Volumenverhältnis 95%, die Perlenkonzentration 0,37 μg/μL und die Peptidkonzentration liegt im Bereich von 14-37 μg/ml. Die Masse der Peptide wird nach unserer Erfahrung auf 40-100 μg in 100 μL Verdauungsreaktion geschätzt. Für die SP3-Proteinreinigung wurden 5-10 μg Perlen bis 1 μg Protein verwendet und sichergestellt, dass die minimale Perlenkonzentration während der Proteinbindung 0,5 μg/μL beträgt. Die empfohlene Proteinkonzentration liegt im Bereich von 10 μg/ml-5 mg/ml. Mit dem Standardparameter im mitgelieferten Skript wird 1 mg Perlen für 100 μg Protein verwendet, und die Perlenkonzentration während der Bindung beträgt 3,75 μg / μL, während die Proteinkonzentration 0,35 mg / ml beträgt.
Änderungen und Fehlerbehebung
Die Standardvariablen in den Python-Skripten sind für Standard-Workflows in unserem Labor optimiert. Benutzer müssen die Variablen anpassen, um die Skripte bei Bedarf mit ihren Anwendungen kompatibel zu machen. Wenn eine niedrige MS-Intensität beobachtet wird, überprüfen Sie den Protein- oder Peptidverlust nach jedem signifikanten Protokollabschnitt mit dem Protein-BCA-Assay und dem quantitativen Peptid-Assay. Wenn Sie das Protokoll zum ersten Mal auf OT-2 verwenden, beobachten Sie die Roboterhandhabung für jeden Schritt, um sicherzustellen, dass der Roboter die Verfahren wie erwartet ausführt. Zum Zeitpunkt des Schreibens ist die elektronische Pipette P50 nicht mehr im Opentrons Store erhältlich. Das aktuelle Skript wurde geändert, um anzugeben, wo die P20-Pipette an ihrem Platz verwendet werden kann. Benutzer können sich an die Opentrons-API wenden, um die Skripte zu ändern, um bei Bedarf andere Pipetten zu verwenden.
Einschränkungen der Technik
Trotz der Vorteile der Verwendung eines Roboter-Liquid-Handling-Systems ist bei der Durchführung des Flüssigkeitstransfers zwischen technischen Replikaten Vorsicht geboten. Die Überwachung des Roboters während der Ersteinrichtung und der Liquid-Handling-Schritte wird dringend empfohlen. Nach dem Roboter-Flüssigkeitstransfer kann eine manuelle Rückgewinnung von Restvolumina erforderlich sein, um Probenverluste zu vermeiden und Variabilitäten zu reduzieren.
Bedeutung gegenüber bestehenden Methoden
Dieses Protokoll beschreibt eine halbautomatische massenspektrometriebasierte Probenvorbereitungsmethode mit dem kostengünstigen und Quell-Liquid-Handling-Roboter OT-2. In jüngster Zeit haben auch andere Arbeiten begonnen, OT-2 für Proteomik-Anwendungen zu verwenden11. Im Vergleich zu bestehenden Methoden gehören zu den Unterscheidungsmerkmalen dieses Protokolls die Verwendung eines relativ kostengünstigen, Python-programmierbaren Roboters; die Aufnahme halbautomatischer SP3-Kügelchen in zwei Schritten in die Probenvorbereitungsprotokolle, nämlich den Schritt zur Entfernung von Proteinprobenwaschmitteln und den Schritt zur Entsalzung/Reinigung von Peptiden; sowie die Verfügbarkeit von Open-Source-Python-Skripten zur Unterstützung der Weiterentwicklung. SP3 Paramagnetische Kügelchen binden Proteine und Peptide effizient und wurden mit automatisierten Liquid-Handling-Systemen für Anwendungen in der Proteinreinigung/Waschmittelentfernung vor dem enzymatischen Aufschluss in der MS-Probenvorbereitung gekoppelt11,13.
Drei Open-Source-Python-Skripte werden zusammen mit diesem Protokoll den Forschern zur Verfügung gestellt. Die Skripte sind an individuelle experimentelle Bedingungen (z.B. Probennummer, Replikationsnummer, Inkubationstemperatur und -zeit, etc.) anpassbar und ermöglichen die Weiterentwicklung für modifizierte Workflows. Die Protokolle lieferten hervorragende technische Lebensläufe von 3%-6% in der Anzahl der Peptide und/oder Proteinidentifikation zwischen MS-Läufen in unserem Labor, vergleichbar mit früheren Arbeiten an anderen Liquid-Handling-Systemen (<20%)9,11.
Zukünftige Anwendungen
Dieses Protokoll demonstriert den Nutzen eines kostengünstigen programmierbaren Liquid-Handling-Systems in Verbindung mit SP3-Kügelchen für die halbautomatische Proteomik-Probenvorbereitung, das potenziell auf Massenspektrometrielabore und Kernanlagen anwendbar sein kann, um die Effizienz der Probenverarbeitung zu verbessern.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Konflikte zu erklären.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil durch die NIH-Auszeichnungen F32-HL149191 an YH unterstützt; R00-HL144829 bis EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 zu MPL. Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 werden mit Hilfe eines webbasierten Wissenschaftsillustrationstools erstellt, BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
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