Summary
Detaljert protokoll og tre Python-skript er gitt for å betjene et åpen kildekode robotisert væskehåndteringssystem for å utføre halvautomatisk proteinprøvepreparering for massespektrometriforsøk, som dekker fjerning av vaskemiddel, protein fordøyelse og peptidavsaltingstrinn.
Abstract
Massespektrometribaserte hagleproteomiske eksperimenter krever flere prøveprepareringstrinn, inkludert enzymatisk proteinfordøyetid og opprydding, som kan ta opp betydelige persontimer med benkarbeid og presentere en kilde til batch-til-batch-variasjon. Laboratorieautomatisering med pipetteringsroboter kan redusere manuelt arbeid, maksimere gjennomstrømningen og øke forskningens reproduserbarhet. Likevel gjør de bratte startprisene på standard automatiseringsstasjoner dem uoverkommelige for mange akademiske laboratorier. Denne artikkelen beskriver en arbeidsflyt for proteomikkprøveforberedelse ved hjelp av et rimelig automatiseringssystem med åpen kildekode (Opentrons OT-2), inkludert instruksjoner for å sette opp halvautomatisk proteinreduksjon, alkylering, fordøyelse og oppryddingstrinn; i tillegg til å følge open source Python-skript for å programmere OT-2-systemet gjennom applikasjonsprogrammeringsgrensesnittet.
Introduction
Massespektrometribasert hagleproteomikk er et kraftig verktøy for å måle overflod av mange proteiner i biologiske prøver samtidig. Proteomiske eksperimenter med bioinformatikkanalyse brukes rutinemessig til å identifisere biomarkører og oppdage tilhørende biologiske komplekser og veier som ligger til grunn for patologiske mekanismer. Med sin høye analyttspifisitet og potensielle kvantitative nøyaktighet har hagleproteomikk også utmerket potensial til å bli vedtatt av forskningsfasiliteter og diagnostiske laboratorier for klinisk prøveanalyse uten å måtte stole på antistoffer1,2.
For å forberede proteinprøver for hagleproteomikkanalyse, må proteiner som ekstraheres fra biologiske prøver (f.eks. celler og vev) vanligvis først behandles ved hjelp av lange protokoller, inkludert måling av prøveproteinkonsentrasjon, proteinreduksjon og alkylering og enzymatisk fordøyelse i peptider. Videre krever proteiner ekstrahert i vanlige lysisbuffere som inneholder vaskemidler ofte ytterligere trinn for bufferutveksling eller fjerning av vaskemiddel før analyse fordi vaskemiddel kan forstyrre trypsin fordøyelsen og betydelig forringe ytelsen til nedstrøms væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) analyse3. Peptider blir vanligvis ytterligere desalted, tørket og rekonstituert i LC-MS/MS-kompatible løsningsmidler etter enzymatisk fordøyelse. Disse proteinbiokjemiprosedyrene kan være arbeidskrevende og tidkrevende. Dermed fortsetter de å begrense gjennomstrømningen av proteomiske arbeidsflyter og bidra til variasjonen av innsamlede data4,5. Menneskelige feil og skjevheter har blitt anerkjent som avgjørende faktorer som påvirker datavariasjon og reproduserbarhet6,7. For å minimere menneskelige feil i arbeidsflyter for prøvepreparering av massespektrometri, har automatiserte pipetteringsrobotsystemer blitt brukt til å forbedre gjennomstrømningen og reproduserbarheten av proteinidentifikasjon og kvantifisering fra hagleproteomikk og målrettet massespektrometrianalyse, der slike fremskritt har blitt hyllet som avgjørende for å fortsette presset for utbredt bruk av proteomikkteknologier i kritisk forskning og kliniske innstillinger8, 9,10,11,12,13. Imidlertid bruker de fleste eksisterende protokoller robotiserte væskehåndteringsplattformer som krever betydelige investeringer og opplæring, begrenser deres nytte i mange laboratorier i fagmiljøet eller på annen måte med et begrenset budsjett.
Denne artikkelen beskriver en protokoll som bruker et rimelig robotbasert væskehåndteringssystem med åpen kildekode, OT-2, for å halvautomatere en typisk arbeidsflyt for klargjøring av hagleproteomikk. OT-2 har en lavere kostnad enn mange andre robotiserte væskehåndteringssystemer, og koster i skrivende stund omtrent $ 5,000 amerikanske dollar. Når du tar hensyn til prisene på forskjellige moduler og labware, er den totale kostnaden for å sette opp eksperimenter i denne protokollen i skrivende stund rundt $ 10,000, noe som gjør det rimeligere for et betydelig bredere sett med laboratorier over dyrere alternativer. OT-2 er kompatibel med åpen kildekode-programmering gjennom Python-skript og gir stor fleksibilitet i brukerdefinert DIY-protokolldesign. Ved hjelp av tre interne utviklede skript, protokollene nedenfor dekke utføre en typisk hagle proteomics prøve forberedelse arbeidsflyt på OT-2 stasjonen med en arketypisk protein standard (bovine serum albumin; BSA) og en kompleks proteinprøve av et normalt menneskehjertelys (figur 1). Prosedyrene for behandling (1) en BSA-prøve og (2) en kompleks hjertelysprøve er beskrevet i protokolldelene henholdsvis 1, 2, 5, 6 og 3, 4, 5, 6. Sera-Mag karboksylatmodifiserte magnetiske perler brukes i en-pot solid-fase-forbedret prøvepreparering (SP3) for å fjerne vaskemidler og salter i protein- og peptidprøvene. Tryptiske fordøyer fra bovint serumalbumin og humane hjerteproteiner rengjøres ytterligere av SP3-perler og sendes inn for LC-MS /MS-analyse. Massespektra analyseres deretter ved hjelp av MaxQuant-programvaren for peptid og proteinidentifikasjon. Representative resultater utført av oss viser at protokollen oppnår gode tekniske variasjonskoeffisienter (CV) samtidig som benktiden spares og ikke er dårligere enn håndfordøyd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De utviklede Python-skriptene er deponert på GitHub på: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. En kopi av skriptene er gitt i Tilleggsfil 1. Se GitHub-repositoriet for de nyeste versjonene.
1. Eksperimentelle preparater
- Kontroller den nødvendige maskinvaren før du starter protokollen.
MERK: Følgende maskinvarekomponenter kreves: OT-2 pipetter, pipettespisser, 4-i-1 rørstativsett, aluminiumsblokksett, magnetisk modul, temperaturmodul, 96-brønns 2 ml dype brønnplater (se Materialtabell).
2. Prøvepreparering av massespektrometri (MS) med et enkelt protein bovint serumalbumin (BSA)
- Åpne NoSP3_digestion.py skriptet i et tekstredigeringsprogram, og angi de eksperimentspesifikke variablene etter behov i delen TILPASS BARE HER.
MERK: De eksperimentspesifikke variablene inkluderer antall prøver og replikering; prøvekonsentrasjonen; volumet av reagenser dithiothreitol - DTT, iodoacetamid - IAA, og trypsin; DTT- og IAA-inkubasjonstiden og startspissen for pipetten P20/P50 og P300).- Åpne Opentrons-appen og last opp skriptet til PROTOKOLL-fanen i Opentrons-appen.
MERK: Opentrons-appen kan lastes ned fra Referanse14 til en lokal datamaskin. I skrivende stund er opentrons P50 elektronisk pipette utilgjengelig for kjøp i Opentrons-butikken. Den er erstattet med P20 enkanals elektronisk pipette som er kompatibel med volumene som er angitt i protokollen. Det er laget notater og instruksjoner i skriptet for å erstatte P50-pipetten med P20-pipetten. Brukere må kanskje teste og bekrefte pipettens kompatibilitet med denne protokollen ved å følge Opentrons API-instruksjon.
- Åpne Opentrons-appen og last opp skriptet til PROTOKOLL-fanen i Opentrons-appen.
- Åpne ROBOT-fanen og utfør kalibrering av robotdekk Calibrate Deck i ROBOT-fanen ved å følge de trinnvise instruksjonene på skjermen i Opentrons-appen.
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis det ikke tidligere er implementert eller roboten nylig har blitt omplassert. - Klikk på MANAGE PIPETTES-knappen for å utføre kalibrering av spisslengde, etterfulgt av pipetteforskyvningskalibrering for å kalibrere standardspiss- og pipettekombinasjonsposisjon.
MERK: Dette trinnet er nødvendig hvis en pipette brukes for første gang. - Plasser de nødvendige labware- og pipettene på tilsvarende sted i OT-2-kortstokken som er angitt i Python-skriptet (figur 2).
MERK: Kontroller at temperaturmodulen er koblet til og slått på, og at aluminiumsblokken er plassert på toppen av temperaturmodulen. - Åpne CALIBRATE-fanen og utfør kalibrering for kombinasjonen av labware og pipetter som kreves i dette pythonskriptet.
MERK: Opentrons-appen registrerer kalibreringsparametrene, noe som ikke er nødvendig for fremtidige applikasjoner med samme labware og pipetter. - Forbered 5 ml 100 mM ammoniumbikarbonat (ABC) (pH ~ 8,0) oppløsning ved å oppløse 39,53 mg ABC i massespektrometri-grade vann til et totalt volum på 5 ml i et 15 ml konisk rør. Plasser ammoniumbikarbonatbufferen i A1-brønnen på 4-i-1-rørstativet med rørholderen på 15 ml + 50 ml.
- Forbered 1 ml bovint serumalbumin (BSA) protein i et 2,0 ml protein lavbindingsrør (se Tabell over materialer). Plasser prøven i A1-brønnen på 4-i-1-rørstativet med 2 ml rørholdertopp.
- Plasser manuelt 2,0 ml proteinfat i brønnene til A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, etc. i aluminiumsblokken på toppen av temperaturmodulen.
MERK: Robotpipetten dispenserer prøver i vertikal rekkefølge fra A1 (første prøve) til den siste prøven som standard. Horisontal dispensering kan angis. Se15 hvis du vil ha mer informasjon. Det totale antallet rør som må utarbeides, bør være lik det totale antallet prøver (dvs. antall biologiske prøver multiplisert med antall tekniske repliker per prøve). - Forbered 1 ml 60 mM DTT ved å oppløse 9,26 mg DTT faste stoffer i massespektrometri klasse vann til et totalt volum på 1 ml. Plasser DTT i A6-brønnen på 4-i-1 rørstativet med 2 ml rørholder topp.
FORSIKTIG: DTT er skadelig for menneskelige øyne, hud og luftveiene. Bruk verneutstyr og håndter det under en kjemisk hette. Se produsentens sikkerhetsdatablad for riktige prosedyrer. - Vær oppmerksom på at roboten overfører et passende volum ABC-buffer til prøverørene i aluminiumsblokken.
MERK: Det totale volumet av ABC og proteinblanding i hvert rør er 100 μL, og volumet av ABC-buffer beregnes i skriptet (V = 100 μL minus volumet på 100 μg proteinprøve). - Forsikre deg om at roboten overfører 100 μg BSA-protein til hvert rør med ABC-buffer.
MERK: Et typisk eksperiment kan bruke opptil 100 μg proteiner til proteinfordøyelse, det vil si 50 μL 2,0 μg/μL for denne BSA-prøven. - Kontroller manuelt at robotprogrammet er satt på pause og viser meldingen: Kontroller at DTT er lastet inn i A6 på 2 ml rørstativet i spor 4 før du gjenopptar protokollen. Pass på at et DTT-rør er plassert i A6-brønnen og åpne hetten. Klikk på Fortsett-knappen i Opentrons-appen for å fortsette. Forsikre deg om at roboten overfører 10 μL DTT-løsning til hver prøvebrønn, etterfulgt av fem blanderunder.
- Kontroller at robotprogrammet er satt på pause og viser meldingen: Sørg for å lukke hettene på prøverørene. Lukk hettene på rørene manuelt og klikk på Fortsett for å fortsette. Vent til robotens temperaturmodul begynner å varme opp aluminiumsblokken til temperaturen når 55 °C, etterfulgt av en 5 min inkubasjon slik at prøvene kan komme til 55 °C.
MERK: Roboten vil holde temperaturen på 55 °C i 30 minutter for å tillate proteinreduksjon med DTT under inkubasjon. - I løpet av 30 min DTT inkubasjon, forberede 1 ml av 187,5 mM Iodoacetamid (IAA) ved å oppløse 34.68 mg av IAA i ABC buffer til et totalt volum på 1 ml. Pakk IAA-løsningen manuelt inn med aluminiumsfolie for å unngå eksponering for lys.
FORSIKTIG: IAA kan forårsake alvorlig øye- og respirasjonsirritasjon. Håndter den under en kjemisk hette med riktig verneutstyr. - Forsikre deg om at robotens temperaturmodul avkjøles når du har fullført 30 min DTT inkubasjonstrinn.
MERK: Etter at modulens temperatur når 22 °C, opprettholder modulen temperaturen i 5 minutter slik at prøvene kan avkjøles helt. - Ta av prøverørene når robotens program er satt på pause og vis advarselsmeldingen: Sørg for å åpne hetter på prøverør. Klikk fortsett for å fortsette.
- Kontroller manuelt at robotens program er satt på pause med en advarsel: Kontroller at IAA er lastet inn i B6 på 2 ml rørstativet i spor 4 før du gjenopptar protokollen. Bekreft rackplasseringen til IAA-røret og åpne rørhetten. Klikk fortsett for å fortsette. Forsikre deg om at roboten overfører 10 μL IAA til hvert prøverør etterfulgt av fem blanderunder.
- Cap prøverørene når robotens program er satt på pause og vis meldingen: Lukk hettene på prøverør og dekk prøverør med folie. Dekk hele aluminiumsblokken med et rent stykke folie. Klikk fortsett for å fortsette. Vent til prøvene inkuberes ved 22 °C i 30 minutter. Forsikre deg om at robotens temperaturmodul deaktiveres når IAA-inkubasjonen er fullført.
- Forbered en blanding av trypsinoppløsning under IAA-inkubasjon (trinn 2.19) ved den endelige konsentrasjonen på 0,2 μg/μL: løs opp 20 μg massespektrometri/sekvenseringsgrad trypsin i 100 μL MS-grade vann.
- Plasser trypsinløsningen i C6-brønnen på 2 ml rørstativet med rørdekselet åpent når robotens program er satt på pause og viser advarselen: Kontroller at trypsin er lastet inn i C6 på 2 ml rørstativet som er plassert i spor 4 før du gjenopptar protokollen. Klikk fortsett for å fortsette.
- Kontroller at robotens program er satt på pause og viser advarselen: Åpne hettene på prøverørene på temperaturmodulen. Fjern merket for prøverørene og klikk på Fortsett for å fortsette. Vær klar mens roboten overfører 10 μL trypsin til hvert prøverør etterfulgt av fem blanderunder.
- Pakk prøverørhettene med parafinfilm, overfør alle prøver til en temperaturkontrollert mikser og inkuber ved 37 °C i 16-20 timer med 600 o/min risting.
MERK: Trypsin fordøyelsen kan også utføres direkte på temperaturmodulen ved 37 °C.
3. Peptid opprydding ved hjelp av SP3 paramagnetiske perler
- Neste dag etter fordøyelsen av trypsin over natten, kan du kort spinne prøvene ved hjelp av en mikrosentermikrosenter på benken (≤2000 x g) (se Materialtabell) og plassere prøvene på et magnetisk rørstativ. La prøvene stå i 2 min.
- Overfør supernatanten forsiktig med en pipette til et nytt sett med protein lavbindings mikrosenterrør. Oppbevar prøvene i kjøleskap og fortsett til trinn 3.2-3.9.
MERK: Oppbevar prøvene ved -80 °C ved langvarig lagring.
- Overfør supernatanten forsiktig med en pipette til et nytt sett med protein lavbindings mikrosenterrør. Oppbevar prøvene i kjøleskap og fortsett til trinn 3.2-3.9.
- Åpne SP3_peptide_cleanup.py Python-skriptet i et tekstredigeringsprogram, og angi etter behov i delen TILPASS BARE HER.
MERK: De eksperimentspesifikke variablene inkluderer antall prøver og replikeringer, volumet av peptider som skal overføres, volumet av reagenser (perler, acetonitrile, DMSO), startspissen for P20/P50- og P300-pipetter, og starter godt i dypbrønnplaten på magnetmodulen. Hver BSA-fordøyelsesprøve inneholder omtrent 120 μL fordøyelsesvolum, som vil bli aliquoted i to tekniske repliker med 55 μL i hver replikering. Hvis du bare vil rydde opp i halvparten av sammendraget, endrer du variabelen for replikeringsnummer til 1. - Last opp skriptet til KATEGORIEN PROTOKOLL i Opentrons-appen .
- Plasser nødvendig labware og pipetter på tilsvarende sted i OT-2-aggregatet som er angitt i Python-skriptet (figur 3). Kontroller at den magnetiske modulen er slått på og koblet til roboten. Plasser en ny 2 ml 96-brønns dyp brønnplate (se Materialbord) på toppen av magnetmodulen.
- Åpne CALIBRATE-fanen og utfør kalibrering for kombinasjonen av labware og pipetter som kreves i dette Python-skriptet.
MERK: Kalibrering for de samme labware- og pipettekombinasjonene trenger bare å utføres én gang, og Opentrons-appen registrerer kalibreringsparametrene. - Plasser de fordøyde prøvene (supernatant samlet i trinn 3.1) til 2.0 ml rørstativ i vertikal rekkefølge i brønnene A1, B1....
- Forbered 15 ml LC-MS/MS-kompatibel acetonitril i et konisk rør på 50 ml og plasser røret i brønn A3 i rørstativet 4-i-1 med rørholderen på 15 ml + 50 ml.
- Forbered 5 ml 2 % DMSO ved å tilsette 100 μL DMSO med 4,9 ml massespektrometri-gradert vann i et konisk rør på 15 ml. Plasser røret i brønn A1 i rørstativet på 15 ml + 50 ml.
- Merk et tomt konisk rør på 50 ml som avfall, og plasser det i brønnen B3 i rørstativet på 15 ml + 50 ml.
- Klargjør SP3-perlene etter Referanse16.
- Forbered en passende mengde blandede perler i et 2,0 ml mikrosenterrør.
MERK: Hver peptidoppryddingsreaksjon krever 10 μL blandede perler. For eksempel, lag minst 40 μL blandede perler for fire oppryddingsreaksjoner. - La perleblandingen sitte på det magnetiske stativet i 2 min. Fjern supernatanten forsiktig med en pipette og mål volumet av supernatanten med en pipette.
- Beregn det gjenværende volumet av perler og tilsett 5-10 ganger massespektrometri klasse vann (f.eks. 100-200 μL vann for 20 μL perler) og virvel (hastighet 10) i 10 s. Sitt perlene på det magnetiske stativet i 2 min.
- Gjenta vannvasktrinnene for totalt tre vasker.
- Resuspend de endelige perlene i MS-grade vann til en endelig konsentrasjon på 50 μg / μL. Plasser de vaskede magnetiske perlene i brønnen A6 i 2,0 ml rørstativet.
MERK: Perlene anbefales å resuspendere i en konsentrasjon på 10 μg/μL16. I den nåværende optimaliseringsinnsatsen ble den endelige konsentrasjonen endret til 50 μg / μL for å minimere det totale volumet av bead-peptid-acetonitrilblandingen.
- Forbered en passende mengde blandede perler i et 2,0 ml mikrosenterrør.
- Påse at roboten overfører 55 μL av de fordøyde prøvene til brønnene i dypbrønnplatene på magnetmodulen.
- Kontroller at robotprotokollen er satt på pause og viser meldingen: Kontroller at klargjorte perler er lastet inn i A6 på 2 ml rørstativet i spor 4 før du gjenopptar protokollen. Virvel perlene, og deretter kort spinn ned i 5 s på en mini benk topp sentrifuge og plasser perlene i A6-brønnen på 2 ml rørstativet med hetten åpen. Vær klar mens roboten blander perlene 10 ganger i fem runder ved å pipettere opp og ned.
MERK: Roboten overfører 10 μL perler til hver fordøyd prøve i dypbrønnplatene etterfulgt av fem ganger blanding. - Forsikre deg om at roboten overfører 1292 μL acetonitril til hver brønn og umiddelbart blander 10 ganger ved å pipettere opp og ned for å lette peptider og perlerbinding.
MERK: Hver overføring fullføres over flere runder fordi P300-pipetten bare kan overføre opptil 300 μL om gangen. - Påse at roboten blander alle prøver fem ganger ved å pipettere opp og ned i dypbrønnplaten.
- Vent til den magnetiske modulen er aktivert og prøver inkuberes på modulen i 2 min.
- Vent mens pipetteringsaspirasjonen og dispenserhastighetene er satt til å avta med 25 μL/s fra standarden på 150 μL/s.
MERK: Roboten fjerner langsomt supernatanten fra hver brønn og kaster den i avfallsrøret mens den magnetiske modulen er aktivert. - Vent til pipetteringsaspirasjonen og dispenserhastighetene returneres til standardinnstillingen. Vær oppmerksom på at den magnetiske modulen løsner.
- Kontroller at robotens program er satt på pause og viser meldingen: Kontroller at ACN-rørdekselet er slått av. Fjern acetonitrilrøret manuelt og plasser det tilbake til rørstativet. Klikk fortsett for å fortsette. Forsikre deg om at roboten overfører 1 ml acetonitril for å vaske hver prøve og umiddelbart blandes 10 ganger.
- Forsikre deg om at roboten blander alle prøver 10 ganger for å vaske prøvene.
- Vær klar mens den magnetiske modulen er aktivert og inkuberer prøvene i 2 min.
- Vent til roboten endrer pipetteringsaspirasjonshastigheten for å bremse og sakte fjerner supernatanten og dispenserer den i avfallsrøret.
- Vær oppmerksom mens roboten inkuberer prøvene på magnetmodulen i 60 s for å tillate gjenværende acetonitril å fordampe, og endrer deretter pipetteringsaspirasjonshastighetene tilbake til standard. Vær oppmerksom på at den magnetiske modulen løsner.
- Kontroller at robotens program er satt på pause og viser meldingen: Vortex DMSO igjen og åpne caps. Virvel 2 % DMSO manuelt i 10 s og plasser den tilbake i A1-brønnen i rørstativet på 15 ml–50 ml. Klikk fortsett for å fortsette.
- Forsikre deg om at roboten overfører 80 μL 2% DMSO til hver brønn og umiddelbart blander 10 ganger.
- Forsikre deg om at roboten blander alle prøver 10 ganger i ytterligere fem runder.
- Vær klar mens den magnetiske modulen er aktivert og inkuberer prøvene i 2 min.
- Vær oppmerksom mens roboten endrer pipetteaspirasjonshastigheten til langsom (25 μL/s) og overfører sakte supernatanten til tomme brønner i dypbrønnplaten.
- Vent til roboten inkuberer prøver på magnetmodulen i 2 minutter for å fjerne gjenværende perler i prøvene.
- Kontroller at robotens program er satt på pause og viser meldingen: Plasser nye 2 ml rør i 2 ml rørstativet og sørg for at antall rør samsvarer med det totale antallet prøver.
- Plasser det første 2 ml mikrosenterrøret i brønnen rett etter den endelige BSA-fordøyelsesprøven. Klikk fortsett for å fortsette.
MERK: De seks BSA-sammendragsprøvene som er testet i denne protokollen, er for eksempel i brønnene A1, B1, C1, D1, A2 og B2. Derfor er det nye settet med 2,0 ml rør plassert i brønnene B3, C3, D3, ... og så videre. - Vær oppmerksom mens roboten overfører 88 μL prøver fra brønnene i dypbrønnplaten til det nye settet med 2,0 ml rør.
MERK: Det overførte volumet (1,1 x 80 μL) i protokollen er optimalisert for å sikre at hele volumet av prøven aspireres inn i pipettespisser. - Vær klar mens roboten endrer pipetteaspirasjonshastigheten til standard og kobler fra magnetmodulen.
- Tørk de opprensede peptidene manuelt i en vakuumfordamper (se Materialfortegnelse) og fortsett til § 5 eller oppbevar tørkede prøver ved -20 °C.
4. MS-prøvepreparering med proteinlyse av menneskehjertet (5 mg/ml) med SP3 paramagnetiske perler
- Åpne SP3_digestion.py Python-skriptet, og angi verdier for variabler i delen TILPASS BARE HER.
MERK: Variablene inkluderer antall prøver og replikering, prøvekonsentrasjonen, volumet av reagenser (DTT, IAA, trypsin, perler, 100% og 80% etanol), DTT og IAA inkubasjonstid, starttips for pipetter P20 / P50 og P300, og starter godt i dypbrønnplaten på magnetmodulen. - Følg trinn 2.2-2.23 i avsnitt 2 for MS-prøvepreparering med et enkelt protein bovint serumalbum for DTT- og IAA-inkubasjon. Se figur 1 for oppsett av robotdekk i disse trinnene.
- Forbered en fersk SP3 perleblanding (20 μL per oppryddingsreaksjon) for proteinopprydding (som angitt i trinn 3.10) under DTT- og IAA-inkubasjonstrinnene (trinn 2.15 og 2.19). Plasser perlene i D6-brønnen på 2 ml rørstativet.
- Kontroller at robotens program er satt på pause med meldingen: Åpne rørhetter. Ta av prøverørene manuelt i aluminiumsblokken på toppen av temperaturmodulen, og klikk på Fortsett for å fortsette.
- Påse at roboten overfører alle prøvene fra 2,0 ml rør til en ny dypbrønnplate på toppen av magnetmodulen.
- Kontroller at robotens program er satt på pause og viser meldingen: Kontroller at klargjorte perler er lastet inn i D6 på 2 ml rørstativet som er plassert i spor 4 før du gjenopptar protokollen. Åpne perler rørhetten og klikk på Fortsett for å fortsette.
- Vær oppmerksom mens roboten overfører 20 μL perler til hver brønn i dypbrønnplaten med fem runder med blanding av perlene og fem runder med blanding av prøveperlerblandingen.
- Kontroller at robotens program er satt på pause og viser meldingen: Kontroller at 100 prosent etanol er lastet inn i A3 på rørstativet på 15 ml-50 ml som er plassert i spor 5 før du gjenopptar protokollen. Forbered 10-20 ml 100% etanol (dvs. 200 bevis etanol, se Materialbord) i et 50 ml konisk rør og plasser det i A3-brønnen på stativet. Klikk fortsett for å fortsette.
- Vær klar mens roboten overfører 140 μL 100% etanol til hver brønn i platen umiddelbart etterfulgt av 10 runder med blanding for å lette peptiders binding til perlene.
- Forsikre deg om at roboten blander hver prøve ved å pipettere opp og ned 10 ganger hver runde i totalt fem runder med blanding.
- Vær klar mens den magnetiske modulen er aktivert og inkuberer prøvene på modulen i 2 min.
- Vær oppmerksom mens roboten endrer pipetteringshastigheten til langsom (25 μL/s) og aspirerer supernatanten fra hver brønn og dispenserer den inn i avfallsrøret.
- Vent til roboten endrer pipetteringshastigheten tilbake til standard og kobler fra magnetmodulen.
- Kontroller at robotens program er satt på pause og viser meldingen: Kontroller at 80 prosent etanol er lastet inn i A4 på rørstativet på 15 ml-50 ml som er plassert i spor 5 før du gjenopptar protokollen. Lag manuelt 20 ml 80 % etanol ved å blande 4 ml MS-grad vann med 16 ml 100 % etanol (dvs. 200 bevis). Plasser 80% etanol i A4-brønnen i rørstativet. Klikk fortsett for å fortsette. Forsikre deg om at roboten overfører 1 ml 80% etanol til hver brønn og umiddelbart blander 10 ganger.
- Vær oppmerksom mens roboten endrer pipetteringshastigheten til langsom (25 μL/s), aspirerer supernatanten fra hver brønn og dispenserer inn i avfallsrøret. Vent til roboten endrer pipetteringshastigheten tilbake til standard og kobler fra magnetmodulen.
- Åpne hetten på ABC-løsningen når robotens program er satt på pause og viser meldingen: Åpne hetten på ABC-røret. Klikk fortsett for å fortsette. Vær klar mens roboten kobler fra magnetmodulen, overfører 250 μL ABC til hver brønn, og blandes umiddelbart i 10 ganger.
MERK: Dette trinnet er å vaske prøvene med ABC. - Påse at roboten griper inn i magnetmodulen og inkuberer prøver på modulen i 2 minutter.
- Vær oppmerksom mens roboten endrer pipetteringshastigheten til langsom (25 μL/s) og overfører supernatanten fra hver brønn til avfallsrøret. Vent til roboten overfører 100 μL ABC-buffer til hver brønn og umiddelbart blandes i 10 ganger.
- Kontroller at robotens program er satt på pause og viser meldingen: Kontroller at nye oppsamlingsrør er plassert i 2,0 ml aluminiumsblokk før du gjenopptar protokollen. Plasser et nytt sett med mikrosenterrør med lavt proteinretensjon i aluminiumsblokken umiddelbart etter det siste prøverøret som først var i blokken. Klikk fortsett for å fortsette. Vær klar mens roboten overfører hver prøve i ABC-buffer til de nye 2,0 ml-rørene.
MERK: Undersøk brønnene og overfør eventuelle restprøver manuelt til rørene om nødvendig. - Forbered en passende mengde ms-grade trypsin (10 μL per prøve) ved å oppløse 20 μg MS-grade trypsin i MS-grade vann til en endelig konsentrasjon på 0,2 μg / μL når robotens program er satt på pause og viser meldingen: Kontroller at trypsin (0,2 μg/μL) er lastet inn i C6 på 2 ml rørstativet som er plassert i spor 4 før du gjenopptar protokollen. Forsikre deg om at roboten overfører 10 μL trypsin til hvert prøverør, etterfulgt av fem runder med blanding.
- Pakk prøverørhettene med parafinfilm, overfør alle prøvene til en temperaturkontrollert mikser og inkuber ved 37 °C i 16-20 timer med 1000 o/min risting.
MERK: Å utføre fordøyelsen med 1000 rpm risting anbefales for å minimere perlers nedbør under natten inkubasjon.
5. Peptid opprydding ved hjelp av SP3 paramagnetiske perler
- Følg trinnvise instruksjoner i trinn 2, Peptid opprydding ved hjelp av SP3 paramagnetiske perler.
6. Flytende kromatografi og massespektrometri
- Resuspend BSA (trinn 2-3) og hjertelys (trinn 4) peptider i 0,1% maursyre ved å tilsette 1 ml LC-MS-grad 99% maursyre i MS-vann til et totalt volum på 1 L.
FORSIKTIG: Maursyre er en sterk syre. Det er svært etsende for øynene, huden og luftveiene. Håndter med forsiktighet under en kjemisk hette iført PPE. - Kvantifisere peptidkonsentrasjonen etter fordøyelsen ved hjelp av et kvantitativt peptidanalysesett17 og injiser 0,5 μg BSA-sammendrag og 1,5 μg hjertefordøyd for LC-MS/MS-analyse.
- Sett opp flytende kromatografiprogram for LC-MS/MS-analyse.
MERK: I et typisk oppsett kan peptidfordøyd lastes på en omvendt fase C18-kolonne (3 μm partikkel; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm; se Materialtabell) ved hjelp av parametrene i Tilleggsfil 2. - Innhente hagleproteomikkdata ved hjelp av et massespektrometer (se Materialtabell) ved hjelp av parametrene i tilleggsfil 3.
- Søk i proteindatabasen etter proteinidentifikasjon.
- Last ned og installer den nødvendige programvaren, MaxQuant.
MERK: MaxQuant-programvare (v.1.6.10.43) ble brukt her for følgende trinn (se Materialliste). - Last ned den kuraterte humane proteomdatabasen fra en proteinsekvensdatabase av høy kvalitet (UniProt/SwissProt) (se Materialfortegnelse). Klikk på Last ned-knappen og velg FASTA (kanonisk).
MERK: Last eventuelt ned FASTA (ikke-kanonisk) for å inkludere proteinisoformer av hvert gen i databasen, om ønskelig. - I MaxQuant-programvaregrensesnittet angir du FASTA-filen som skal brukes som en proteindatabase ved å navigere til Global Parameters-panelet og klikke på Sekvenser-fanen ; Klikk deretter på Legg til-knappen for å angi filbanen til FASTA-filen.
- I MaxQuant-programvaregrensesnittet angir du de oppkjøpte rå massespektrumfilene som skal analyseres ved å gå til Raw Data-panelet og klikke på Last inn-knappen og velge raw-filen(e).
- Definer søkeparametere som vist i tabell 1. Aktiver etikettfri kvantifisering (LFQ) om nødvendig.
- Vent til søket er fullført, og finn antall peptidspektrumsamsvar (PSMer) som passerer FDR 1% terskler i MSMS.txt-filen i /combined/txt-mappen.
MERK: I sammenligningene som ble utført her for den representative resultatdelen, ble PSMs kartlagt til flere proteiner filtrert ut, og PSMs tilordnet til ett unikt protein ble beholdt for å telle antall PSMer, peptider og proteiner (figur 4 og figur 5).
- Last ned og installer den nødvendige programvaren, MaxQuant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre Python-skript er gitt her som er kompatible med OT-2-roboten, og som utfører prøvepreparering for massespektrometriproteomikk med et enkelt proteinstandard bovint serumalbumin (teknisk replikerer n = 5 fordøyelser) og en vaskemiddelholdig menneskelig hjertelysprøve (n = 5 fordøyelser). Hvert sammendragsprodukt er partisjonert i to peptidoppryddingsreaksjoner. Antall identifiserte peptidspektrumsamsvar (PSMs), peptider og proteiner i hver kjøring av BSA og hjerteprøver er vist i figur 4 og figur 5. En median på 728 PSM-er og 65 peptider ble identifisert med BSA-prøven, med henholdsvis 5,2 % og 3,2 % variasjonskoeffisienter (CV). Med den komplekse hjerteprøven ble en median på 9 526 PSMs, 7 558 peptider og 1336 proteiner identifisert i 10 løp med 7,6 %, 5,9 % og 3,6 % variasjonskoeffisient. Totalt ble 1935 proteiner identifisert fra 10 løp av hjerteprøven, og blant disse ble 1677 proteiner identifisert i to eller flere løp. For å bestemme variasjonen i peptid kvantifisering, ble CVen til de ekstraherte ionkromatogram (XIC) intensitetene beregnet for 10 peptider som kartla til et unikt protein (tabell 2). Variasjonene i menneskelige (håndpipetterte) vs. robot eksperimentelle resultater på måling av proteinkonsentrasjon ble ytterligere sammenlignet med tre proteinstandardprøver med BCA-analysen. Gjennomsnittlig CV (7,57 %) av robot BCA-analysen ble funnet å være lavere enn den humane manuelle BCA-analysen (9,22 %) (supplerende tabell 1).
Den beskrevne protokollen viste konsistent ytelse over tid da BSA-fordøyelsesprotokollen ble utført 2 måneder fra hverandre og ga sammenlignbare resultater. Median antall unike PSM-er og peptider i figur 2 er henholdsvis 728 og 65. De samme eksperimentene utført på OT-2-systemet 2 måneder før genererte i gjennomsnitt 647 PSM-er og 54 peptider (n = 2) (Supplerende tabell 2). Langsiktig stabilitet kan estimeres tilsvarende.
Den manuelle benkbehandlingstiden (inkubasjonstid ikke inkludert) beregnes mellom robotprotokollen og menneskelig prosessering18 per prøvepreparering. Med fordøyelsesprotokollen uten fjerning av vaskemiddel etterfulgt av peptidavsalting, er den manuelle behandlingstiden 41 min med robotsystemet vs. 61 min for hånd. Med rengjøringsmiddelfjerning, fordøyelse og peptidavsaltingsprotokoll er den manuelle behandlingstiden 54 min med robotsystemet vs. 79 min for hånd. Derfor reduserer den halvautomatiske protokollen omtrent 20-25 min hands-on benkbehandlingstid per prøve. Denne tidsreduksjonen blir betydelig når mange prøver behandles og kan forbedres ytterligere når flere OT-2-roboter brukes parallelt.
Figur 1: Skjematisk arbeidsflyt. Proteiner ekstrahert med vaskemiddelhjelp vil kreve behandling med et ekstra trinn for fjerning av vaskemiddel før fordøyelsen. Proteinprøver fordøyes, og peptider avsaltes på OT-2 robotsystemet. Peptidfordøydene injiseres i et Q-Exactive HF-massespektrometer kombinert med et nano-LC. MS-spektra søkes mot en proteindatabase for proteinidentifikasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Robotdekk satt opp for proteinfordøyelse. De angitte posisjonene til spissstativer, prøver, søppel, temperaturmodul og magnetisk modul vises. Stjerner betegner labware og reagenser som bare kreves for fordøyelsesprotokollen med vaskemiddelfjerningstrinn. Bokser med tall angir ledige dekkposisjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Robotdekk satt opp for peptidoppryddingsskriptet. De angitte posisjonene til spissstativer, prøver, søppel og magnetisk modul vises. Bokser med tall angir ledige dekkposisjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Antall peptidspektrumkamper (PSM-er) og peptider som oppdages i fordøyelsene av BSA-protein (n = 5). Hvert sammendrag ble delt i to for teknisk replikering av peptidopprydding (R1 og R2). Variasjonskoeffisient: 5,2 % for PSM-er; 3,2 % for peptider. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Antall PSM-er, peptider og proteiner identifisert fra et menneskelig hjertelys. Fem fordøyelser ble utført med fjerning av SP3-vaskemiddel. Hvert sammendrag ble delt i to for peptidopprydding (R1 og R2). Variasjonskoeffisienter: 7,6 % for PSM-er; 5,9% for peptider; 3,6% for proteiner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Fordøyelsesenzym | Trypsin/P |
| Maksimal tapt spalting | 2 |
| Fast endring | Karbamidometylering av cystein |
| Variabel endring | N-terminal protein acetylering; oksidasjon av metionin |
| Lengdeområde for peptid | 7 – 25 aa |
| Forløper massetoleranse | ± 16.50 |
| MASSETOLERANSE for MS/MS-ioner | ± 20 ppm |
| Etikettfri kvantifisering | LFQ |
| Falsk oppdagelsesrate (FDR) for peptidspektrummatch (PSM) | 0.01 |
Tabell 1: Søkeparameterne for peptiddatabasen (MaxQuant).
| Peptid | Protein-ID | PEP | Median XIC-intensitet | CV | |
| LSTSQIPQSQIR | Q92523 | 7.72E-08 | 1.96E+07 | 6.70% | |
| SEDFSLPAYMDR | P13073 | 9.64E-17 | 8.05E+08 | 7.30% | |
| YLQEIYNSNNQK | P02679 | 2.76E-23 | 9.69E+08 | 7.60% | |
| TDDCHPWVLPVVK | P17174 | 4.51E-14 | 4.60E+08 | 8.60% | |
| VIVVGNPANTNCLTASK | P40925 | 7.90E-29 | 1.17E+09 | 8.70% | |
| DYIWNTLNSGR | O75390 | 1.63E-15 | 1.38E+08 | 8.80% | |
| VSVPTHPEAVGDASLTVVK | P13611 | 1.86E-09 | 6.77E+07 | 9.10% | |
| QVAEQFLNMR | P22695 | 3.25E-08 | 1.09E+08 | 9.30% | |
| NTFWDVDGSMVPPEWHR | Q9UI09 | 2.05E-11 | 4.00E+07 | 9.60% | |
| SASDLTWDNLK | P02787 | 5.29E-11 | 1.92E+09 | 9.80% | |
Tabell 2: Ekstrahert ionkromatogram (XIC) intensitets kvantifisering av 10 peptider.
Supplerende tabell 1: Sammenligning av manuelle og automatiserte BCA-analyser. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Supplerende tabell 2: BSA-fordøyelse utført 2 måneder bortsett fra prøvene som ble behandlet i figur 4. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggsfil 1: En kopi av de utviklede Python-skriptene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplementary File 2: Metodeparametere for flytende kromatografi program for LC-MS / MS analyse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende fil 3: Metodeparametere for godkjenning av hagleproteomikkdata ved hjelp av et massespektrometer. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
For best ytelse bør Opentrons-verifisert labware, moduler og forbruksvarer som er kompatible med OT-2 brukes. Tilpasset labware kan opprettes etter Opentrons instruksjon på Reference14. Sørg for å kalibrere OT-2-decket, pipettene og labware når de brukes for første gang. Det er også viktig å følge retningslinjer fra SP3 perler produsent for å forberede perler for peptid og protein opprydding. Spesielt under perle- og peptidbindingsreaksjonen må volumet av acetonitril i bindingsreaksjonen være ≥95%, og perlekonsentrasjonen må være ≥0,1 μg/μL. Hold peptidkonsentrasjonen i området 10 μg/ml-5 mg/ml. Med de optimaliserte parametrene i peptidoppryddingsskriptet her, er acetonitrilvolumforholdet 95%, perlekonsentrasjonen er 0,37 μg / μL, og peptidkonsentrasjonen er i området 14-37 μg / ml. Peptidmassen er anslått til å være 40-100 μg i 100 μL fordøyelsesreaksjon fra vår erfaring. For SP3 proteinopprydding ble 5-10 μg perler til 1 μg protein brukt og sørget for at den minimale perlekonsentrasjonen er 0,5 μg / μL under proteinbinding. Den anbefalte proteinkonsentrasjonen ligger i området 10 μg/ml-5 mg/ml. Med standardparameteren i det medfølgende skriptet brukes 1 mg perler til 100 μg protein, og perlekonsentrasjonen under binding er 3,75 μg /μL, mens proteinkonsentrasjonen er 0,35 mg / ml.
Endringer og feilsøking
Standardvariablene i Python-skriptene er optimalisert for standard arbeidsflyter i laboratoriet vårt. Brukere må justere variablene for å gjøre skriptene kompatible med programmene sine om nødvendig. Hvis det observeres lav MS-intensitet, må du kontrollere om det er protein- eller peptidtap etter hver signifikante protokollseksjon med proteinanalysen og kvantitativ peptidanalyse. Når du bruker protokollen på OT-2 for første gang, må du observere robothåndtering for hvert trinn for å sikre at roboten utfører prosedyrer som forventet. I skrivende stund er den elektroniske pipetten P50 ikke lenger tilgjengelig i Opentrons-butikken. Gjeldende skript er endret for å angi hvor P20-pipetten kan brukes i stedet. Brukere kan referere til Opentrons API for å endre skriptene for å bruke andre pipetter, om nødvendig.
Begrensninger av teknikken
Til tross for fordelene ved å bruke et robotisert væskehåndteringssystem, bør forsiktighet utvises ved utførelsen av væskeoverføring mellom tekniske repliker. Overvåking av roboten under det første oppsettet og væskehåndteringstrinn anbefales på det sterkeste. Etter robot væskeoverføringen kan manuell gjenoppretting av restvolum være nødvendig for å unngå prøvetap og redusere variasjoner.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Denne protokollen beskriver en halvautomatisk massespektrometribasert prøveprepareringsmetode ved hjelp av den rimelige og åpen kildekode OT-2 væskehåndteringsroboten. Nylig har andre verk også begynt å bruke OT-2 mot proteomiske applikasjoner11. Sammenlignet med eksisterende metoder, inkluderer kjennetegn ved denne protokollen bruk av en relativt rimelig, Python-programmerbar robot; inkorporering av halvautomatiske SP3 perler i to trinn i prøveprepareringsprotokollene, nemlig fjerningstrinnet for proteinprøvevaskemiddel og peptidavsalting / oppryddingstrinn; samt tilgjengeligheten av open source Python-skript for å støtte videre utvikling. SP3 Paramagnetiske perler binder proteiner og peptider effektivt og har blitt kombinert med automatiserte væskehåndteringssystemer mot applikasjoner ved fjerning av proteinrensing/vaskemiddel før enzymatisk fordøyelse i MS-prøvepreparering11,13.
Tre open source Python-skript leveres sammen med denne protokollen til forskere. Skriptene kan tilpasses for individuelle eksperimentelle forhold (f.eks. prøvenummer, replikeringsnummer, inkubasjonstemperatur og -tid osv.) og tillater videreutvikling for modifiserte arbeidsflyter. Protokollene ga utmerkede 3% -6% tekniske CV-er i antall peptider og / eller proteinidentifikasjon mellom MS-løp i laboratoriet vårt, sammenlignbart med tidligere arbeid på andre væskehåndteringssystemer (<20%) 9,11.
Fremtidige programmer
Denne protokollen demonstrerer nytten av et rimelig programmerbart væskehåndteringssystem i forbindelse med SP3-perler for halvautomatisk proteomikkprøvepreparering, som potensielt kan gjelde for massespektrometrilaboratorier og kjerneanlegg for å forbedre effektiviteten til prøvebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter å deklarere.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av NIH-priser F32-HL149191 til YH; R00-HL144829 til EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 til MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 er opprettet ved hjelp av et nettbasert vitenskapsillustrasjonsverktøy, BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
