Summary
Detaljeret protokol og tre Python scripts er fastsat for drift af en open source robot væske håndtering system til at udføre semi-automatiseret protein prøve forberedelse til massespektrometri eksperimenter, der dækker fjernelse af vaskemiddel, protein fordøjelse, og peptid afsaltning trin.
Abstract
Massespektrometri-baserede shotgun proteomics eksperimenter kræver flere prøve forberedelse trin, herunder enzymatisk protein fordøjelse og oprydning, som kan tage op betydelige person-timer af bænk arbejdskraft og præsentere en kilde til batch-til-batch variabilitet. Lab automatisering med pipetter robotter kan reducere manuelt arbejde, maksimere gennemløbet, og øge forskning reproducerbarhed. Alligevel gør de stejle startpriser på standardautomatiseringsstationer dem uoverkommelige for mange akademiske laboratorier. I denne artikel beskrives en arbejdsproces for forberedelse af proteomics prøver ved hjælp af et prisbilligt automatiseringssystem (The Opentrons OT-2), herunder instruktioner til opsætning af halvautomatisk proteinreduktion, alkylering, fordøjelse og oprydningstrin. samt ledsagende open source Python scripts til at programmere OT-2-systemet gennem sin ansøgning programmering interface.
Introduction
Massespektrometri-baserede shotgun proteomics er et kraftfuldt værktøj til at måle overflod af mange proteiner i biologiske prøver samtidigt. Proteomics eksperimenter med bioinformatik analyse er rutinemæssigt ansat til at identificere biomarkører og opdage tilknyttede biologiske komplekser og veje, der understøtter patologiske mekanismer. Med sin høje analysand specificitet og potentielle kvantitative nøjagtighed, shotgun proteomics har også fremragende potentiale til at blive vedtaget af forskningsfaciliteter og diagnostiske laboratorier til klinisk prøve analyse uden behov for at stole på antistoffer1,2.
For at forberede proteinprøver til shotgun proteomics analyse, proteiner udvundet fra biologiske prøver (f.eks celler og væv) typisk først skal behandles ved hjælp af lange protokoller, herunder måling af prøven proteinkoncentration, protein reduktion, og alkylation, og enzymatisk fordøjelse i peptider. Desuden kræver proteiner, der udvindes i almindelige lysisbuffere, der indeholder rengøringsmidler, ofte yderligere trin til bufferudveksling eller fjernelse af vaskemiddel før analyse, fordi vaskemiddel kan forstyrre trypsin fordøjelsen og forringe ydeevnen af downstream flydende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) analyse3. Peptider er typisk yderligere afsaltet, tørret og rekonstitueret i LC-MS/MS kompatible opløsningsmidler efter enzymatisk fordøjelse. Disse protein biokemi procedurer kan være arbejdskrævende og tidskrævende. De begrænser således fortsat proteomics arbejdsganges gennemløb og bidrager til variationen af erhvervede data4,5. Menneskelige fejl og fordomme er blevet anerkendt som afgørende faktorer, der påvirker dataafvigelse og reproducerbarhed6,7. For at minimere menneskelige fejl i arbejdsgange for massespektrometriprøvepræparater er automatiserede pipetteringrobotsystemer blevet anvendt til at forbedre gennemløbet og reproducerbarheden af proteinidentifikation og kvantificering fra shotgun proteomics og målrettet massespektrometrianalyse, hvor sådanne fremskridt er blevet hyldet som medvirkende til at fortsætte presset for udbredt indførelse af proteomicsteknologier i kritisk forskning og kliniske indstillinger8 9,10,11,12,13. Men de fleste eksisterende protokoller udnytter robot flydende håndtering platforme, der kræver betydelige investeringer og uddannelse, begrænse deres nytte i mange laboratorier i det akademiske miljø eller på anden måde med et begrænset budget.
I denne artikel beskrives en protokol, der bruger et billigt, open source robotvæskehåndteringssystem, OT-2, til at semiautomatere en typisk arbejdsgang for præparat af proteomics-prøver. OT-2 har en lavere pris end mange andre robot flydende håndteringssystemer, og i skrivende stund koster omkring $ 5.000 dollar. Når factoring i priserne på forskellige moduler og labware, de samlede omkostninger til at oprette eksperimenter i denne protokol i skrivende stund er omkring $ 10.000, hvilket gør det mere overkommeligt at et betydeligt bredere sæt af laboratorier over dyrere muligheder. OT-2 er kompatibel med open source programmering gennem Python scripts og tilbyder stor fleksibilitet i brugerdefinerede DIY protokol design. Ved hjælp af tre in-house udviklede scripts dækker protokollerne nedenfor, der udfører en typisk shotgun proteomics prøveforberedelsesarbejdsgang på OT-2-stationen med en arketypisk proteinstandard (kvægserumalbumin; BSA) og en kompleks proteinprøve af et normalt humant hjertelysat (figur 1). Procedurerne for behandling (1) en BSA-prøve og (2) en kompleks hjertelyatprøve er beskrevet i protokolafsnit 1, 2, 5, 6 og 3, 4, 5, 6. Sera-Mag carboxylate-modificerede magnetiske perler anvendes i enkelt-pot solid-fase-forbedret prøve forberedelse (SP3) for at fjerne rengøringsmidler og salte i protein og peptid prøver. Tryptiske fordøjer fra kvæg serum albumin og menneskelige hjerte proteiner er yderligere renset af SP3 perler og forelagt til LC-MS / MS analyse. Massespektre analyseres derefter ved hjælp af MaxQuant-softwaren til peptid og proteinidentifikation. Repræsentative resultater udført af os viser, at protokollen opnår fremragende tekniske koefficienter for variation (CV), samtidig med at bænktid sparer tid og er ikke-ringere end håndfordøje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De udviklede Python scripts er blevet deponeret på GitHub på: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. Der er angivet en kopi af scriptene i supplerende fil 1. Der henvises til GitHub-lageret for at få de nyeste versioner.
1. Eksperimentelle præparater
- Kontroller den nødvendige hardware, før protokollen startes.
BEMÆRK: Følgende hardwarekomponenter er påkrævet: OT-2 pipetter, pipettespidser, 4-i-1 rørholdersæt, aluminiumsbloksæt, magnetisk modul, temperaturmodul, 96-brønd 2 mL dybe brøndplader (se Materialetabel).
2. Massespektrometri (MS) prøvepræparat med et enkelt protein kvæg serum albumin (BSA)
- Åbn NoSP3_digestion.py scriptet i en teksteditor, og angiv de eksperimentspecifikke variabler efter behov i afsnittet TILPAS KUN HER.
BEMÆRK: De eksperimentspecifikke variabler omfatter antallet af prøver og replikere; prøvekoncentrationen mængden af reagenser dithiothreitol - DTT, iodoacetamid - IAA, og trypsin; DTT- og IAA-inkubationstiden og startspidsen for pipette P20/P50 og P300).- Åbn Opentrons-appen, og overfør scriptet til fanen PROTOKOL i Opentrons-appen.
BEMÆRK: Opentrons-appen kan downloades fra Reference14 til en lokal computer. I skrivende stund er Opentrons P50 elektroniske pipette ikke tilgængelig for køb i Opentrons butik. Det er blevet erstattet med P20 enkeltkanals elektroniske pipette, der er kompatibel med de mængder, der er angivet i protokollen. Noter og instruktioner er blevet foretaget i scriptet til at erstatte P50 pipetten med P20 pipetten. Brugerne skal muligvis teste og kontrollere den pågældende pipettes kompatibilitet med denne protokol efter Opentrons API-instruktion.
- Åbn Opentrons-appen, og overfør scriptet til fanen PROTOKOL i Opentrons-appen.
- Åbn fanen ROBOT , og udfør kalibrering af robotdæk Kalibrer deck under fanen ROBOT efter den trinvise vejledning på skærmen i Opentrons-appen.
BEMÆRK: Dette trin er kun påkrævet, hvis det ikke tidligere er blevet implementeret, eller robotten for nylig er blevet omfordelt. - Klik på knappen ADMINISTRER PIPETTES for at udføre kalibrering af spidslængde efterfulgt af pipetteforskydningskalibrering for at kalibrere standardspids- og pipettekombinationspositionen.
BEMÆRK: Dette trin er påkrævet, hvis der bruges en pipette første gang. - Placer de nødvendige labware og pipetter på det tilsvarende sted i OT-2-dækket, der er angivet i Python-scriptet (figur 2).
BEMÆRK: Sørg for, at temperaturmodulet er tilsluttet og tændt, og aluminiumsblokken er placeret oven på temperaturmodulet. - Åbn fanen KALIBRER, og udfør kalibrering for den kombination af labware og pipetter, der kræves i dette pythonscript.
BEMÆRK: Opentrons App registrerer kalibreringsparametrene, hvilket ikke er nødvendigt for fremtidige applikationer med de samme labware og pipetter. - Tilbered 5 mL 100 mM ammoniumbicarbonat (ABC) (pH ~8,0) opløsning ved at opløse 39,53 mg ABC i massespektrometri-kvalitet vand til et samlet volumen på 5 mL i et 15 mL konisk rør. Placer ammoniumbicarbonatbuffer i A1-brønden på 4-i-1 rørholderen med 15 mL + 50 mL rørholdertoppen.
- Der fremstilles 1 mL BSA-protein (BSA) i et 2,0 mL proteinfattigt rør (se Materialetabel). Prøven anbringes i A1-brønden på 4-i-1-rørholderen med 2 mL rørholdertop.
- Placer manuelt 2,0 mL protein lavbindingsrør i brøndene af A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2 osv. i aluminiumsblokken oven på temperaturmodulet.
BEMÆRK: Robotpipetten udleverer prøver i lodret rækkefølge fra A1 (første prøve) til den sidste prøve som standard. Vandret dispensering kan specificeres. Se 15 for detaljer. Det samlede antal rør, der skal fremstilles, bør svare til det samlede antal prøver (dvs. antallet af biologiske prøver ganget med antallet af tekniske gentagelser pr. prøve). - Der fremstilles 1 mL 60 mM DTT ved opløsning af 9,26 mg DTT-faste stoffer i massespektrometrikvalitetsvand til et samlet volumen på 1 mL. Placer DTT i A6 brønden af 4-i-1 rørholderen med 2 mL rørholderen top.
FORSIGTIG: DTT er skadeligt for menneskers øjne, hud og åndedrætssystemet. Brug PPE og håndter det under en kemisk hætte. Der henvises til producentens sikkerhedsdatablad for at få de korrekte procedurer. - Overhold, mens robotten overfører en passende mængde ABC-buffer til prøverørene i aluminiumsblokken.
BEMÆRK: Den samlede mængde ABC- og proteinblanding i hvert rør er 100 μL, og volumenet af ABC-buffer beregnes i scriptet (V = 100 μL minus mængden af 100 μg proteinprøve). - Sørg for, at robotten overfører 100 μg BSA-protein til hvert rør med ABC-buffer.
BEMÆRK: Et typisk forsøg kan bruge op til 100 μg proteiner til proteinfordøjelse, dvs. - Kontroller manuelt, at robotprogrammet er sat på pause, og viser meddelelsen: Sørg for, at DTT er indlæst i A6 på 2 mL-rørholderen, der er placeret i slot 4, før protokollen genoptages. Sørg for, at et DTT-rør er placeret i A6-brønden, og åbn hætten. Klik på knappen Fortsæt i Opentrons-appen for at fortsætte. Sørg for, at robotten overfører 10 μL DTT-opløsning til hver prøve godt, efterfulgt af fem blandingsrunder.
- Kontroller, at robotprogrammet er sat på pause, og viser meddelelsen: Sørg for at lukke hætter på prøverør. Luk rørenes hætter manuelt, og klik på Fortsæt for at fortsætte. Vent, indtil robottens temperaturmodul begynder at opvarme aluminiumsblokken, indtil temperaturen når 55 °C, efterfulgt af en inkubation på 5 minutter, så prøverne kan komme op på 55 °C.
BEMÆRK: Robotten holder temperaturen ved 55 °C i 30 min for at muliggøre proteinreduktion ved DTT under inkubation. - I løbet af 30 min af DTT inkubation, forberede 1 mL af 187,5 mM Iodoacetamid (IAA) ved at opløse 34,68 mg IAA i ABC buffer til en samlet volumen på 1 mL. Pak IAA-opløsningen manuelt ind med aluminiumsfolie for at undgå udsættelse for lys.
FORSIGTIG: IAA kan forårsage alvorlig øjen- og åndedrætsirritation. Håndter det under en kemisk hætte iført korrekt PPE. - Sørg for, at robottens temperaturmodul køler ned, når 30 min DTT-inkubationen er afsluttet.
BEMÆRK: Når modulets temperatur når op på 22 °C, opretholder modulet temperaturen i 5 min, så prøverne kan køle helt ned. - Udslyng prøverørene, når robottens program er sat på pause, og vis advarselsmeddelelsen: Sørg for at åbne hætter på prøverør. Klik på Fortsæt for at fortsætte.
- Kontroller manuelt, at robottens program er sat på pause med en advarselsmeddelelse: Sørg for, at IAA er indlæst i B6 på 2 mL-rørholderen, der er placeret i slot 4, før protokollen genoptages. Bekræft rackplaceringen af IAA-røret, og åbn rørhætten. Klik på Fortsæt for at fortsætte. Sørg for, at robotten overfører 10 μL IAA til hvert prøverør efterfulgt af fem blandingsrunder.
- Cap prøverørene, når robottens program er sat på pause, og vis meddelelsen: Luk hætter på prøverør og dæk prøverør med folie. Dæk hele aluminiumsblokken med et rent stykke folie. Klik på Fortsæt for at fortsætte. Vent, til prøverne er inkuberet ved 22 °C i 30 min. Sørg for, at robottens temperaturmodul deaktiveres, når IAA-inkubationen er afsluttet.
- Der fremstilles en blanding af trypsinopløsning under IAA-inkubation (trin 2.19) ved den endelige koncentration på 0,2 μg/μL: opløs 20 μg massespektrometri/sekventeringskvalitets trypsin i 100 μL ms-kvalitet vand.
- Placer trypsinopløsningen i C6-brønden på 2 mL-rørholderen med rørhætten åben, når robottens program er sat på pause, og viser advarselsmeddelelsen: Sørg for, at trypsin er indlæst i C6 i 2 mL-rørholderen, der er placeret i slot 4, før protokollen genoptages. Klik på Fortsæt for at fortsætte.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause, og viser advarselsmeddelelsen: Åbne hætter på prøverør på temperaturmodulet. Fjern prøverørene, og klik på Fortsæt for at fortsætte. Vær klar, mens robotten overfører 10 μL trypsin til hvert prøverør efterfulgt af fem blandingsrunder.
- Prøverørshætterne pakkes sammen med paraffinfilm, alle prøver overføres til en temperaturstyret mixer, og inkuber ved 37 °C i 16-20 h med 600 omdrejninger.
BEMÆRK: Trypsin fordøjelsen kan også udføres direkte på temperaturmodulet ved 37 °C.
3. Peptid oprydning ved hjælp af SP3 paramagnetiske perler
- Den næste dag efter natten trypsin fordøjelse, kort spin prøverne ved hjælp af en bordplade mikrocentrifuge (≤2.000 x g) (se tabellen materialer) og placere prøverne på en magnetisk rør rack. Lad prøverne stå i 2 min.
- Overfør supernatanten forsigtigt med en pipette til et nyt sæt protein lavbinding mikrocentrifugerør. Prøverne opbevares i køleskab, og fortsæt til trin 3.2-3.9.
BEMÆRK: Ved langtidsopbevaring opbevares prøverne ved -80 °C.
- Overfør supernatanten forsigtigt med en pipette til et nyt sæt protein lavbinding mikrocentrifugerør. Prøverne opbevares i køleskab, og fortsæt til trin 3.2-3.9.
- Åbn SP3_peptide_cleanup.py Python-scriptet i en teksteditor, og angiv efter behov i afsnittet TILPAS KUN HER.
BEMÆRK: De eksperimentspecifikke variabler omfatter antallet af prøver og replikaer, mængden af peptider, der skal overføres, mængden af reagenser (perler, acetonitril, DMSO), startspidsen til P20/P50 og P300 pipetter og starter godt i dyb brøndpladen på det magnetiske modul. Hver BSA-digestprøve indeholder ca. 120 μL fordøjelsesvolumen, som vil blive aliquoteret i to tekniske replikater med 55 μL i hver replikation. Hvis du kun vil rydde halvdelen af digest'en, skal du ændre replikeringsnummervariablen til 1. - Overfør scriptet til fanen PROTOKOL i Opentrons-appen .
- Placer de nødvendige labware og pipetter på det tilsvarende sted i OT-2-dækket, der er angivet i Python-scriptet (figur 3). Sørg for, at det magnetiske modul er tændt og tilsluttet robotten. Placer en ny 2 mL 96-brønd dyb brønd plade (se Tabel af materialer) på toppen af det magnetiske modul.
- Åbn fanen KALIBRER, og udfør kalibrering for den kombination af labware og pipetter, der kræves i dette Python-script.
BEMÆRK: Kalibrering for de samme labware- og pipettekombinationer skal kun udføres én gang, og Opentrons-appen registrerer kalibreringsparametrene. - Placer de fordøjede prøver (supernatant indsamlet på trin 3.1) til 2,0 mL rørholder i lodret rækkefølge i brønde A1, B1....
- Forbered 15 ml LC-MS/MS-kompatibel acetonitril i et 50 ml koniske rør, og placer røret i brønden A3 i 4-i-1 rørholderen med 15 ml + 50 ml rørholderen øverst.
- Der fremstilles 5 mL 2% DMSO ved at tilsætte 100 μL DMSO med 4,9 mL massespektrometri-kvalitet vand i et 15 mL konisk rør. Placer røret i brønden A1 i 15mL + 50mL rørholderen.
- Mærk et tomt 50 mL konisk rør som Affald og læg det i brønden B3 i 15mL + 50mL rørholderen.
- Forbered SP3 perler efter Reference16.
- Forbered en passende mængde blandede perler i et 2,0 mL mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Hver peptidoprydningsreaktion kræver 10 μL blandede perler. For eksempel forberede mindst 40 μL af blandede perler til fire oprydning reaktioner. - Lad perleblandingen sidde på det magnetiske stativ i 2 min. Fjern supernatanten forsigtigt med en pipette og mål supernatantens volumen med en pipette.
- Den resterende mængde perler beregnes, og der tilsættes 5-10 gange massespektrometriens vand (f.eks. 100-200 μL vand til 20 μL perler) og vortex (hastighed 10) i 10 s. Sid perlerne på det magnetiske stativ i 2 min.
- Gentag vand vaske trin for i alt tre vaske.
- Brug de sidste perler i MS-kvalitet vand til en endelig koncentration på 50 μg/μL. Placer de vaskede magnetiske perler i brønden A6 i 2,0 mL rørholderen.
BEMÆRK: Perlerne anbefales at genbruges i en koncentration på 10 μg/μL16. I den nuværende optimeringsindsats blev den endelige koncentration ændret til 50 μg/μL for at minimere det samlede volumen af perle-peptid-acetonitrilblandingen.
- Forbered en passende mængde blandede perler i et 2,0 mL mikrocentrifugerør.
- Sørg for, at robotten overfører 55 μL af de fordøjede prøver til brøndene i dybbårspladerne på magnetmodulet.
- Kontroller, at robotprotokollen er sat på pause, og viser meddelelsen: Sørg for, at forberedte perler er indlæst i A6 i 2 mL-rørholderen, der er placeret i slot 4, før protokollen genoptages. Vortex perlerne, og derefter kort spin ned for 5 s på en mini benchtop centrifuge og placere perlerne i A6 godt af 2 mL rør rack med hætten åben. Vær klar, mens robotten blander perlerne 10 gange i fem runder ved at pipetter op og ned.
BEMÆRK: Robotten overfører 10 μL perler til hver fordøjet prøve i dybbårne plader efterfulgt af fem gange blanding. - Sørg for, at robotten overfører 1.292 μL acetonitril til hver brønd og straks blandes 10 gange ved at pipetter op og ned for at lette peptider og perler bindende.
BEMÆRK: Hver overførsel er gennemført over flere runder, fordi P300-pipetten kun kan overføre op til 300 μL ad gangen. - Sørg for, at robotten blander alle prøver fem gange ved at pipetter op og ned i dybbårspladen.
- Vent til det magnetiske modul er aktiveret, og prøverne inkuberes på modulet i 2 min.
- Vær klar, mens pipetterings- og dispenserhastighederne er indstillet til at aftage ved 25 μL/s fra standard på 150 μL/s.
BEMÆRK: Robotten fjerner langsomt supernatanten fra hver brønd og kasserer den i affaldsrøret, mens det magnetiske modul er aktiveret. - Vent, indtil pipetterings- og dispenserhastighederne returneres til standardindstillingen. Bemærk, at det magnetiske modul løsner sig.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause, og viser meddelelsen: Sørg for, at ACN-rørhætten er slukket. Op med acetonitrilrøret manuelt og placer det tilbage til rørstativet. Klik på Fortsæt for at fortsætte. Sørg for, at robotten overfører 1 ml acetonitril til at vaske hver prøve og straks blandes 10 gange.
- Sørg for, at robotten blander alle prøver 10 gange for at vaske prøverne.
- Vær klar, mens det magnetiske modul er aktiveret og inkuberer prøverne i 2 min.
- Vent, indtil robotten ændrer rør aspiration hastighed til at bremse og langsomt fjerner supernatant og dispenserer det i affaldsrøret.
- Vær opmærksom på, mens robotten inkuberer prøverne på det magnetiske modul i 60 s for at tillade resterende acetonitril at fordampe, og ændrer derefter pipettering aspiration hastigheder tilbage til standard. Bemærk, at det magnetiske modul bliver frakoblet.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause, og viser meddelelsen: Vortex DMSO igen og åbne hætter. Hvirvel manuelt 2% DMSO for 10 s og læg den tilbage i A1 brønden i 15 mL-50 mL rørholderen. Klik på Fortsæt for at fortsætte.
- Sørg for, at robotten overfører 80 μL på 2% DMSO til hver brønd og straks blandes 10 gange.
- Sørg for, at robotten blander alle prøver 10 gange for yderligere fem runder.
- Vær klar, mens det magnetiske modul er aktiveret og inkuberer prøverne i 2 min.
- Vær opmærksom, mens robotten ændrer pipette aspirationshastigheden til at bremse (25 μL/s) og langsomt overfører supernatanten til tomme brønde i dybbårspladen.
- Vent, indtil robotten inkuberer prøver på det magnetiske modul i 2 min for at fjerne resterende perler i prøverne.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause og viser meddelelsen: Placer nye 2 ML rør i 2 mL rørholderen og sørg for, at antallet af rør matcher det samlede antal prøver.
- Placer det første 2 mL mikrocentrifugerør i brønden umiddelbart efter den endelige BSA-fordøjeprøve. Klik på Fortsæt for at fortsætte.
BEMÆRK: For eksempel er de seks BSA-fordøjeprøver, der er testet i denne protokol, i brøndene A1, B1, C1, D1, A2 og B2. Derfor er det nye sæt af 2,0 mL rør placeret i brøndene B3, C3, D3, ... og så videre. - Vær opmærksom, mens robotten overfører 88 μL prøver fra brøndene i dybbårspladen til det nye sæt 2,0 mL rør.
BEMÆRK: Den overførte volumen (1,1 x 80 μL) i protokollen er optimeret for at sikre, at hele prøvens volumen suges ind i pipettespidser. - Vær klar, mens robotten ændrer pipette aspirationshastigheden til standard og frigør det magnetiske modul.
- Tør manuelt de rensede peptider i en vakuumfordamper (se materialetabel) og fortsæt til punkt 5 eller opbevares tørrede prøver ved -20 °C.
4. MS prøvepræparat med proteinlyt i menneskehjertet (5 mg/mL) med SP3 paramagnetiske perler
- Åbn SP3_digestion.py Python-scriptet, og angiv værdier for variabler i afsnittet TILPAS KUN HER.
BEMÆRK: Variablerne omfatter antallet af prøver og replikere, prøvekoncentrationen, mængden af reagenser (DTT, IAA, trypsin, perler, 100% og 80% ethanol), DTT og IAA inkubationstid, startspids for pipetter P20/P50 og P300 og starter godt i dybbårspladen på magnetmodulet. - Følg trin 2.2-2.23 i afsnit 2 for MS-prøvepræparat med et enkelt proteinkvægserumalbumin til DTT- og IAA-inkubation. Se figur 1 for opsætningen af robotdækket i disse trin.
- Der tilberedes en frisk SP3-perlerblanding (20 μL-perler pr. oprydningsreaktion) til oprydning af protein (som angivet i trin 3.10) under DTT- og IAA-inkubationstrinnene (trin 2.15 og 2.19). Placer perlerne i D6 godt på 2 mL rør rack.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause med meddelelsen: Åbn rørhætter. Fjern prøverørene manuelt i aluminiumsblokken oven på temperaturmodulet, og klik på Fortsæt for at fortsætte.
- Sørg for, at robotten overfører alle prøverne fra 2,0 mL-rør til en ny dyb brøndplade oven på magnetmodulet.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause og viser meddelelsen: Sørg for, at forberedte perler er blevet indlæst i D6 i 2 mL rørholderen placeret i slot 4 før genoptagelse af protokollen. Åbn perlerne rørhætte og klik på Fortsæt for at fortsætte.
- Overhold mens robotten overfører 20 μL perler til hver brønd i dyb brøndpladen med fem runder blanding af perlerne og fem runder blanding af prøveperlerblandingen.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause, og viser meddelelsen: Sørg for, at 100 procent ethanol er blevet indlæst i A3 af 15 mL-50 mL rørholderen i slot 5, før protokollen genoptages. Klargør 10-20 mL 100% ethanol (dvs. 200 korrekt ethanol, se Materialetabel) i et 50 mL konisk rør, og læg det i rackets A3-brønd. Klik på Fortsæt for at fortsætte.
- Vær klar, mens robotten overfører 140 μL 100% ethanol til hver brønd i pladen umiddelbart efterfulgt af 10 runder blanding for at lette peptiders binding til perlerne.
- Sørg for, at robotten blander hver prøve ved at pipetter op og ned 10 gange hver runde i i alt fem runder af blanding.
- Vær klar, mens det magnetiske modul er aktiveret og inkuberer prøverne på modulet i 2 min.
- Vær opmærksom, mens robotten ændrer rørhastigheden til langsom (25 μL/s) og aspirerer supernatanten fra hver brønd og dispenserer den ind i affaldsrøret.
- Vent, indtil robotten ændrer pipetterhastigheden tilbage til standard og frigør det magnetiske modul.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause, og viser meddelelsen: Sørg for, at 80 procent ethanol er blevet indlæst i A4 af 15 mL-50 mL rørholderen, der er placeret i slot 5, før protokollen genoptages. Klargør manuelt 20 mL 80% ethanol ved at blande 4 mL MS-kvalitet vand med 16 mL 100% ethanol (dvs. 200 bevis). Placer 80% ethanol i A4 brønden i rørstativet. Klik på Fortsæt for at fortsætte. Sørg for, at robotten overfører 1 mL 80% ethanol til hver brønd og straks blandes 10 gange.
- Vær opmærksom på, mens robotten ændrer rørhastigheden til langsom (25 μL/s), aspirerer supernatanten fra hver brønd og dispenserer ind i affaldsrøret. Vent, indtil robotten ændrer pipetterhastigheden tilbage til standard og frigør det magnetiske modul.
- Åbn hætten på ABC-løsningen, når robottens program er sat på pause, og viser budskabet: Åben hætte på ABC-rør. Klik på Fortsæt for at fortsætte. Vær klar, mens robotten kobler det magnetiske modul, overfører 250 μL ABC til hver brønd og blandes straks 10 gange.
BEMÆRK: Dette trin er at vaske prøverne med ABC. - Sørg for, at robotten aktiverer det magnetiske modul og inkuberer prøver på modulet i 2 min.
- Vær opmærksom, mens robotten ændrer rørhastigheden til langsom (25 μL/s) og overfører supernatanten fra hver brønd til affaldsrøret. Vent til robotten overfører 100 μL ABC buffer til hver brønd og blandes straks 10 gange.
- Kontroller, at robottens program er sat på pause, og viser meddelelsen: Sørg for, at nye opsamlingsrør er placeret i 2,0 mL aluminiumsblok, før protokollen genoptages. Placer et nyt sæt mikrocentrifugerør med lavt proteinindhold i aluminiumsblokken umiddelbart efter det sidste prøverør i første omgang i blokken. Klik på Fortsæt for at fortsætte. Vær klar, mens robotten overfører hver prøve i ABC-buffer til de nye 2,0 mL-rør.
BEMÆRK: Undersøg brøndene, og overfør eventuelle resterende prøver manuelt til rørene, hvis det er nødvendigt. - Der forberedes en passende mængde trypsin i MS-kvalitet (10 μL pr. prøve) ved at opløse 20 μg ms-grade trypsin i MS-kvalitet vand til en endelig koncentration på 0,2 μg/μL, når robottens program er sat på pause, og viser meddelelsen: Sørg for trypsin (0,2 μg/μL) er blevet indlæst i C6 af 2 mL rørholder placeret i slot 4 forud for genoptagelse af protokollen. Sørg for, at robotten overfører 10 μL trypsin til hvert prøverør efterfulgt af fem blandingsrunder.
- Prøverørhætterne pakkes med paraffinfilm, alle prøverne overføres til en temperaturstyret mixer, og inkuberes ved 37 °C i 16-20 h med 1.000 omdrejninger.
BEMÆRK: Det anbefales at udføre fordøjelsen med 1.000 omdrejninger for at minimere perlernes nedbør under inkubationen natten over.
5. Peptid oprydning ved hjælp af SP3 paramagnetiske perler
- Følg trinvise instruktioner i trin 2, Peptid oprydning ved hjælp af SP3 paramagnetiske perler.
6. Flydende kromatografi og massespektrometri
- Brug BSA (trin 2-3) og hjertelyset (trin 4) peptider i 0,1 % myresyre ved at tilsætte 1 mL LC-MS-grad 99 % myresyre i MS-vand til et samlet volumen på 1 L.
FORSIGTIG: Myresyre er en stærk syre. Det er meget ætsende for øjne, hud og åndedrætssystem. Håndter med omhu under en kemisk hætte med PPE på. - Kvantificer den postfordøjede peptidkoncentration ved hjælp af et kvantitativt peptidanalysesæt17 og indsprøjtning 0,5 μg BSA-fordøje og 1,5 μg hjertefordøje til LC-MS/MS-analyse.
- Konfigurer programmet for flydende kromatografi til LC-MS/MS-analyse.
BEMÆRK: I en typisk opsætning kan peptidfordy fordøjer indlæses på en omvendt fase C18-kolonne (3 μm partikel; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm; se Materialetabel) ved hjælp af parametrene i supplerende fil 2. - Indhent data om shotgun proteomics ved hjælp af et massespektrometer (se Materialetabel) ved hjælp af parametrene i supplerende fil 3.
- Søg i proteindatabasen efter proteinidentifikation.
- Hent og installer den nødvendige software, MaxQuant.
BEMÆRK: MaxQuant-software (v.1.6.10.43) blev brugt her til følgende trin (se Materialetabel). - Download den kuraterede humane proteomdatabase fra en proteinsekvensdatabase af høj kvalitet (UniProt/SwissProt) (se Materialetabel). Klik på knappen Download , og vælg FASTA (kanonisk).
BEMÆRK: Eventuelt skal du downloade FASTA (ikke-kanonisk) for at inkludere proteinisoformer af hvert gen i databasen, hvis det ønskes. - I MaxQuant-softwaregrænsefladen skal du angive den FASTA-fil, der skal bruges som proteindatabase, ved at navigere til panelet Globale parametre og klikke på fanen Sekvenser . Klik derefter på knappen Tilføj for at angive filstien til FASTA-filen.
- I MaxQuant-softwaregrænsefladen skal du angive de erhvervede rå massespektrumfiler, der skal analyseres ved at gå til raw-datapanelet og klikke på knappen Indlæs og vælge de rå filer.
- Konfigurer søgeparametre som vist i tabel 1. Aktiver kvantificering uden etiketter ( LFQ), hvis det er nødvendigt.
- Vent på, at søgningen fuldføres, og find antallet af peptidspektrumsmatch (PSMs), der passerer FDR-tærsklerne på 1 % i msms.txt-filen i mappen /combined/txt.
BEMÆRK: I de sammenligninger, der blev udført her for sektionen for repræsentative resultater, blev PPM'er, der var knyttet til flere proteiner, filtreret fra, og PPM'er, der var kortlagt til et unikt protein, blev bevaret for at tælle antallet af PPM'er, peptider og proteiner (figur 4 og figur 5).
- Hent og installer den nødvendige software, MaxQuant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her findes tre Python-scripts, der er kompatible med OT-2-robotten, og som udfører prøveforberedelse til massespektrometri proteomics med et enkelt proteinstandard kvægserumalbumin (teknisk replikerer n = 5 fordøjelser) og en vaskemiddelholdig prøve af menneskehjertelyat (n = 5 fordøjelser). Hvert fordøjeprodukt er opdelt i to peptidoprydningsreaktioner. Antallet af identificerede peptidspektrumsmatchs (PPM'er), peptider og proteiner i hver kørsel af BSA- og hjerteprøverne er vist i figur 4 og figur 5. En mediane med 728 PPM'er og 65 peptider blev identificeret med BSA-prøven med henholdsvis 5,2 % og 3,2 % variationskoefficienter (CV). Med den komplekse hjerteprøve blev en median på 9.526 PPM'er, 7.558 peptider og 1.336 proteiner identificeret i 10 kørsler med 7,6%, 5,9% og 3,6% variationskoefficient. I alt 1.935 proteiner blev identificeret fra 10 kørsler af hjerteprøven, og blandt dem blev 1.677 proteiner identificeret i to eller flere kørsler. For at bestemme variabiliteten i peptid kvantificering blev CV'et for de ekstraherede ionkromatogramintensiteter (XIC) beregnet for 10 peptider, der kortlagde til et unikt protein (tabel 2). Variationerne i humane (hånd-pipetted) vs robot eksperimentelle resultater på måling af proteinkoncentration blev yderligere sammenlignet ved hjælp af tre protein standard prøver med BCA assay. Det gennemsnitlige CV (7,57 %) af BCA-analysen fra robotten viste sig at være lavere end den menneskelige manuelle BCA-analyse (9,22 %) (supplerende tabel 1).
Den beskrevne protokol viste ensartet ydeevne over tid, når BSA-fordøjelsesprotokollen blev udført med to måneders mellemrum og gav sammenlignelige resultater. Mediantallet af unikke PPM'er og peptider i figur 2 er henholdsvis 728 og 65. De samme eksperimenter udført på OT-2-systemet 2 måneder før genererede i gennemsnit 647 PPM'er og 54 peptider (n = 2) (supplerende tabel 2). Stabilitet på længere sigt kan vurderes på samme måde.
Den manuelle bænkbehandlingstid (inkubationstid er ikke inkluderet) beregnes mellem robotprotokollen og den menneskelige behandling18 pr. prøvepræparat. Med fordøjelsesprotokollen uden fjernelse af vaskemiddel efterfulgt af peptidafsaltning er den manuelle behandlingstid 41 min med robotsystemet vs. 61 min i hånden. Med fjernelse af vaskemiddel, fordøjelse og peptidafsalting protokol er den manuelle behandlingstid 54 min med robotsystemet vs. 79 min i hånden. Derfor reducerer den halvautomatiske protokol ca. 20-25 min hands-on bænkbehandlingstid pr. Prøve. Denne tidsreduktion bliver betydelig, når mange prøver behandles og kan forbedres yderligere, når flere OT-2-robotter anvendes parallelt.
Figur 1: Skematisk arbejdsproces. Proteiner udvundet med vaskemiddel støtte vil kræve behandling med et ekstra trin i vaskemiddel fjernelse før fordøjelsen. Proteinprøver fordøjes, og peptider afsaltet på OT-2 robotsystemet. Peptid fordøjer injiceres i en Q-Exactive HF massespektrometer kombineret med en nano-LC. MS spektre søges mod en protein database for protein identifikation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Robotdæk, der er sat op til proteinfordøjelse. De angivne positioner af spidsstativer, prøver, papirkurven, temperaturmodulet og magnetmodulet vises. Stjerner betegner labware og reagenser, der kun er nødvendige for fordøjelsesprotokollen med vaskemiddelfjernelsestrin. Kasser med tal angiver ubesatte dækpositioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Robot dæk oprettet til peptid oprydning script. De angivne positioner af spidsstativer, prøver, papirkurven og magnetmodulet vises. Kasser med tal angiver ubesatte dækpositioner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Antal peptidspektrumsmatch (PPM'er) og peptider, der er påvist i fordøjelsen af BSA-protein (n = 5). Hver digest blev opdelt i to for teknisk replika peptid oprydning (R1 og R2). Variationskoefficient: 5,2% for PPM'er; 3,2% for peptider. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Antal PPM'er, peptider og proteiner identificeret fra et menneskeligt hjerte lyser. Fem fordøjelser blev udført med FJERNELSE AF SP3-vaskemiddel. Hver digest blev opdelt i to for peptid oprydning (R1 og R2). Variationskoefficienter: 7,6% for PPM'er; 5,9% for peptider; 3,6% for proteiner. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Fordøjelsesenzym | Trypsin/P |
| Maksimal savnet kavalergang | 2 |
| Fast ændring | Carbamidomethylation af cystein |
| Variabel ændring | N-terminal protein acetylation; oxidation af methionin |
| Peptid længdeområde | 7 – 25 aa |
| Massetolerance over for forløbere | ± 16,5 ppm |
| Massetolerance over for MS/MS-ioner | ± 20 ppm |
| Kvantificering uden etiketter | LFQ |
| Falsk opdagelse sats (FDR) for peptid-spektrum match (PSM) | 0.01 |
Tabel 1: Søgeparametrene peptiddatabase (MaxQuant).
| Peptid | Protein-ID | PEP | Median XIC intensitet | CV | |
| LSTSQIPQSQIR | Q92523 | 7.72E-08 | 1.96E+07 | 6.70% | |
| SEDFSLPAYMDR | P13073 | 9.64E-17 | 8.05E+08 | 7.30% | |
| YLQEIYNSNNQK | P02679 | 2.76E-23 | 9.69E+08 | 7.60% | |
| TDDCHPWVLPVVK | P17174 | 4.51E-14 | 4.60E+08 | 8.60% | |
| VIVV BNIANTNCLTASK | P40925 | 7.90E-29 | 1.17E+09 | 8.70% | |
| DYIWNTLNSGR | O75390 | 1.63E-15 | 1.38E+08 | 8.80% | |
| VSVPTHPEAVGDASLTVVK | P13611 | 1.86E-09 | 6.77E+07 | 9.10% | |
| QVAEQFLNMR | P22695 | 3.25E-08 | 1.09E+08 | 9.30% | |
| NTFWDVDGSMVPPEWHR | Q9UI09 | 2.05E-11 | 4.00E+07 | 9.60% | |
| SASDLTWDNLK | P02787 | 5.29E-11 | 1.92E+09 | 9.80% | |
Tabel 2: Emudpakket ionkromatogram (XIC) intensitet kvantificering af 10 peptider.
Supplerende tabel 1: Sammenligning af manuelle og automatiserede BCA-analyser. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende tabel 2: BSA-fordøjelsen blev udført 2 måneder bortset fra de prøver, der blev behandlet i figur 4. Klik her for at downloade denne tabel.
Supplerende fil 1: En kopi af de udviklede Python scripts. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Metodeparametre for det flydende kromatografiprogram til LC-MS/MS-analyse. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Metodeparametre for acquiring shotgun proteomics data ved hjælp af en massespektrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i protokollen
For at opnå den bedste ydeevne bør Der anvendes Opentrons-verificerede labware, moduler og forbrugsvarer, der er kompatible med OT-2. Custom labware kan oprettes efter Opentrons 'instruktion på Reference14. Sørg for at kalibrere OT-2 dæk, pipetter og labware, når de anvendes for første gang. Det er også vigtigt at følge retningslinjerne fra SP3 perler producent til at forberede perler til peptid og protein oprydning. Navnlig under perle- og peptidbindingsreaktionen skal mængden af acetonitril i den bindende reaktion være ≥95%, og perlekoncentrationen skal ≥0,1 μg/μL. Hold peptidkoncentrationen i intervallet 10 μg/mL-5 mg/ml. Med de optimerede parametre i peptidoprydningsscriptet her er acetonitrilvolumenforholdet 95%, perlekoncentrationen er 0,37 μg/μL, og peptidkoncentrationen er i intervallet 14-37 μg/ml. Peptidmassen skønnes at være 40-100 μg i 100 μL fordøjelsesreaktion fra vores erfaring. Til SP3-proteinoprydning blev der anvendt 5-10 μg perler til 1 μg protein og sikrede, at den minimale perlerkoncentration er 0,5 μg/μL under proteinbinding. Den anbefalede proteinkoncentration ligger i intervallet 10 μg/mL-5 mg/mL. Med standardparameteren i det medfølgende script anvendes 1 mg perler til 100 μg protein, og perlekoncentrationen under bindingen er 3,75 μg/μL, mens proteinkoncentrationen er 0,35 mg/mL.
Ændringer og fejlfinding
Standardvariablerne i Python-scripts er optimeret til standardarbejdsgange i vores laboratorium. Brugerne skal justere variablerne for at gøre scripts kompatible med deres programmer, hvis det er nødvendigt. Hvis der observeres lav MS-intensitet, skal du kontrollere, om der er tab af protein eller peptid efter hvert væsentligt protokolafsnit med protein-BCA-analysen og den kvantitative peptidanalyse. Når du bruger protokollen på OT-2 for første gang, skal du observere robothåndtering for hvert trin for at sikre, at robotten udfører procedurer som forventet. I skrivende stund er P50 elektroniske pipette ikke længere tilgængelig i Opentrons butik. Det aktuelle script er blevet ændret for at angive, hvor P20-pipetten kan bruges i stedet. Brugere kan henvise til Opentrons API for at ændre scripts til at bruge andre pipetter, hvis det er nødvendigt.
Begrænsninger af teknikken
På trods af fordelene ved at bruge et robotvæskehåndteringssystem bør der udvises forsigtighed ved udførelsen af væskeoverførsel mellem tekniske replikater. Det anbefales stærkt at overvåge robotten under de indledende opsætnings- og væskehåndteringstrin. Efter robotvæskeoverførslen kan manuel genvinding af restmængder være påkrævet for at undgå tab af prøver og reducere udsving.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder
Denne protokol beskriver en semi-automatiseret massespektrometri-baseret prøveforberedelsesmetode ved hjælp af den billige og open source OT-2 væskehåndteringsrobot. For ganske nylig er andre værker også begyndt at bruge OT-2 mod proteomics applikationer11. Sammenlignet med eksisterende metoder omfatter kendetegnende træk ved denne protokol brugen af en relativt billig, Python-programmerbar robot; inkorporering af halvautomatiske SP3-perler i to trin i prøveforberedelsesprotokollerne, nemlig trinnet til fjernelse af værktøjsmidlet til proteinprøven og afsaltnings-/oprydningstrinnet samt tilgængeligheden af open source Python-scripts til støtte for yderligere udvikling. SP3 Paramagnetiske perler binder proteiner og peptider effektivt og er blevet kombineret med automatiserede væskehåndteringssystemer mod applikationer i proteinoprydning / fjernelse af vaskemiddel før enzymatisk fordøjelse i MS-prøvepræparat11,13.
Tre open source Python scripts er forsynet sammen med denne protokol til forskere. Scriptene kan tilpasses til individuelle eksperimentelle forhold (f.eks. prøvenummer, replikeringsnummer, inkubationstemperatur og tid osv.) og giver mulighed for yderligere udvikling af ændrede arbejdsgange. Protokollerne gav en fremragende 3%-6% tekniske CV'er i antallet af peptider og / eller protein identifikation mellem MS kører i vores laboratorium, sammenlignes med tidligere arbejde på andre flydende håndteringssystemer (<20%)9,11.
Fremtidige ansøgninger
Denne protokol viser nytten af et billigt programmerbart væskehåndteringssystem sammen med SP3-perler til halvautomatisk proteomics prøveforberedelse, som potentielt kan anvendes til massespektrometrilaboratorier og kernefaciliteter for at forbedre effektiviteten af prøvebehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH awards F32-HL149191 til YH; R00-HL144829 til EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 til MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 oprettes ved hjælp af et webbaseret videnskabeligt illustrationsværktøj, BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
