Summary
يتم توفير بروتوكول مفصل وثلاثة نصوص بايثون لتشغيل نظام مناولة سائل روبوتي مفتوح المصدر لإجراء إعداد عينة بروتين شبه آلية لتجارب قياس الطيف الكتلي ، والتي تغطي إزالة المنظفات ، وهضم البروتين ، وخطوات تحلية الببتيد.
Abstract
تتطلب تجارب بروتينات البندقية القائمة على قياس الطيف الكتلي خطوات متعددة لإعداد العينات، بما في ذلك هضم البروتين الأنزيمي وتنظيفه، والتي يمكن أن تستغرق ساعات كبيرة من العمل على مقاعد البدلاء وتمثل مصدرا للتباين من دفعة إلى أخرى. يمكن أن تؤدي أتمتة المختبرات باستخدام روبوتات السحب إلى تقليل العمل اليدوي وزيادة الإنتاجية وزيادة قابلية إعادة إنتاج البحوث. ومع ذلك ، فإن الأسعار الأولية الباهظة لمحطات الأتمتة القياسية تجعلها غير ميسورة التكلفة للعديد من المختبرات الأكاديمية. توضح هذه المقالة سير عمل إعداد عينات البروتينات باستخدام نظام أتمتة مفتوح المصدر ميسور التكلفة (The Opentrons OT-2)، بما في ذلك إرشادات لإعداد خطوات تقليل البروتين والألكلة والهضم والتنظيف شبه الآلية؛ بالإضافة إلى مرافقة نصوص بايثون مفتوحة المصدر لبرمجة نظام OT-2 من خلال واجهة برمجة التطبيقات الخاصة به.
Introduction
تعد بروتينات البندقية القائمة على قياس الطيف الكتلي أداة قوية لقياس وفرة العديد من البروتينات في العينات البيولوجية في وقت واحد. يتم استخدام تجارب البروتينات مع تحليل المعلوماتية الحيوية بشكل روتيني لتحديد المؤشرات الحيوية واكتشاف المجمعات والمسارات البيولوجية المرتبطة بها التي تدعم الآليات المرضية. بفضل خصوصيتها التحليلية العالية ودقتها الكمية المحتملة ، تتمتع بروتينات البندقية أيضا بإمكانات ممتازة لاعتمادها من قبل مرافق البحوث ومختبرات التشخيص لتحليل العينات السريرية دون الحاجة إلى الاعتماد على الأجسام المضادة1,2.
لإعداد عينات البروتين لتحليل البروتينات البندقية ، عادة ما تحتاج البروتينات المستخرجة من العينات البيولوجية (مثل الخلايا والأنسجة) أولا إلى معالجتها باستخدام بروتوكولات طويلة ، بما في ذلك قياس تركيز بروتين العينة ، وتقليل البروتين ، والألكلة ، والهضم الأنزيمي إلى ببتيدات. وعلاوة على ذلك، فإن البروتينات المستخرجة في مخازن التحلل الشائعة التي تحتوي على منظفات غالبا ما تتطلب خطوات إضافية لتبادل المخزن المؤقت أو إزالة المنظفات قبل التحليل لأن المنظفات يمكن أن تتداخل مع هضم التربسين وتؤدي إلى تدهور كبير في أداء تحليل مطياف الكتلة الترادفية للكروماتوغرافيا السائلة في اتجاه المصب (LC-MS/MS) 3. عادة ما يتم تحلية الببتيدات وتجفيفها وإعادة تشكيلها في المذيبات المتوافقة مع LC-MS / MS بعد الهضم الأنزيمي. يمكن أن تكون إجراءات الكيمياء الحيوية للبروتين هذه كثيفة العمالة وتستغرق وقتا طويلا. وبالتالي ، فإنها تستمر في الحد من إنتاجية سير عمل البروتينات والمساهمة في تباين البيانات المكتسبة4,5. تم الاعتراف بالأخطاء والتحيزات البشرية كعوامل حاسمة تؤثر على تباين البيانات وقابليتها للتكرار6،7. وللتقليل إلى أدنى حد من الأخطاء البشرية في سير عمل إعداد عينات قياس الطيف الكتلي، استخدمت النظم الروبوتية للسحب الآلي لتحسين إنتاجية وقابلية تكرار تحديد البروتين وقياسه كميا من بروتينات البندقية وتحليل الطيف الكتلي المستهدف، حيث تم الإشادة بهذه التطورات باعتبارها مفيدة لمواصلة الدفع نحو اعتماد تكنولوجيات البروتيوميات على نطاق واسع في البحوث الحرجة والإعدادات السريرية8، 9,10,11,12,13. ومع ذلك ، تستخدم معظم البروتوكولات الحالية منصات مناولة السوائل الروبوتية التي تتطلب استثمارا وتدريبا كبيرين ، مما يحد من فائدتها في العديد من المختبرات في البيئة الأكاديمية أو بميزانية محدودة.
توضح هذه المقالة بروتوكولا يستخدم نظام معالجة سائل روبوتي منخفض التكلفة ومفتوح المصدر، وهو OT-2، لأتمتة سير عمل نموذجي لإعداد عينات البروتينات البندقية. تتميز OT-2 بتكلفة أقل من العديد من أنظمة مناولة السوائل الروبوتية الأخرى ، وفي وقت كتابة هذا التقرير ، تكلف حوالي 5000 دولار أمريكي. عند الأخذ في الاعتبار أسعار الوحدات والبرامج المخبرية المختلفة ، تبلغ التكلفة الإجمالية لإعداد التجارب في هذا البروتوكول في وقت كتابة هذا التقرير حوالي 10000 دولار ، مما يجعلها أكثر بأسعار معقولة لمجموعة أوسع بكثير من المختبرات على خيارات أكثر تكلفة. يتوافق OT-2 مع البرمجة مفتوحة المصدر من خلال برامج Python النصية ويوفر مرونة كبيرة في تصميم بروتوكول DIY المحدد من قبل المستخدم. باستخدام ثلاثة نصوص مطورة داخليا ، تغطي البروتوكولات أدناه تنفيذ سير عمل نموذجي لإعداد عينات البروتينات البندقية على محطة OT-2 مع معيار بروتين نموذجي (ألبومين مصل البقر; BSA) وعينة بروتين معقدة من غسول قلب الإنسان الطبيعي (الشكل 1). وترد تفاصيل إجراءات معالجة (1) عينة BSA و (2) عينة معقدة من ليزات القلب في أقسام البروتوكول 1 و 2 و 5 و 6 و 3 و 4 و 5 و 6 على التوالي. تستخدم الخرز المغناطيسي المعدل بكربوكسيلات Sera-Mag في إعداد العينات المعززة بالطور الصلب أحادي الوعاء (SP3) لإزالة المنظفات والأملاح في عينات البروتين والببتيد. يتم تنظيف الهضم التربتي من ألبومين مصل البقر وبروتينات القلب البشري بواسطة حبات SP3 وتقديمها لتحليل LC-MS / MS. ثم يتم تحليل أطياف الكتلة باستخدام برنامج MaxQuant لتحديد الببتيد والبروتين. تظهر النتائج التمثيلية التي أجريناها أن البروتوكول يحقق معاملات تقنية ممتازة للاختلاف (CV) مع توفير وقت مقاعد البدلاء وهو غير أدنى من الهضم اليدوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إيداع نصوص Python المطورة على GitHub على: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. وترد نسخة من البرامج النصية في الملف التكميلي 1. يرجى الرجوع إلى مستودع GitHub للحصول على أحدث الإصدارات.
1. الاستعدادات التجريبية
- تحقق من الأجهزة المطلوبة قبل بدء البروتوكول.
ملاحظة: مكونات الأجهزة التالية مطلوبة: ماصات OT-2 ، نصائح الماصة ، مجموعة حامل الأنبوب 4 في 1 ، مجموعة كتل الألومنيوم ، الوحدة المغناطيسية ، وحدة درجة الحرارة ، لوحات الآبار العميقة 96-well 2 مل (انظر جدول المواد).
2. إعداد عينة قياس الطيف الكتلي (MS) باستخدام ألبومين مصل البقر البروتيني (BSA)
- افتح البرنامج النصي NoSP3_digestion.py في محرر نصوص وحدد المتغيرات الخاصة بالتجربة حسب الحاجة في القسم تخصيص هنا فقط.
ملاحظة: تتضمن المتغيرات الخاصة بالتجربة عدد العينات والنسخ المتماثل؛ تركيز العينة؛ حجم الكواشف ديثيوثريتول - DTT ، يودواسيتاميد - IAA ، والتريبسين ؛ وقت حضانة DTT و IAA ، وطرف البداية للماصة P20 / P50 و P300).- افتح تطبيق Opentrons وقم بتحميل البرنامج النصي إلى علامة التبويب PROTOCOL في تطبيق Opentrons.
ملاحظة: يمكن تنزيل تطبيق Opentrons من Reference14 إلى كمبيوتر محلي. في وقت كتابة هذا التقرير ، ماصة Opentrons P50 الإلكترونية غير متاحة للشراء في متجر Opentrons. تم استبداله بالماصة الإلكترونية أحادية القناة P20 المتوافقة مع وحدات التخزين المحددة في البروتوكول. تم تدوين ملاحظات وتعليمات في البرنامج النصي لاستبدال ماصة P50 بماصة P20. قد يحتاج المستخدمون إلى اختبار والتحقق من توافق ماصة معينة مع هذا البروتوكول باتباع تعليمات Opentrons API.
- افتح تطبيق Opentrons وقم بتحميل البرنامج النصي إلى علامة التبويب PROTOCOL في تطبيق Opentrons.
- افتح علامة التبويب ROBOT وقم بإجراء معايرة سطح السفينة الروبوتية معايرة سطح السفينة في علامة التبويب ROBOT باتباع الإرشادات خطوة بخطوة التي تظهر على الشاشة في تطبيق Opentrons.
ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة فقط إذا لم يتم تنفيذها مسبقا أو تم نقل الروبوت مؤخرا. - انقر على زر MANAGE PIPETTES لإجراء معايرة طول الطرف ، متبوعا بمعايرة إزاحة الماصة لمعايرة الطرف الافتراضي وموضع تركيبة الماصة.
ملاحظة: هذه الخطوة مطلوبة إذا تم استخدام ماصة لأول مرة. - ضع أدوات المختبر والماصات المطلوبة في الموقع المقابل في سطح OT-2 المحدد في برنامج Python النصي (الشكل 2).
ملاحظة: تأكد من توصيل وحدة درجة الحرارة وتشغيلها، ووضع كتلة الألومنيوم أعلى وحدة درجة الحرارة. - افتح علامة التبويب معايرة وقم بإجراء معايرة لمزيج من برامج المختبر والماصات المطلوبة في هذا البرنامج النصي python.
ملاحظة: سيقوم تطبيق Opentrons بتسجيل معلمات المعايرة ، وهو أمر غير ضروري للتطبيقات المستقبلية باستخدام نفس البرامج المخبرية والماصات. - تحضير 5 مل من محلول بيكربونات الأمونيوم 100 ملليمتر (ABC) (الرقم الهيدروجيني ~ 8.0) عن طريق إذابة 39.53 ملغ من ABC في الماء بدرجة قياس الطيف الكتلي إلى حجم إجمالي قدره 5 مل في أنبوب مخروطي 15 مل. ضع المخزن المؤقت لبيكربونات الأمونيوم في بئر A1 من رف الأنبوب 4 في 1 مع سطح حامل الأنبوب 15 مل + 50 مل.
- تحضير 1 مل من بروتين ألبومين مصل البقر (BSA) في أنبوب بروتين منخفض الارتباط سعة 2.0 مل (انظر جدول المواد). ضع العينة في بئر A1 من حامل الأنبوب 4 في 1 مع سطح حامل الأنبوب سعة 2 مل.
- ضع يدويا أنابيب بروتين منخفضة الارتباط سعة 2.0 مل في آبار A1 و B1 و C1 و D1 و E1 و F1 و A2 وما إلى ذلك في كتلة الألومنيوم أعلى وحدة درجة الحرارة.
ملاحظة: ستقوم الماصة الروبوتية بتوزيع العينات بالترتيب الرأسي بدءا من A1 (العينة الأولى) حتى العينة الأخيرة بشكل افتراضي. يمكن تحديد التوزيع الأفقي. راجع إلى15 للحصول على التفاصيل. وينبغي أن يساوي العدد الإجمالي للأنابيب التي يلزم تحضيرها العدد الإجمالي للعينات (أي عدد العينات البيولوجية مضروبا في عدد النسخ المتماثلة التقنية لكل عينة). - تحضير 1 مل من 60 ملليمتر DTT عن طريق إذابة 9.26 ملغ من المواد الصلبة DTT في الماء الصف قياس الطيف الكتلي إلى حجم إجمالي قدره 1 مل. ضع DTT في بئر A6 من حامل الأنبوب 4 في 1 مع سطح حامل الأنبوب سعة 2 مل.
تنبيه: DTT ضار بالعيون البشرية والجلد والجهاز التنفسي. ارتداء معدات الوقاية الشخصية والتعامل معها تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية. ارجع إلى ورقة بيانات السلامة الخاصة بالشركة المصنعة لمعرفة الإجراءات المناسبة. - لاحظ بينما ينقل الروبوت حجما مناسبا من المخزن المؤقت ABC إلى أنابيب العينة في كتلة الألومنيوم.
ملاحظة: الحجم الإجمالي لمزيج ABC والبروتين في كل أنبوب هو 100 ميكرولتر ، ويتم حساب حجم المخزن المؤقت ABC في البرنامج النصي (V = 100 ميكرولتر ناقص حجم 100 ميكروغرام من عينة البروتين). - تأكد من أن الروبوت ينقل 100 ميكروغرام من بروتين BSA إلى كل أنبوب باستخدام المخزن المؤقت ABC.
ملاحظة: قد تستخدم التجربة النموذجية ما يصل إلى 100 ميكروغرام من البروتينات لهضم البروتين، أي 50 ميكرولتر من 2.0 ميكروغرام/ميكرولتر لعينة BSA هذه. - تحقق يدويا من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من تحميل DTT في A6 من حامل الأنبوب سعة 2 مل الموجود في الفتحة 4 قبل استئناف البروتوكول. تأكد من وضع أنبوب DTT في بئر A6 وافتح غطاءه. انقر فوق الزر استئناف في تطبيق Opentrons للمتابعة. تأكد من أن الروبوت ينقل 10 ميكرولتر من محلول DTT إلى كل عينة بشكل جيد ، تليها خمس جولات خلط.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من إغلاق الأحرف الكبيرة على أنابيب العينات. أغلق أغطية الأنابيب يدويا وانقر على استئناف للمتابعة. انتظر حتى تبدأ وحدة درجة حرارة الروبوت في تسخين كتلة الألومنيوم حتى تصل درجة الحرارة إلى 55 درجة مئوية ، تليها حضانة لمدة 5 دقائق للسماح للعينات بالوصول إلى 55 درجة مئوية.
ملاحظة: سيحتفظ الروبوت بدرجة الحرارة عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح بتقليل البروتين بواسطة DTT أثناء الحضانة. - خلال 30 دقيقة من حضانة DTT ، قم بإعداد 1 مل من 187.5 ملليمتر يودواسيتاميد (IAA) عن طريق إذابة 34.68 ملغ من IAA في المخزن المؤقت ABC إلى حجم إجمالي قدره 1 مل. قم بلف محلول IAA يدويا بورق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء.
تحذير: يمكن أن يسبب IAA تهيجا شديدا للعين والجهاز التنفسي. تعامل معها تحت غطاء كيميائي يرتدي معدات الوقاية الشخصية المناسبة. - تأكد من أن وحدة درجة حرارة الروبوت تبرد عند إكمال خطوة حضانة DTT لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: بعد أن تصل درجة حرارة الوحدة إلى 22 درجة مئوية، تحافظ الوحدة على درجة الحرارة لمدة 5 دقائق للسماح للعينات بالتبريد الكامل. - قم بإلغاء تحديد أنابيب العينة عند إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض رسالة التحذير: تأكد من فتح الأحرف الكبيرة على أنابيب العينة. انقر على استئناف للمتابعة.
- تحقق يدويا من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا برسالة تحذير: تأكد من تحميل IAA في B6 من حامل الأنبوب سعة 2 مل الموجود في الفتحة 4 قبل استئناف البروتوكول. تأكد من موقع الحامل لأنبوب IAA وافتح غطاء الأنبوب. انقر على استئناف للمتابعة. تأكد من أن الروبوت ينقل 10 ميكرولتر من IAA إلى كل أنبوب عينة متبوعا بخمس جولات خلط.
- قم بتغطية أنابيب العينة عند إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: أغلق الأغطية على أنابيب العينة وقم بتغطية أنابيب العينة بورق القصدير. قم بتغطية كتلة الألومنيوم بأكملها بقطعة نظيفة من الرقائق المعدنية. انقر على استئناف للمتابعة. انتظر حتى يتم تحضين العينات عند 22 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تأكد من تعطيل وحدة درجة حرارة الروبوت عند الانتهاء من حضانة IAA.
- تحضير خليط من محلول التربسين أثناء حضانة IAA (الخطوة 2.19) عند التركيز النهائي 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر: قم بإذابة 20 ميكروغرام من مطياف الكتلة / التربسين من الدرجة التسلسلية في 100 ميكرولتر من الماء MS-grade.
- ضع محلول التربسين في بئر C6 من رف الأنبوب سعة 2 مل مع فتح غطاء الأنبوب عند إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض رسالة التحذير: تأكد من تحميل التربسين في C6 من رف الأنبوب سعة 2 مل الموجود في الفتحة 4 قبل استئناف البروتوكول. انقر على استئناف للمتابعة.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض رسالة التحذير: افتح أغطية على أنابيب العينة في وحدة درجة الحرارة. قم بإلغاء تحديد أنابيب العينة وانقر فوق استئناف للمتابعة. قف متفرجا بينما ينقل الروبوت 10 ميكرولتر من التربسين إلى كل أنبوب عينة متبوعا بخمس جولات خلط.
- قم بلف أغطية أنبوب العينة بفيلم البارافين ، ونقل جميع العينات إلى خلاط يتم التحكم في درجة حرارته ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة مع اهتزاز 600 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: يمكن أيضا إجراء هضم التربسين مباشرة على وحدة درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
3. تنظيف الببتيد باستخدام حبات SP3 شبه المغناطيسية
- في اليوم التالي بعد هضم التربسين بين عشية وضحاها، قم بتدوير العينات لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة (≤2000 × جم) (انظر جدول المواد) ووضع العينات على رف أنبوب مغناطيسي. دع العينات تقف لمدة 2 دقيقة.
- انقل المادة الفائقة بعناية باستخدام ماصة إلى مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي الدقيق منخفضة الارتباط بالبروتين. احتفظ بالعينات في الثلاجة وانتقل إلى الخطوات من 3.2 إلى 3.9.
ملاحظة: للتخزين على المدى الطويل، قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
- انقل المادة الفائقة بعناية باستخدام ماصة إلى مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي الدقيق منخفضة الارتباط بالبروتين. احتفظ بالعينات في الثلاجة وانتقل إلى الخطوات من 3.2 إلى 3.9.
- افتح البرنامج النصي SP3_peptide_cleanup.py Python في محرر نصوص وحدد حسب الحاجة في قسم تخصيص هنا فقط.
ملاحظة: تتضمن المتغيرات الخاصة بالتجربة عدد العينات والنسخ المتماثلة، وحجم الببتيدات المراد نقلها، وحجم الكواشف (الخرز، والأسيتونيتريل، وDMSO)، وطرف البدء للماصات P20/P50 وP300، والبدء بشكل جيد في صفيحة البئر العميقة على الوحدة المغناطيسية. تحتوي كل عينة من ملخصات BSA على حوالي 120 ميكرولتر من حجم الهضم ، والتي سيتم تقسيمها إلى نسختين متماثلتين تقنيتين مع 55 ميكرولتر في كل نسخة متماثلة. لتنظيف نصف الملخص فقط، قم بتغيير متغير رقم النسخ المتماثل إلى 1. - قم بتحميل البرنامج النصي إلى علامة التبويب PROTOCOL في تطبيق Opentrons .
- ضع أدوات المختبر والماصات المطلوبة في الموقع المقابل في سطح OT-2 المحدد في برنامج Python النصي (الشكل 3). تأكد من تشغيل الوحدة المغناطيسية وتوصيلها بالروبوت. ضع صفيحة بئر جديدة بعمق 2 مل و96 بئرا (انظر جدول المواد) في الجزء العلوي من الوحدة المغناطيسية.
- افتح علامة التبويب معايرة وقم بإجراء معايرة لمزيج من برامج المختبر والماصات المطلوبة في هذا البرنامج النصي Python.
ملاحظة: يجب إجراء المعايرة لنفس مجموعات الأدوات المخبرية والماصة مرة واحدة فقط، وسيقوم تطبيق Opentrons بتسجيل معلمات المعايرة. - ضع العينات المهضومة (المادة الفائقة التي تم جمعها في الخطوة 3.1) على رف الأنبوب سعة 2.0 مل بالترتيب الرأسي في الآبار A1 و B1....
- قم بإعداد 15 مل من الأسيتونيتريل المتوافق مع LC-MS / MS في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وضع الأنبوب في البئر A3 في رف الأنبوب 4 في 1 مع سطح حامل الأنبوب 15 مل + 50 مل.
- قم بإعداد 5 مل من 2٪ DMSO عن طريق إضافة 100 ميكرولتر DMSO مع 4.9 مل من الماء بدرجة قياس الطيف الكتلي في أنبوب مخروطي 15 مل. ضع الأنبوب في البئر A1 في رف الأنبوب 15 مل + 50 مل.
- قم بتسمية أنبوب مخروطي فارغ سعة 50 مل كنفايات وضعه في البئر B3 في رف الأنبوب سعة 15 مل + 50 مل.
- قم بإعداد خرز SP3 باتباع Reference16.
- قم بإعداد كمية مناسبة من الخرز المختلط في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2.0 مل.
ملاحظة: يتطلب كل تفاعل تنظيف الببتيد 10 ميكرولتر من الخرز المختلط. على سبيل المثال ، قم بإعداد ما لا يقل عن 40 ميكرولتر من الخرز المختلط لأربعة تفاعلات تنظيف. - دع خليط الخرز يجلس على الحامل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة. قم بإزالة supernatant بعناية باستخدام ماصة وقياس حجم supernatant باستخدام ماصة.
- احسب الحجم المتبقي من الخرز وأضف 5-10 أضعاف ماء درجة قياس الطيف الكتلي (على سبيل المثال ، 100-200 ميكرولتر من الماء ل 20 ميكرولتر من الخرز) والدوامة (السرعة 10) لمدة 10 ثوان. اجلس الخرز على الحامل المغناطيسي لمدة 2 دقيقة.
- كرر خطوات الغسيل بالماء لما مجموعه ثلاث غسلات.
- أعد تعليق الخرز النهائي في الماء من الدرجة MS إلى تركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام / ميكرولتر. ضع الخرز المغناطيسي المغسول في البئر A6 في الرف الأنبوبي سعة 2.0 مل.
ملاحظة: يوصى بإعادة تعليق الخرز بتركيز 10 ميكروغرام/ميكرولتر16. وفي جهد التحسين الحالي، عدل التركيز النهائي إلى 50 ميكروغرام/ميكرولتر لتقليل الحجم الإجمالي لخليط الخرز والببتيد والأسيتونيتريل إلى أدنى حد.
- قم بإعداد كمية مناسبة من الخرز المختلط في أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2.0 مل.
- تأكد من أن الروبوت ينقل 55 ميكرولتر من العينات المهضومة إلى الآبار في ألواح الآبار العميقة على الوحدة المغناطيسية.
- تحقق من إيقاف بروتوكول الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من تحميل الخرز الجاهز في A6 من حامل الأنبوب سعة 2 مل الموجود في الفتحة 4 قبل استئناف البروتوكول. قم بتدوير الخرز ، ثم قم بالدوران لفترة وجيزة لمدة 5 ثوان على جهاز طرد مركزي صغير على الطاولة وضع الخرز في بئر A6 من رف الأنبوب سعة 2 مل مع فتح الغطاء. قف متفرجا بينما يمزج الروبوت الخرز 10 مرات لمدة خمس جولات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
ملاحظة: ينقل الروبوت 10 ميكرولتر من الخرز إلى كل عينة مهضومة في ألواح الآبار العميقة تليها خمس مرات من الخلط. - تأكد من أن الروبوت ينقل 1292 ميكرولتر من الأسيتونيتريل إلى كل بئر ويخلط على الفور 10 مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل لتسهيل ربط الببتيدات والخرز.
ملاحظة: يتم إكمال كل عملية نقل على عدة جولات لأن ماصة P300 يمكنها فقط نقل ما يصل إلى 300 ميكرولتر في المرة الواحدة. - تأكد من أن الروبوت يمزج جميع العينات خمس مرات عن طريق السحب لأعلى ولأسفل في لوحة البئر العميقة.
- انتظر حتى يتم تشغيل الوحدة المغناطيسية ويتم احتضان العينات على الوحدة لمدة 2 دقيقة.
- قف متفرجا بينما يتم ضبط سرعات الشفط والتوزيع على التباطؤ عند 25 ميكرولتر/ثانية من المستوى الافتراضي البالغ 150 ميكرولتر/ثانية.
ملاحظة: يزيل الروبوت ببطء المادة الفائقة من كل بئر ويتخلص منها في أنبوب النفايات أثناء تشغيل الوحدة المغناطيسية. - انتظر حتى يتم إرجاع شفط السحب وسرعات التوزيع إلى الإعداد الافتراضي. لاحظ أن الوحدة المغناطيسية تنفصل.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من إيقاف تشغيل غطاء أنبوب ACN. قم بفك غطاء أنبوب الأسيتونيتريل يدويا وضعه مرة أخرى على رف الأنبوب. انقر على استئناف للمتابعة. تأكد من أن الروبوت ينقل 1 مل من الأسيتونيتريل لغسل كل عينة ويخلط على الفور 10 مرات.
- تأكد من أن الروبوت يخلط جميع العينات 10 مرات لغسل العينات.
- قف بجانبك أثناء تشغيل الوحدة المغناطيسية وحضن العينات لمدة 2 دقيقة.
- انتظر حتى يغير الروبوت سرعة شفط السحب لإبطاء ويزيل ببطء المادة الفائقة ويوزعها في أنبوب النفايات.
- لاحظ بينما يحتضن الروبوت العينات الموجودة على الوحدة المغناطيسية لمدة 60 ثانية للسماح للأسيتونيتريل المتبقي بالتبخر ، ثم يغير سرعات شفط السحب مرة أخرى إلى الوضع الافتراضي. لاحظ أن الوحدة المغناطيسية تصبح غير مرتبطة.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: Vortex DMSO مرة أخرى وفتح الأحرف الكبيرة. قم يدويا بتدوير DMSO بنسبة 2٪ لمدة 10 ثوان ووضعه مرة أخرى في بئر A1 في الرف الأنبوبي 15 mL-50 mL. انقر على استئناف للمتابعة.
- تأكد من أن الروبوت ينقل 80 ميكرولتر من 2٪ DMSO إلى كل بئر ويخلط على الفور 10 مرات.
- تأكد من أن الروبوت يخلط جميع العينات 10 مرات لمدة خمس جولات إضافية.
- قف بجانبك أثناء تشغيل الوحدة المغناطيسية وحضن العينات لمدة 2 دقيقة.
- لاحظ بينما يغير الروبوت سرعة شفط الماصة إلى إبطاء (25 ميكرولتر / ثانية) وينقل ببطء المادة الفائقة إلى الآبار الفارغة في صفيحة البئر العميقة.
- انتظر حتى يحتضن الروبوت العينات على الوحدة المغناطيسية لمدة 2 دقيقة لإزالة الخرز المتبقي في العينات.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: ضع أنابيب سعة 2 مل جديدة في رف الأنبوب سعة 2 مل وتأكد من أن عدد الأنابيب يطابق العدد الإجمالي للعينات.
- ضع أول أنبوب طرد مركزي صغير سعة 2 مل في البئر مباشرة بعد عينة هضم BSA النهائية. انقر على استئناف للمتابعة.
ملاحظة: على سبيل المثال، عينات خلاصة BSA الست التي تم اختبارها في هذا البروتوكول موجودة في الآبار A1 و B1 و C1 و D1 و A2 و B2. لذلك ، يتم وضع المجموعة الجديدة من أنابيب 2.0 مل في الآبار B3 ، C3 ، D3 ، ... وهلم جرا. - لاحظ بينما ينقل الروبوت 88 ميكرولتر من العينات من الآبار في صفيحة البئر العميقة إلى المجموعة الجديدة من أنابيب 2.0 مل.
ملاحظة: تم تحسين الحجم المنقول (1.1 × 80 ميكرولتر) في البروتوكول لضمان شفط حجم العينة بالكامل في أطراف ماصة. - قف متفرجا بينما يغير الروبوت سرعة شفط الماصة إلى الوضع الافتراضي ويفصل الوحدة المغناطيسية.
- جفف الببتيدات التي تم تنظيفها يدويا في مبخر فراغي (انظر جدول المواد) وانتقل إلى القسم 5 أو قم بتخزين العينات المجففة عند -20 درجة مئوية.
4. إعداد عينة MS مع بروتين محلل القلب البشري (5 ملغ / مل) مع حبات SP3 شبه المغناطيسية
- افتح البرنامج النصي Python SP3_digestion.py وحدد قيم المتغيرات في القسم تخصيص هنا فقط.
ملاحظة: تشمل المتغيرات عدد العينات والنسخ المتماثل ، وتركيز العينة ، وحجم الكواشف (DTT ، IAA ، التربسين ، الخرز ، 100٪ و 80٪ من الإيثانول) ، وقت حضانة DTT و IAA ، طرف البدء للماصات P20 / P50 و P300 ، والبدء بشكل جيد في لوحة البئر العميقة على الوحدة المغناطيسية. - اتبع الخطوات 2.2-2.23 في القسم 2 لإعداد عينة التصلب المتعدد باستخدام ألبومين مصل البقر البروتيني الواحد لحضانة DTT و IAA. ارجع إلى الشكل 1 لإعداد سطح الروبوت في تلك الخطوات.
- قم بإعداد مزيج حبات SP3 طازج (20 ميكرولتر من الخرز لكل تفاعل تنظيف) لتنظيف البروتين (كما هو محدد في الخطوة 3.10) أثناء خطوات حضانة DTT و IAA (الخطوتان 2.15 و 2.19). ضع الخرز في بئر D6 على رف الأنبوب سعة 2 مل.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا مع الرسالة: افتح أغطية الأنبوب. قم بفك غطاء أنابيب العينة يدويا في كتلة الألومنيوم أعلى وحدة درجة الحرارة وانقر فوق استئناف للمتابعة.
- تأكد من أن الروبوت ينقل جميع العينات من أنابيب سعة 2.0 مل إلى لوحة بئر عميقة جديدة أعلى الوحدة المغناطيسية.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من تحميل الخرز الجاهز في D6 من رف الأنبوب سعة 2 مل الموجود في الفتحة 4 قبل استئناف البروتوكول. افتح غطاء أنبوب الخرز وانقر على استئناف للمتابعة.
- لاحظ بينما ينقل الروبوت 20 ميكرولتر من الخرز إلى كل بئر في صفيحة البئر العميقة مع خمس جولات من خلط الخرز وخمس جولات من خلط خليط العينات والخرز.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من تحميل الإيثانول بنسبة 100٪ في A3 من رف الأنبوب 15 mL-50 mL الموجود في الفتحة 5 قبل استئناف البروتوكول. قم بإعداد 10-20 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ (أي 200 إيثانول مقاوم ، انظر جدول المواد) في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وضعه في بئر A3 من الرف. انقر على استئناف للمتابعة.
- قف متفرجا بينما ينقل الروبوت 140 ميكرولتر من الإيثانول 100٪ إلى كل بئر في اللوحة تليها مباشرة 10 جولات من الخلط لتسهيل ارتباط الببتيدات بالخرز.
- تأكد من أن الروبوت يمزج كل عينة عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات في كل جولة لما مجموعه خمس جولات من الخلط.
- قف متفرجا أثناء تشغيل الوحدة المغناطيسية وحضن العينات الموجودة على الوحدة لمدة 2 دقيقة.
- لاحظ بينما يغير الروبوت سرعة السحب إلى إبطاء (25 ميكرولتر / ثانية) ويشفط المادة الفائقة من كل بئر ويوزعها في أنبوب النفايات.
- انتظر حتى يغير الروبوت سرعة السحب مرة أخرى إلى الوضع الافتراضي ويفصل الوحدة المغناطيسية.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من تحميل 80 بالمائة من الإيثانول في A4 من رف الأنبوب 15 mL-50 mL الموجود في الفتحة 5 قبل استئناف البروتوكول. قم بإعداد 20 مل من الإيثانول بنسبة 80٪ يدويا عن طريق خلط 4 مل من الماء من الدرجة MS مع 16 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ (أي 200 دليل). ضع الإيثانول بنسبة 80٪ في بئر A4 في رف الأنبوب. انقر على استئناف للمتابعة. تأكد من أن الروبوت ينقل 1 مل من 80٪ من الإيثانول إلى كل بئر ويخلط على الفور 10 مرات.
- لاحظ بينما يغير الروبوت سرعة السحب إلى إبطاء (25 ميكرولتر / ثانية) ، ويشفط المادة الفائقة من كل بئر ، ويوزع في أنبوب النفايات. انتظر حتى يغير الروبوت سرعة السحب مرة أخرى إلى الوضع الافتراضي ويفصل الوحدة المغناطيسية.
- افتح غطاء حل ABC عند إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: افتح الغطاء على أنبوب ABC. انقر على استئناف للمتابعة. قف متفرجا بينما يقوم الروبوت بفصل الوحدة المغناطيسية ، وينقل 250 ميكرولتر من ABC إلى كل بئر ، ويخلط على الفور لمدة 10 مرات.
ملاحظة: هذه الخطوة هي غسل العينات باستخدام ABC. - تأكد من أن الروبوت يشرك الوحدة المغناطيسية ويحتضن العينات على الوحدة لمدة 2 دقيقة.
- لاحظ بينما يغير الروبوت سرعة السحب إلى إبطاء (25 ميكرولتر / ثانية) وينقل المادة الفائقة من كل بئر إلى أنبوب النفايات. انتظر حتى ينقل الروبوت 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت ABC إلى كل بئر ويخلط على الفور لمدة 10 مرات.
- تحقق من إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من وضع أنابيب تجميع جديدة في كتلة ألومنيوم سعة 2.0 مل قبل استئناف البروتوكول. ضع مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي الدقيق منخفضة الاحتفاظ بالبروتين في كتلة الألومنيوم مباشرة بعد أنبوب العينة الأخير في البداية في الكتلة. انقر على استئناف للمتابعة. قف متفرجا بينما ينقل الروبوت كل عينة في المخزن المؤقت ABC إلى أنابيب 2.0 مل الجديدة.
ملاحظة: افحص الآبار وانقل يدويا أي عينة متبقية إلى الأنابيب إذا لزم الأمر. - قم بإعداد كمية مناسبة من التربسين من الدرجة MS (10 ميكرولتر لكل عينة) عن طريق إذابة 20 ميكروغرام من التربسين من الدرجة MS في الماء من الدرجة MS إلى تركيز نهائي قدره 0.2 ميكروغرام / ميكرولتر عند إيقاف برنامج الروبوت مؤقتا وعرض الرسالة: تأكد من تحميل التربسين (0.2 ميكروغرام / ميكرولتر) في C6 من أنبوب حامل 2 مل الموجود في الفتحة 4 قبل بروتوكول الاستئناف. تأكد من أن الروبوت ينقل 10 ميكرولتر من التربسين إلى كل أنبوب عينة ، تليها خمس جولات من الخلط.
- قم بلف أغطية أنبوب العينة بفيلم البارافين ، وانقل جميع العينات إلى خلاط يتم التحكم في درجة حرارته ، واحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة مع اهتزاز 1000 دورة في الدقيقة.
ملاحظة: يوصى بإجراء عملية الهضم مع اهتزاز 1000 دورة في الدقيقة لتقليل هطول الأمطار على الخرز أثناء الحضانة الليلية.
5. تنظيف الببتيد باستخدام حبات SP3 شبه المغناطيسية
- اتبع التعليمات التدريجية في الخطوة 2 ، تنظيف الببتيد باستخدام حبات SP3 شبه المغناطيسية.
6. الكروماتوغرافيا السائلة ومطياف الكتلة
- أعد تعليق الببتيدات BSA (الخطوات 2-3) وببتيدات تحلل القلب (الخطوة 4) في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪ عن طريق إضافة 1 مل LC-MS من الدرجة 99٪ من حمض الفورميك في ماء MS إلى حجم إجمالي قدره 1 لتر.
تنبيه: حمض الفورميك هو حمض قوي. إنه شديد التآكل للعينين والجلد والجهاز التنفسي. تعامل بحذر تحت غطاء كيميائي يرتدي معدات الوقاية الشخصية. - قم بقياس تركيز الببتيد بعد الهضم باستخدام مجموعة مقايسة الببتيد الكمية17 وحقن 0.5 ميكروغرام من هضم BSA و 1.5 ميكروغرام من هضم القلب لتحليل LC-MS / MS.
- قم بإعداد برنامج الكروماتوغرافيا السائلة لتحليل LC-MS/MS.
ملاحظة: في الإعداد النموذجي، يمكن تحميل هضم الببتيد على عمود C18 ذو طور معكوس (جسيم 3 ميكرومتر؛ 100 مسام Å؛ 75 ميكرومتر × 150 مم؛ انظر جدول المواد) باستخدام المعلمات الواردة في الملف التكميلي 2. - الحصول على بيانات بروتينات البندقية باستخدام مطياف الكتلة (انظر جدول المواد) باستخدام المعلمات الواردة في الملف التكميلي 3.
- ابحث في قاعدة بيانات البروتين عن تحديد البروتين.
- قم بتنزيل وتثبيت البرنامج المطلوب ، MaxQuant.
ملاحظة: تم استخدام برنامج MaxQuant (الإصدار 1.6.10.43) هنا للخطوات التالية (انظر جدول المواد). - قم بتنزيل قاعدة بيانات البروتيوم البشري المنسقة من قاعدة بيانات تسلسل البروتين عالية الجودة (UniProt / SwissProt) (انظر جدول المواد). انقر فوق الزر تنزيل واختر FASTA (أساسي).
ملاحظة: اختياريا، قم بتنزيل FASTA (غير أساسي) لتضمين أشكال البروتين المتماثلة لكل جين في قاعدة البيانات، إذا رغبت في ذلك. - في واجهة برنامج MaxQuant ، حدد ملف FASTA لاستخدامه كقاعدة بيانات للبروتين عن طريق الانتقال إلى لوحة المعلمات العالمية وانقر فوق علامة التبويب التسلسلات ؛ ثم انقر فوق الزر إضافة لتحديد مسار الملف إلى ملف FASTA.
- في واجهة برنامج MaxQuant ، حدد ملفات الطيف الكتلي الخام المكتسبة ليتم تحليلها بالانتقال إلى لوحة البيانات الخام والنقر فوق الزر تحميل وتحديد الملف (الملفات) الخام.
- قم بإعداد معلمات البحث كما هو موضح في الجدول 1. تمكين القياس الكمي الخالي من الملصقات (LFQ) إذا لزم الأمر.
- انتظر حتى يكتمل البحث، وحدد موقع عدد تطابقات طيف الببتيد (PSMs) التي تجتاز عتبات FDR 1٪ في ملف msms.txt في المجلد /combined/txt.
ملاحظة: في المقارنات التي أجريت هنا لقسم النتائج التمثيلية، تمت تصفية PSMs التي تم تعيينها إلى بروتينات متعددة، وتم الاحتفاظ ب PSMs التي تم تعيينها إلى بروتين فريد واحد لحساب عدد PSMs والببتيدات والبروتينات (الشكل 4 والشكل 5).
- قم بتنزيل وتثبيت البرنامج المطلوب ، MaxQuant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم توفير ثلاثة نصوص Python هنا متوافقة مع الروبوت OT-2 ، والتي تقوم بإعداد عينة لبروتينات قياس الطيف الكتلي مع ألبومين مصل البقر القياسي للبروتين الواحد (النسخ المتماثلة التقنية n = 5 عمليات الهضم) وعينة من تحلل القلب البشري المحتوي على المنظفات (n = 5 عمليات هضم). يتم تقسيم كل منتج هضم إلى تفاعلين لتنظيف الببتيد. يظهر الشكل 4 والشكل 5 عدد تطابقات طيف الببتيد المحددة (PSMs) والببتيدات والبروتينات في كل جولة من عينات BSA والقلب. تم تحديد متوسط 728 PSMs و 65 الببتيد مع عينة BSA ، مع معاملات التباين 5.2 ٪ و 3.2 ٪ (CV) ، على التوالي. مع عينة القلب المعقدة ، تم تحديد متوسط 9,526 PSMs ، و 7,558 الببتيدات ، و 1,336 بروتين في 10 أشواط مع معامل التباين 7.6٪ و 5.9٪ و 3.6٪. تم تحديد ما مجموعه 1,935 بروتينا من 10 أشواط من عينة القلب، ومن بين هؤلاء، تم تحديد 1,677 بروتينا في جولتين أو أكثر. لتحديد التباين في القياس الكمي للببتيد، تم حساب CV لكراسة الكروموجرام الأيوني المستخرج (XIC) ل 10 ببتيدات تم تعيينها إلى بروتين فريد (الجدول 2). تمت مقارنة التباينات بين النتائج التجريبية البشرية (الماصة يدويا) مقابل النتائج التجريبية للروبوت حول قياس تركيز البروتين باستخدام ثلاث عينات قياسية للبروتين مع فحص BCA. وجد أن متوسط السيرة الذاتية (7.57٪) من فحص BCA الآلي أقل من فحص BCA اليدوي البشري (9.22٪) (الجدول التكميلي 1).
أظهر البروتوكول الموصوف أداء ثابتا بمرور الوقت عندما تم تنفيذ بروتوكول الهضم BSA على بعد 2 أشهر وأسفر عن نتائج مماثلة. ويبلغ متوسط عدد الببتيدات والببتيدات الفريدة من نوع PSMs في الشكل 2 728 و65 على التوالي. نفس التجارب التي أجريت على نظام OT-2 قبل شهرين ولدت ما معدله 647 PSMs و 54 الببتيد (n = 2) (الجدول التكميلي 2). ويمكن تقدير الاستقرار على المدى الطويل بالمثل.
يتم حساب وقت المعالجة اليدوية للمقاعد (وقت الحضانة غير مدرج) بين بروتوكول الروبوت والمعالجة البشرية18 لكل إعداد عينة. مع بروتوكول الهضم دون إزالة المنظفات تليها إزالة الملح الببتيد ، فإن وقت المعالجة اليدوية هو 41 دقيقة مع النظام الروبوتي مقابل 61 دقيقة باليد. مع بروتوكول إزالة المنظفات والهضم وتحلية الببتيد ، يكون وقت المعالجة اليدوية 54 دقيقة مع النظام الروبوتي مقابل 79 دقيقة باليد. لذلك ، يقلل البروتوكول شبه الآلي من حوالي 20-25 دقيقة من وقت المعالجة العملية على مقاعد البدلاء لكل عينة. يصبح هذا التخفيض الزمني كبيرا عند معالجة العديد من العينات ويمكن تحسينه بشكل أكبر عند استخدام العديد من روبوتات OT-2 بالتوازي.
الشكل 1: سير العمل التخطيطي. تتطلب البروتينات المستخرجة بمساعدة المنظفات المعالجة بخطوة إضافية لإزالة المنظفات قبل الهضم. يتم هضم عينات البروتين ، ويتم تحلية الببتيدات على النظام الروبوتي OT-2. يتم حقن هضم الببتيد في مطياف كتلة Q-Exactive HF مقترنا ب nano-LC. يتم البحث في أطياف التصلب المتعدد مقابل قاعدة بيانات البروتين لتحديد البروتين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: سطح الروبوت الذي تم إعداده لهضم البروتين. يتم عرض المواضع المحددة لرفوف الأطراف والعينات والقمامة ووحدة درجة الحرارة والوحدة المغناطيسية. تشير العلامات النجمية إلى المختبرات والكواشف المطلوبة فقط لبروتوكول الهضم مع خطوات إزالة المنظفات. تشير المربعات ذات الأرقام إلى مواقع سطح السفينة غير المشغولة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: إعداد سطح الروبوت للبرنامج النصي لتنظيف الببتيد. يتم عرض المواضع المحددة لرفوف الأطراف والعينات والقمامة والوحدة المغناطيسية. تشير المربعات ذات الأرقام إلى مواقع سطح السفينة غير المشغولة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: عدد تطابقات طيف الببتيد (PSMs) والببتيدات المكتشفة في عمليات هضم بروتين BSA (n = 5). تم تقسيم كل ملخص إلى قسمين لتنظيف الببتيد المكرر تقنيا (R1 و R2). معامل الاختلافات: 5.2٪ ل PSMs ؛ 3.2 ٪ للببتيدات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: عدد PSMs والببتيدات والبروتينات المحددة من ليزات قلب الإنسان. تم إجراء خمس عمليات هضم مع إزالة منظف SP3. تم تقسيم كل هضم إلى قسمين لتنظيف الببتيد (R1 و R2). معاملات التباين: 7.6٪ ل PSMs ؛ 5.9 ٪ للببتيدات. 3.6 ٪ للبروتينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| إنزيم الهضم | التربسين / P |
| الحد الأقصى من الانقسام الضائع | 2 |
| تعديل ثابت | كارباميدومثيل السيستين |
| تعديل المتغير | أستيل البروتين N-الطرفية. أكسدة الميثيونين |
| نطاق طول الببتيد | 7 – 25 أ أ |
| التسامح الكتلي السلائف | ± 4.5 صفحة في الدقيقة |
| MS / MS أيونات التسامح الكتلة | ± 20 صفحة في الدقيقة |
| القياس الكمي الخالي من الملصقات | إل إف كيو |
| معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) لمطابقة طيف الببتيد (PSM) | 0.01 |
الجدول 1: معلمات البحث في قاعدة بيانات الببتيد (MaxQuant).
| الببتيد | معرف البروتين | بيب | متوسط كثافة XIC | كوفيد | |
| LSTSQIPQSQIR | س92523 | 7.72E-08 | 1.96E+07 | 6.70% | |
| SEDFSLPAYMDR | ص13073 | 9.64E-17 | 8.05E+08 | 7.30% | |
| YLQEIYNSNNQK | ص02679 | 2.76E-23 | 9.69E+08 | 7.60% | |
| TDDCHPWVLPVVK | ص17174 | 4.51E-14 | 4.60E+08 | 8.60% | |
| VIVVGNPANTNCLTASK | ص40925 | 7.90E-29 | 1.17E+09 | 8.70% | |
| DYIWNTLNSGR | O75390 | 1.63E-15 | 1.38E+08 | 8.80% | |
| VSVPTHPEAVGDASLTVVK | ص13611 | 1.86E-09 | 6.77E+07 | 9.10% | |
| QVAEQFLNMR | ص22695 | 3.25E-08 | 1.09E+08 | 9.30% | |
| NTFWDVDGSMVPPEWHR | Q9UI09 | 2.05E-11 | 4.00E+07 | 9.60% | |
| SASDLTWDNLK | ص02787 | 5.29E-11 | 1.92E+09 | 9.80% | |
الجدول 2: القياس الكمي لشدة الكروماتوجرام الأيوني المستخرج (XIC) ل 10 ببتيدات.
الجدول التكميلي 1: مقارنة بين مقايسات BCA اليدوية والآلية. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الجدول التكميلي 2: تم إجراء عملية هضم BSA لمدة شهرين بصرف النظر عن العينات المعالجة في الشكل 4. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
الملف التكميلي 1: نسخة من نصوص بايثون المطورة. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: معلمات الطريقة لبرنامج الكروماتوغرافيا السائلة لتحليل LC-MS/MS. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الملف التكميلي 3: معلمات الطريقة للحصول على بيانات بروتينات البندقية باستخدام مطياف الكتلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول
للحصول على أفضل أداء، يجب استخدام البرامج المخبرية والوحدات والمواد الاستهلاكية المتوافقة مع OT-2 التي تم التحقق منها من Opentrons. يمكن إنشاء برامج مختبرية مخصصة باتباع تعليمات Opentrons في Reference14. تأكد من معايرة سطح OT-2 والماصات وأدوات المختبر عند استخدامها لأول مرة. من الأهمية بمكان أيضا اتباع الإرشادات من الشركة المصنعة لخرز SP3 لإعداد الخرز لتنظيف الببتيد والبروتين. والجدير بالذكر أنه أثناء تفاعل ربط الخرزة والببتيد ، يجب أن يكون حجم الأسيتونيتريل في تفاعل الربط ≥95٪ ، ويجب أن يكون تركيز الخرزة ≥0.1 ميكروغرام / ميكرولتر. مع المعلمات المحسنة في البرنامج النصي لتنظيف الببتيد هنا ، تبلغ نسبة حجم الأسيتونيتريل 95٪ ، وتركيز الخرز 0.37 ميكروغرام / ميكرولتر ، وتركيز الببتيد في حدود 14-37 ميكروغرام / مل. تقدر كتلة الببتيدات ب 40-100 ميكروغرام في 100 ميكرولتر من تفاعل الهضم من تجربتنا. لتنظيف بروتين SP3 ، تم استخدام 5-10 ميكروغرام من الخرز إلى 1 ميكروغرام من البروتين وتأكد من أن الحد الأدنى لتركيز الخرز هو 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر أثناء ربط البروتين. تركيز البروتين الموصى به في حدود 10 ميكروغرام / مل - 5 ملغ / مل. مع المعلمة الافتراضية في النص المقدم ، يتم استخدام 1 ملغ من الخرز لبروتين 100 ميكروغرام ، وتركيز الخرز أثناء الربط هو 3.75 ميكروغرام / ميكرولتر ، في حين أن تركيز البروتين هو 0.35 ملغ / مل.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
يتم تحسين المتغيرات الافتراضية في البرامج النصية Python لمهام سير العمل القياسية في مختبرنا. يحتاج المستخدمون إلى ضبط المتغيرات لجعل البرامج النصية متوافقة مع تطبيقاتهم إذا لزم الأمر. إذا لوحظت كثافة منخفضة من مرض التصلب العصبي المتعدد، فتحقق من فقدان البروتين أو الببتيد بعد كل قسم بروتوكول مهم باستخدام فحص BCA للبروتين ومقايسة الببتيد الكمية. عند استخدام البروتوكول على OT-2 لأول مرة ، راقب تعامل الروبوت مع كل خطوة لضمان قيام الروبوت بتنفيذ الإجراءات كما هو متوقع. في وقت كتابة هذا التقرير ، لم تعد الماصة الإلكترونية P50 متوفرة في متجر Opentrons. تم تعديل البرنامج النصي الحالي للإشارة إلى المكان الذي يمكن فيه استخدام ماصة P20 في مكانها. يمكن للمستخدمين الرجوع إلى واجهة برمجة تطبيقات Opentrons لتعديل البرامج النصية لاستخدام ماصات أخرى ، إذا لزم الأمر.
قيود التقنية
على الرغم من مزايا استخدام نظام آلي لمناولة السوائل ، يجب توخي الحذر عند أداء نقل السوائل بين النسخ المتماثلة التقنية. يوصى بشدة بمراقبة الروبوت أثناء الإعداد الأولي وخطوات التعامل مع السوائل. بعد نقل السائل الروبوتي ، قد تكون هناك حاجة إلى الاسترداد اليدوي للأحجام المتبقية لتجنب فقدان العينة وتقليل التباينات.
الأهمية فيما يتعلق بالأساليب القائمة
يصف هذا البروتوكول طريقة شبه آلية لإعداد العينات القائمة على قياس الطيف الكتلي باستخدام روبوت مناولة السوائل OT-2 منخفض التكلفة ومفتوح المصدر. وفي الآونة الأخيرة، بدأت أعمال أخرى أيضا في استخدام OT-2 نحو تطبيقات البروتينات11. بالمقارنة مع الأساليب الحالية ، تشمل السمات المميزة لهذا البروتوكول استخدام روبوت منخفض التكلفة نسبيا وقابل للبرمجة من بايثون. دمج حبات SP3 شبه الآلية في خطوتين في بروتوكولات إعداد العينات ، وهما خطوة إزالة منظف عينة البروتين وخطوة إزالة الملح / التنظيف بالببتيد ؛ بالإضافة إلى توفر برامج Python النصية مفتوحة المصدر لدعم المزيد من التطوير. تربط الخرز البارامغناطيسي SP3 البروتينات والببتيدات بكفاءة وقد اقترنت بأنظمة مناولة السوائل الآلية نحو التطبيقات في تنظيف البروتين / إزالة المنظفات قبل الهضم الأنزيمي في إعداد عينة MS11,13.
يتم توفير ثلاثة برامج نصية مفتوحة المصدر Python جنبا إلى جنب مع هذا البروتوكول للباحثين. البرامج النصية قابلة للتخصيص للظروف التجريبية الفردية (على سبيل المثال ، رقم العينة ، رقم النسخ المتماثل ، درجة حرارة الحضانة والوقت ، وما إلى ذلك) وتسمح بمزيد من التطوير لسير العمل المعدل. وفرت البروتوكولات سيرة ذاتية تقنية ممتازة بنسبة 3٪ -6٪ في عدد الببتيدات و / أو تحديد البروتين بين عمليات MS في مختبرنا ، مقارنة بالعمل السابق على أنظمة مناولة السوائل الأخرى (<20٪) 9,11.
التطبيقات المستقبلية
يوضح هذا البروتوكول فائدة نظام مناولة السوائل القابل للبرمجة منخفض التكلفة بالاقتران مع حبات SP3 لإعداد عينات البروتيوميات شبه الآلية ، والتي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على مختبرات قياس الطيف الكتلي والمرافق الأساسية لتحسين كفاءة معالجة العينات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ أي تعارضات للإعلان عنها.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال جوائز المعاهد الوطنية للصحة F32-HL149191 إلى YH. R00-HL144829 إلى EL ؛ R21-HL150456، R00-HL127302، R01-HL141278 إلى MPL. يتم إنشاء الشكل 1 ، الشكل 2 ، الشكل 3 بمساعدة أداة توضيح علمية على شبكة الإنترنت ، BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
