Summary
Detaljerade protokoll och tre Python-skript tillhandahålls för att driva ett robotiserat vätskehanteringssystem med öppen källkod för att utföra halvautomatiska proteinprovberedningar för massspektrometriexperiment, som täcker tvättmedelsborttagning, proteinrötning och peptidavsaltning.
Abstract
Masspektrometribaserade hagelgevär proteomik experiment kräver flera prov beredning steg, inklusive enzymatiska protein matsmältning och sanering, som kan ta upp betydande person-timmar av bänk arbete och presentera en källa till batch-till-batch variabilitet. Labbautomation med pipetteringsrobotar kan minska manuellt arbete, maximera genomströmningen och öka forsknings reproducerbarheten. Ändå gör de branta startpriserna för standardautomationsstationer dem oöverkomliga för många akademiska laboratorier. Den här artikeln beskriver ett arbetsflöde för proteomikprovberedning med hjälp av ett prisvärt automatiseringssystem med öppen källkod (The Opentrons OT-2), inklusive instruktioner för att ställa in halvautomatiska proteinreduktions-, alkylations-, matsmältnings- och rengöringssteg. samt medföljande Python-skript med öppen källkod för att programmera OT-2-systemet genom sitt applikationsprogrammeringsgränssnitt.
Introduction
Masspektrometribaserad hagelgevärsproteomik är ett kraftfullt verktyg för att mäta förekomsten av många proteiner i biologiska prover samtidigt. Proteomikexperiment med bioinformatikanalys används rutinmässigt för att identifiera biomarkörer och upptäcka tillhörande biologiska komplex och vägar som ligger till grund för patologiska mekanismer. Med sin höga analyt specificitet och potentiella kvantitativa noggrannhet har hagelgevärsproteomik också utmärkt potential att antas av forskningsanläggningar och diagnostiska laboratorier för klinisk provanalys utan att behöva förlita sig på antikroppar1,2.
För att förbereda proteinprover för analys av hagelgevärsproteomik måste proteiner som extraheras från biologiska prover (t.ex. celler och vävnader) vanligtvis först bearbetas med hjälp av långa protokoll, inklusive mätning av provproteinkoncentrationen, proteinreduktion och alkylation och enzymatisk nedbrytning till peptider. Dessutom kräver proteiner som extraheras i vanliga lysbuffertar som innehåller tvättmedel ofta ytterligare steg för buffertutbyte eller tvättmedelsborttagning före analys eftersom tvätt- och rengöringsmedel kan störa trypsinrötning och avsevärt försämra prestandan hos nedströms flytande kromatografi-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) analys3. Peptider avsaltas, torkas och rekonstitueras vanligtvis i LC-MS/MS-kompatibla lösningsmedel efter enzymatisk nedbrytning. Dessa proteinbiokemiska procedurer kan vara arbetsintensiva och tidskrävande. Således fortsätter de att begränsa genomströmningen av proteomikarbetsflöden och bidrar till variabiliteten för förvärvade data4,5. Mänskliga fel och fördomar har erkänts som avgörande faktorer som påverkar datavarians och reproducerbarhet6,7. För att minimera mänskliga fel i arbetsflöden för beredning av massspektrometriprover har automatiserade robotsystem för pipettering använts för att förbättra genomströmningen och reproducerbarheten av proteinidentifiering och kvantifiering från hagelgevärsproteomik och riktad analys av masspektrometri, där sådana framsteg har hyllats som avgörande för att fortsätta arbetet med att allmänt anta proteomikteknik i kritisk forskning och kliniska miljöer8. 9,10,11,12,13. De flesta befintliga protokoll använder dock robotiska vätskehanteringsplattformar som kräver betydande investeringar och utbildning, vilket begränsar deras användbarhet i många laboratorier i den akademiska miljön eller på annat sätt med en begränsad budget.
Den här artikeln beskriver ett protokoll som använder ett billigt, öppen källkodsrobotiskt vätskehanteringssystem, OT-2, för att halvautomatisera ett typiskt arbetsflöde för förberedelse av hagelgevär proteomik. OT-2 har en lägre kostnad än många andra robotiska vätskehanteringssystem, och kostar i skrivande stund cirka $ 5,000 US-dollar. När man räknar in priserna på olika moduler och labware är den totala kostnaden för att ställa in experiment i detta protokoll i skrivande stund cirka $ 10,000, vilket gör det mer överkomligt för en betydligt bredare uppsättning laboratorier över dyrare alternativ. OT-2 är kompatibel med programmering med öppen källkod via Python-skript och erbjuder stor flexibilitet i användardefinierad DIY-protokolldesign. Med hjälp av tre egenutvecklade manus täcker protokollen nedan ett typiskt arbetsflöde för beredning av hagelgevärsproteomikprov på OT-2-stationen med en arketypisk proteinstandard (bovint serumalbumin; BSA) och ett komplext proteinprov av en normal human hjärtlystna (figur 1). Förfarandena för bearbetning (1) ett BSA-prov och 2) ett komplext hjärtlystnaprov beskrivs i protokollavsnitten 1, 2, 5, 6 respektive 3, 4, 5, 6. Sera-Mag karboxoxylatmodifierade magnetiska pärlor används i en kruka solid fas-förbättrad provberedning (SP3) för att ta bort tvättmedel och salter i protein- och peptidproverna. Tryptiska sammandrag från bovin serum albumin och humana hjärtproteiner rengörs ytterligare av SP3 pärlor och skickas in för LC-MS /MS analys. Masspektra analyseras sedan med hjälp av MaxQuant-programvaran för peptid- och proteinidentifiering. Representativa resultat som utförs av oss visar att protokollet uppnår utmärkta tekniska variationskoefficienter (CV) samtidigt som bänktid sparas och är inte sämre än handsammanfattning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De utvecklade Python-skripten har deponerats på GitHub på: https://github.com/MaggieLam-Lab/StandardDigestion-Opentrons. En kopia av skripten ges i kompletterande fil 1. Se GitHub-lagringsplatsen för de senaste versionerna.
1. Experimentella preparat
- Kontrollera den maskinvara som krävs innan protokollet startas.
OBS: Följande hårdvarukomponenter krävs: OT-2 pipetter, pipettspetsar, 4-i-1 rörrackset, aluminiumblockuppsättning, magnetisk modul, temperaturmodul, 96-brunn 2 mL djupa brunnsplattor (se Materialtabell).
2. Provberedning av masspektrometri (MS) med ett enda protein bovin serumalbumin (BSA)
- Öppna NoSP3_digestion.py-skriptet i en textredigerare och ange de experimentspecifika variablerna efter behov i avsnittet ANPASSA ENDAST HÄR.
De experimentspecifika variablerna inkluderar antalet exempel och replikerar. Provkoncentrationen. volymen av reagenser dithiothreitol - DTT, joacetamid - IAA och trypsin; DTT- och IAA-inkubationstiden samt startspetsen för pipetten P20/P50 och P300).- Öppna Opentrons-appen och ladda upp skriptet till fliken PROTOCOL i Opentrons-appen.
Opentrons-appen kan laddas ner från Reference14 till en lokal dator. I skrivande stund är Opentrons P50 elektroniska pipett inte tillgänglig för köp i Opentrons-butiken. Den har ersatts med den elektroniska pipetten P20 med en kanal som är kompatibel med de volymer som anges i protokollet. Anteckningar och instruktioner har gjorts i skriptet för att ersätta P50-pipetten med P20-pipetten. Användare kan behöva testa och verifiera den aktuella pipettens kompatibilitet med det här protokollet enligt Opentrons API-instruktion.
- Öppna Opentrons-appen och ladda upp skriptet till fliken PROTOCOL i Opentrons-appen.
- Öppna fliken ROBOT och utför robotdäckskalibrering kalibrera däck på fliken ROBOT enligt steg-för-steg-instruktionerna på skärmen i Opentrons-appen.
OBS: Det här steget krävs endast om det inte har implementerats tidigare eller om roboten nyligen har flyttats. - Klicka på knappen MANAGE PIPETTES för att utföra kalibrering av spetslängd, följt av pipettförskjutningskalibrering för att kalibrera standardläget för topp- och pipettkombinationen.
OBS: Detta steg krävs om en pipett används för första gången. - Placera nödvändiga labware och pipetter på motsvarande plats i OT-2-däcket som anges i Python-skriptet (bild 2).
OBS: Se till att temperaturmodulen är ansluten och påslagen och att aluminiumblocket placeras ovanpå temperaturmodulen. - Öppna fliken KALIBRERA och utför kalibrering för kombinationen av labware och pipetter som krävs i det här python-skriptet.
OBS: Opentrons-appen registrerar kalibreringsparametrarna, vilket inte är nödvändigt för framtida applikationer med samma labware och pipetter. - Förbered 5 ml 100 mM ammoniumbikarbonat (ABC) (pH ~8,0) lösning genom att lösa upp 39,53 mg ABC i massspektrometrikvalitet vatten till en total volym av 5 ml i ett 15 ml koniskt rör. Placera ammoniumbikarbonatbufferten i A1-brunnen på 4-i-1-rörstället med 15 ml + 50 ml rörhållare.
- Förbered 1 ml BSA-protein (bovin serumalbumin) i ett 2,0 ml lågbindningsrör med protein (se Tabell över material). Placera provet i A1-brunnen i 4-i-1-rörstället med 2 ml rörhållare.
- Placera manuellt 2,0 ml protein lågbindningsrör i brunnarna i A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, etc. i aluminiumblocket ovanpå temperaturmodulen.
OBS: Robotpipetten delar ut prover i vertikal ordning från A1 (första provet) till det sista provet som standard. Horisontell dispensering kan specificeras. Se15 för mer information. Det totala antalet rör som behöver beredas bör motsvara det totala antalet prover (dvs. antalet biologiska prover multiplicerat med antalet tekniska replikat per prov). - Förbered 1 ml 60 mM DTT genom att lösa upp 9,26 mg DTT-fasta ämnen i massspektrometrikvalitetsvatten till en total volym av 1 ml. Placera DTT i A6-brunnen i 4-i-1-rörhållaren med 2 ml rörhållare.
VARNING: DTT är skadligt för mänskliga ögon, hud och andningsorganen. Använd personlig skyddsutrustning och hantera den under en kemisk huva. Se tillverkarens säkerhetsdatablad för korrekta procedurer. - Observera medan roboten överför en lämplig volym ABC-buffert till provrören i aluminiumblocket.
OBS: Den totala volymen abc och proteinblandning i varje rör är 100 μL, och volymen av ABC-bufferten beräknas i skriptet (V = 100 μL minus volymen på 100 μg proteinprov). - Se till att roboten överför 100 μg BSA-protein till varje rör med ABC-buffert.
OBS: Ett typiskt experiment kan använda upp till 100 μg proteiner för proteinrötning, dvs. - Kontrollera manuellt att robotprogrammet är pausat och visar meddelandet: Se till att DTT har laddats i A6 på 2 ml-rörracket i spår 4 innan protokollet återupptas. Se till att ett DTT-rör placeras i A6-brunnen och öppna locket. Klicka på knappen Återuppta i Opentrons-appen för att fortsätta. Se till att roboten överför 10 μL DTT-lösning till varje provbrunn, följt av fem blandningsrundor.
- Kontrollera att robotprogrammet är pausat och visar meddelandet: Se till att stänga versaler på provrör. Stäng rörens lock manuellt och klicka på Fortsätt för att fortsätta. Vänta tills robotens temperaturmodul börjar värma aluminiumblocket tills temperaturen når 55 °C, följt av en inkubation på 5 minuter för att låta proverna komma till 55 °C.
OBS: Roboten håller temperaturen vid 55 °C i 30 minuter för att möjliggöra proteinreduktion med DTT under inkubation. - Under 30 min av DTT inkubation, förbereda 1 ml 187,5 mM Iodoacetamid (IAA) genom att lösa upp 34,68 mg IAA i ABC-bufferten till en total volym av 1 ml. Slå in IAA-lösningen manuellt med aluminiumfolie för att undvika exponering för ljus.
VARNING: IAA kan orsaka allvarlig ögon- och andningsirritation. Hantera den under en kemisk huva med rätt personlig skyddsutrustning. - Se till att robotens temperaturmodul svalnar när du har slutfört inkubationssteget på 30 minuter DTT.
OBS: När modulens temperatur når 22 °C bibehåller modulen temperaturen i 5 minuter så att proverna kan svalna helt. - Ta bort provrören när robotens program är pausat och visa varningsmeddelandet: Se till att öppna locket på provrören. Klicka på Fortsätt för att fortsätta.
- Kontrollera manuellt att robotens program är pausat med ett varningsmeddelande: Se till att IAA har laddats in i B6 på 2 ml-rörracket i spår 4 innan protokollet återupptas. Bekräfta IAA-rörets rackplats och öppna rörlocket. Klicka på Fortsätt för att fortsätta. Se till att roboten överför 10 μL IAA till varje provrör följt av fem blandningsrundor.
- Kapa provrören när robotens program pausas och visa meddelandet: Stäng locket på provrör och täck provrör med folie. Täck hela aluminiumblocket med en ren bit folie. Klicka på Fortsätt för att fortsätta. Vänta tills proverna inkuberas vid 22 °C i 30 minuter. Se till att robotens temperaturmodul avaktiveras när IAA-inkubationen är avslutad.
- Förbered en blandning av trypsinlösning under IAA-inkubation (steg 2.19) vid den slutliga koncentrationen av 0,2 μg/μL: lös upp 20 μg masspektrometri/sekvenseringsklass trypsin i 100 μL MS-klassat vatten.
- Placera trypsinlösningen i C6-brunnen på 2 ml-rörstället med rörlocket öppet när robotens program är pausat och visar varningsmeddelandet: Se till att trypsin har laddats i C6 på 2 ml-rörstället som ligger i spår 4 före återupptagandeprotokollet. Klicka på Fortsätt för att fortsätta.
- Kontrollera att robotens program är pausat och visar varningsmeddelandet: Öppna lock på provrör på temperaturmodulen. Lossa provrören och klicka på Fortsätt för att fortsätta. Var och se på medan roboten överför 10 μL trypsin till varje provrör följt av fem blandningsrundor.
- Slå in provrörslocken med paraffinfilm, överför alla prover till en temperaturkontrollerad mixer och inkubera vid 37 °C i 16-20 timmar med 600 varv/min skakning.
OBS: Trypsinrötning kan också utföras direkt på temperaturmodulen vid 37 °C.
3. Peptidrensning med SP3 paramagnetiska pärlor
- Nästa dag efter nattens trypsinrötning, snurra kort proverna med hjälp av en bänkskiva mikrocentrifuge (≤ 2 000 x g) (se Tabell över material) och placera proverna på ett magnetiskt rörställ. Låt proverna stå i 2 min.
- Överför supernatanten försiktigt med en pipett till en ny uppsättning protein lågbindningsmikrocentrifugerör. Förvara proverna i kylskåp och fortsätt till steg 3.2-3.9.
OBS: För långtidsförvaring, förvara proverna vid -80 °C.
- Överför supernatanten försiktigt med en pipett till en ny uppsättning protein lågbindningsmikrocentrifugerör. Förvara proverna i kylskåp och fortsätt till steg 3.2-3.9.
- Öppna SP3_peptide_cleanup.py Python-skriptet i en textredigerare och ange vid behov i avsnittet ANPASSA ENDAST HÄR.
OBS: De experimentspecifika variablerna inkluderar antalet prover och replikat, volymen peptider som ska överföras, mängden reagenser (pärlor, acetonitril, DMSO), startspetsen för P20/P50- och P300-pipetter och börjar bra i djupbrunnplattan på magnetmodulen. Varje BSA-rötprov innehåller cirka 120 μL rötningsvolym, som kommer att alikvoteras i två tekniska replikat med 55 μL i varje replikat. Om du bara vill rensa hälften av sammandragningen ändrar du variabeln replikerat tal till 1. - Ladda upp skriptet till fliken PROTOCOL i Opentrons-appen .
- Placera nödvändiga labware och pipetter på motsvarande plats i OT-2-däcket som anges i Python-skriptet (bild 3). Se till att magnetmodulen är påslagen och ansluten till roboten. Placera en ny 2 mL 96-brunns djup brunnsplatta (se Materialtabell) ovanpå magnetmodulen.
- Öppna fliken KALIBRERA och utför kalibrering för kombinationen av labware och pipetter som krävs i det här Python-skriptet.
OBS: Kalibrering för samma labware- och pipetterkombinationer behöver bara utföras en gång, och Opentrons-appen registrerar kalibreringsparametrarna. - Placera de smälta proverna (supernatant som samlats in i steg 3.1) till 2,0 ml rörställ i vertikal ordning i brunnarna A1, B1....
- Förbered 15 ml LC-MS/MS-kompatibel acetonitril i ett koniskt rör på 50 mL och placera röret i brunnen A3 i 4-i-1-rörstället med 15 ml + 50 ml rörhållare.
- Förbered 5 ml 2% DMSO genom att tillsätta 100 μL DMSO med 4,9 ml masspektrometrikvalitetsvatten i ett koniskt rör på 15 ml. Placera röret i brunnen A1 i 15mL + 50mL rörställ.
- Märk ett tomt koniskt rör på 50 ml som Avfall och placera det i brunnen B3 i 15mL + 50mL rörställ.
- Förbered SP3-pärlorna enligt Reference16.
- Förbered en lämplig mängd blandade pärlor i ett 2,0 mL microcentrifuge-rör.
OBS: Varje peptidsreningsreaktion kräver 10 μL blandade pärlor. Förbered till exempel minst 40 μL blandade pärlor för fyra saneringsreaktioner. - Låt pärlblandningen sitta på magnetstativet i 2 min. Ta försiktigt bort supernatanten med en pipett och mät supernatantens volym med en pipett.
- Beräkna den återstående volymen pärlor och tillsätt 5-10 gånger massspektrometrikvalitetsvattnet (t.ex. 100-200 μL vatten för 20 μL pärlor) och virvel (hastighet 10) i 10 s. Sätt pärlorna på magnetstativet i 2 min.
- Upprepa vattentvättsteg för totalt tre tvättar.
- Återanvänd de slutliga pärlorna i MS-klassat vatten till en slutlig koncentration av 50 μg/μL. Placera de tvättade magnetiska pärlorna i brunnen A6 i 2,0 ml rörställ.
OBS: Pärlorna rekommenderas att återanvändas vid en koncentration av 10 μg/μL16. I den nuvarande optimeringsinsatsen ändrades den slutliga koncentrationen till 50 μg/μL för att minimera den totala volymen av blandningen av pärla-peptid-acetonitril.
- Förbered en lämplig mängd blandade pärlor i ett 2,0 mL microcentrifuge-rör.
- Se till att roboten överför 55 μL av de smälta proverna till brunnarna i djupbrunnplattorna på magnetmodulen.
- Kontrollera att robotprotokollet är pausat och visar meddelandet: Se till att förberedda pärlor har laddats i A6 på 2 ml-rörstället i spår 4 innan protokollet återupptas. Virvel pärlor, och sedan kort snurra ner för 5 s på en mini bänktop centrifug och placera pärlorna i A6 brunnen i 2 mL rörställ med locket öppet. Var bredvid medan roboten blandar pärlorna 10 gånger i fem rundor genom att pipettera upp och ner.
OBS: Roboten överför 10 μL pärlor till varje smält prov i djupbrunnplattorna följt av fem gånger blandning. - Se till att roboten överför 1 292 μL acetonitril till varje brunn och omedelbart blandas 10 gånger genom pipettering upp och ner för att underlätta peptider och pärlor som binder.
OBS: Varje överföring slutförs under flera rundor eftersom P300-pipetten endast kan överföra upp till 300 μL åt gången. - Se till att roboten blandar alla prover fem gånger genom att pipettera upp och ner i djupbrunnplattan.
- Vänta tills magnetmodulen är inkopplad och proverna inkuberas på modulen i 2 minuter.
- Var redo medan pipetteringsambitionen och dispenshastigheterna är inställda på att sakta ner till 25 μL/s från standardvärdet 150 μL/s.
OBS: Roboten tar långsamt bort supernatanten från varje brunn och kasserar den i avfallsröret medan magnetmodulen är inkopplad. - Vänta tills pipetteringsambitionen och dispenshastigheterna återgår till standardinställningen. Observera att magnetmodulen kopplas ur.
- Kontrollera att robotens program är pausat och visar meddelandet: Se till att ACN-rörlocket är av. Ta manuellt loss acetonitrilröret och placera tillbaka det till rörstället. Klicka på Fortsätt för att fortsätta. Se till att roboten överför 1 ml acetonitril för att tvätta varje prov och blandas omedelbart 10 gånger.
- Se till att roboten blandar alla prover 10 gånger för att tvätta proverna.
- Var redo medan magnetmodulen är inkopplad och inkuberar proverna i 2 minuter.
- Vänta tills roboten ändrar pipetteringsambitionshastigheten för att sakta ner och tar långsamt bort supernatanten och doserar den i avfallsröret.
- Observera medan roboten inkuberar proverna på magnetmodulen i 60 s för att låta kvarvarande acetonitril avdunsta, och ändra sedan pipetteringsambitionshastigheterna tillbaka till standard. Observera att magnetmodulen blir urkopplad.
- Kontrollera att robotens program är pausat och visar meddelandet: Vortex DMSO igen och öppna versaler. Virvla manuellt 2% DMSO i 10 s och placera den tillbaka i A1-brunnen i 15 mL-50 ml rörställ. Klicka på Fortsätt för att fortsätta.
- Se till att roboten överför 80 μL 2% DMSO till varje brunn och blandas omedelbart 10 gånger.
- Se till att roboten blandar alla prover 10 gånger i ytterligare fem rundor.
- Var redo medan magnetmodulen är inkopplad och inkuberar proverna i 2 minuter.
- Observera medan roboten ändrar pipettaspirationshastigheten till långsam (25 μL/s) och överför långsamt supernatanten till tomma brunnar i djupbrunnplattan.
- Vänta tills roboten inkuberar prover på magnetmodulen i 2 minuter för att ta bort restpärlor i proverna.
- Kontrollera att robotens program är pausat och visar meddelandet: Placera nya 2 ml-rör i 2 ml-rörstället och se till att antalet rör matchar det totala antalet prover.
- Placera det första 2 ml mikrocentrifugeröret i brunnen direkt efter det slutliga BSA-smältprovet. Klicka på Fortsätt för att fortsätta.
OBS: De sex BSA-smältproverna som testas i det här protokollet finns till exempel i brunnarna A1, B1, C1, D1, A2 och B2. Därför placeras den nya uppsättningen 2,0 ml rör i brunnarna B3, C3, D3, ... och så vidare. - Observera medan roboten överför 88 μL prover från brunnarna i djupbrunnplattan till den nya uppsättningen 2,0 ml rör.
OBS: Den överförda volymen (1,1 x 80 μL) i protokollet är optimerad för att säkerställa att hela provets volym aspireras in i pipettspetsar. - Var redo medan roboten ändrar pipettaspirationshastigheten till standard och kopplar ur magnetmodulen.
- Torka de rengjorda peptiderna manuellt i en vakuumförångare (se Materialtabell) och fortsätt till avsnitt 5 eller förvara torkade prover vid -20 °C.
4. MS-provberedning med protein lysate i det mänskliga hjärtat (5 mg/ml) med SP3 paramagnetiska pärlor
- Öppna skriptet SP3_digestion.py Python och ange värden för variabler i avsnittet ANPASSA ENDAST HÄR.
OBS: Variablerna inkluderar antalet prover och replikat, provkoncentrationen, volymen reagenser (DTT, IAA, trypsin, pärlor, 100% och 80% etanol), DTT och IAA inkubationstid, startspets för pipetter P20/P50 och P300, och börjar bra i djupbrunnstallen på magnetmodulen. - Följ steg 2.2-2.23 i avsnitt 2 för MS-provberedning med ett enda protein bovint serumalbumin för DTT- och IAA-inkubation. Se figur 1 för robotdäcksinställningen i dessa steg.
- Förbered en färsk SP3-pärlblandning (20 μL pärlor per rengöringsreaktion) för proteinrening (enligt punkt 3.10) under DTT- och IAA-inkubationsstegen (steg 2.15 och 2.19). Placera pärlorna i D6-brunnen på 2 ml-rörstället.
- Kontrollera att robotens program är pausat med meddelandet: Öppna rörlock. Kapsla manuellt provrören i aluminiumblocket ovanpå temperaturmodulen och klicka på Fortsätt för att fortsätta.
- Se till att roboten överför alla prover från 2,0 ml-rör till en ny djupbrunnplatta ovanpå magnetmodulen.
- Kontrollera att robotens program är pausat och visar meddelandet: Se till att förberedda pärlor har laddats i D6 på 2 mL-rörstället som finns i spår 4 innan protokollet återupptas. Öppna pärlor rörlocket och klicka på Fortsätt för att fortsätta.
- Observera medan roboten överför 20 μL pärlor till varje brunn i djupbrunnplattan med fem omgångar blandning av pärlor och fem omgångar av blandning av provpärlorblandningen.
- Kontrollera att robotens program är pausat och visar meddelandet: Se till att 100 procent etanol har laddats i A3 av 15 mL-50 ml rörracket som ligger i spår 5 innan protokollet återupptas. Förbered 10-20 ml 100% etanol (dvs. 200 bevis etanol, se Tabell över material) i ett 50 ml koniskt rör och placera det i A3-brunnen i racket. Klicka på Fortsätt för att fortsätta.
- Var och se på medan roboten överför 140 μL 100% etanol till varje brunn i plattan omedelbart följt av 10 blandningsrundor för att underlätta peptidernas bindning till pärlorna.
- Se till att roboten blandar varje prov genom att pipettera upp och ner 10 gånger varje runda under totalt fem blandningsomgångar.
- Var redo medan magnetmodulen är inkopplad och inkuberar proverna på modulen i 2 min.
- Observera medan roboten ändrar pipetterhastigheten till långsam (25 μL/s) och aspirerar supernatanten från varje brunn och delar ut den i avfallsröret.
- Vänta tills roboten ändrar pipetterhastigheten tillbaka till standard och kopplar ur magnetmodulen.
- Kontrollera att robotens program är pausat och visar meddelandet: Se till att 80 procent etanol har laddats i A4 på 15 mL-50 ml rörracket som ligger i spår 5 innan protokollet återupptas. Förbered manuellt 20 ml 80 % etanol genom att blanda 4 ml MS-vatten med 16 ml 100 % etanol (dvs. 200 bevis). Placera 80% etanol i A4-brunnen i rörstället. Klicka på Fortsätt för att fortsätta. Se till att roboten överför 1 ml 80% etanol till varje brunn och blandas omedelbart 10 gånger.
- Observera medan roboten ändrar pipetterhastigheten till långsam (25 μL/s), aspirerar supernatanten från varje brunn och dispenserar in i avfallsröret. Vänta tills roboten ändrar pipetterhastigheten tillbaka till standard och kopplar ur magnetmodulen.
- Öppna taket på ABC-lösningen när robotens program pausas och visar meddelandet: Open cap på ABC-röret. Klicka på Fortsätt för att fortsätta. Var redo medan roboten kopplar ur magnetmodulen, överför 250 μL ABC till varje brunn och blandas omedelbart i 10 gånger.
OBS: Detta steg är att tvätta proverna med ABC. - Se till att roboten kopplar in magnetmodulen och inkuberar prover på modulen i 2 minuter.
- Observera medan roboten ändrar pipetterhastigheten till långsam (25 μL/s) och överför supernatanten från varje brunn till avfallsröret. Vänta tills roboten överför 100 μL ABC-buffert till varje brunn och blandas omedelbart i 10 gånger.
- Kontrollera att robotens program är pausat och visar meddelandet: Se till att nya uppsamlingsrör har placerats i 2,0 ml aluminiumblock innan protokollet återupptas. Placera en ny uppsättning mikrocentrifugerör med låg proteinretention i aluminiumblocket omedelbart efter det sista provröret inledningsvis i blocket. Klicka på Fortsätt för att fortsätta. Var av medan roboten överför varje prov i ABC-buffert till de nya 2,0 ml-rören.
OBS: Undersök brunnarna och överför eventuellt restprov manuellt till rören om det behövs. - Förbered en lämplig mängd trypsin av MS-klass (10 μL per prov) genom att lösa upp 20 μg trypsin av MS-klass i MS-klass till en slutlig koncentration på 0,2 μg/μL när robotens program pausas och visar meddelandet: Se till att trypsin (0,2 μg/μL) har laddats i C6 i 2 ml-rörstället i spår 4 före återtagandet. Se till att roboten överför 10 μL trypsin till varje provrör, följt av fem blandningsrundor.
- Slå in provrörslocken med paraffinfilm, överför alla prover till en temperaturkontrollerad mixer och inkubera vid 37 °C i 16-20 timmar med 1 000 varv/min skakningar.
OBS: Att utföra matsmältningen med 1 000 varv/min skakningar rekommenderas för att minimera pärlornas nederbörd under inkubationen över natten.
5. Peptidrensning med SP3 paramagnetiska pärlor
- Följ stegvisa instruktioner i steg 2, Peptidsrening med SP3 paramagnetiska pärlor.
6. Vätskekromatografi och masspektrometri
- Resuspend BSA (steg 2-3) och hjärtat lysate (steg 4) peptider i 0,1% myrsyra genom att tillsätta 1 ml LC-MS grad 99% myrsyra i MS vatten till en total volym av 1 L.
VARNING: Myrsyra är en stark syra. Det är mycket frätande för ögon, hud och andningsorgan. Hantera försiktigt under en kemisk huva som bär PERSONLIG skyddsutrustning. - Kvantifiera peptidekoncentrationen efter sammandrag med hjälp av ett kvantitativt peptidanalyskit17 och injicera 0,5 μg BSA-sammandrag och 1,5 μg hjärtsammandrag för LC-MS/MS-analys.
- Ställ in vätskekromatografiprogrammet för LC-MS/MS-analys.
OBS: I en typisk inställning kan peptidsammandrag laddas på en omvänd fas C18-kolonn (3 μm partikel; 100 Å por; 75 μm x 150 mm; se tabell över material) med hjälp av parametrarna i kompletterande fil 2. - Skaffa hagelgevärsproteomikdata med hjälp av en masspektrometer (se materialförteckning) med hjälp av parametrarna i kompletterande fil 3.
- Sök i proteindatabasen efter proteinidentifiering.
- Ladda ner och installera den programvara som krävs, MaxQuant.
OBS: MaxQuant-programvaran (v.1.6.10.43) användes här för följande steg (se Tabell över material). - Ladda ned den utvalda humana proteomdatabasen från en högkvalitativ proteinsekvensdatabas (UniProt/SwissProt) (se Tabell över material). Klicka på knappen Ladda ner och välj FASTA (kanonisk).
OBS: Ladda eventuellt ner FASTA (icke-kanoniska) för att inkludera proteinisoformer av varje gen i databasen, om så önskas. - I maxquant-programvarugränssnittet anger du fasta-filen som ska användas som proteindatabas genom att navigera till panelen Globala parametrar och klicka på fliken Sekvenser . Klicka sedan på knappen Lägg till för att ange filsökvägen till FASTA-filen.
- I MaxQuant-programvarugränssnittet anger du de förvärvade råa massspektrumfilerna som ska analyseras genom att gå till panelen Rådata och klicka på knappen Ladda och välja de råa filerna.
- Ställ in sökparametrar enligt tabell 1. Aktivera etikettfri kvantifiering (LFQ) om det behövs.
- Vänta tills sökningen har slutförts och leta reda på antalet ppeptidspektrummatchningar (PSMs) som klarar tröskelvärdena FDR 1% i filen msms.txt i mappen /combined/txt.
OBS: I de jämförelser som utfördes här för avsnittet representativa resultat filtrerades PSMs mappade till flera proteiner ut, och PSMs mappade till ett unikt protein behölls för att räkna antalet PSMs, peptider och proteiner (figur 4 och figur 5).
- Ladda ner och installera den programvara som krävs, MaxQuant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tre Python-skript tillhandahålls här som är kompatibla med OT-2-roboten, och som utför provberedning för masspektrometriproteomik med ett enda proteinstandard bovin serumalbumin (tekniska replikerar n = 5 matsmältningar) och ett tvättmedelsinnehållande humant hjärta lysateprov (n = 5 matsmältningar). Varje smältprodukt är uppdelad i två peptidrensningsreaktioner. Antalet identifierade peptidspektrummatchningar (PSMs), peptider och proteiner i varje omgång av BSA och hjärtprover visas i figur 4 och figur 5. En median på 728 PSMs och 65 peptider identifierades med BSA-provet, med 5, 2% respektive 3, 2% variationskoefficienter (CV). Med det komplexa hjärtprovet identifierades en median på 9 526 PSMs, 7 558 peptider och 1 336 proteiner i 10 körningar med 7,6%, 5,9% och 3,6% variationskoefficient. Totalt identifierades 1 935 proteiner från 10 körningar av hjärtprovet, och bland dessa identifierades 1 677 proteiner i två eller flera körningar. För att bestämma variabiliteten i peptidkvantifiering beräknades CV för de extraherade jonkromatogram (XIC) intensiteterna för 10 peptider som mappades till ett unikt protein (tabell 2). Variabiliteterna hos humana (handpietted) kontra robot experimentella resultat på mätning av proteinkoncentration jämfördes ytterligare med hjälp av tre protein standard prover med BCA analys. Det genomsnittliga CV:t (7,57%) av robot BCA-analysen visade sig vara lägre än den mänskliga manuella BCA-analysen (9, 22%) (tilläggstabell 1).
Det beskrivna protokollet visade konsekvent prestanda över tiden när BSA rötning protokollet utfördes 2 månader ifrån varandra och producerade jämförbara resultat. Medianantalet unika PSMs och peptider i figur 2 är 728 respektive 65. Samma experiment som utfördes på OT-2-systemet 2 månader innan genererade i genomsnitt 647 PSMs och 54 peptider (n = 2) (tilläggstabell 2). Långsiktig stabilitet kan uppskattas på samma sätt.
Den manuella bänkbearbetningstiden (inkubationstid ingår ej) beräknas mellan robotprotokollet och mänsklig bearbetning18 per provberedning. Med digestionsprotokollet utan tvättmedelsborttagning följt av peptidavsaltning är den manuella bearbetningstiden 41 min med robotsystemet jämfört med 61 min för hand. Med tvättmedelsborttagning, matsmältning och peptidavsaltning är den manuella bearbetningstiden 54 min med robotsystemet jämfört med 79 min för hand. Därför minskar det halvautomatiska protokollet cirka 20-25 min praktisk bänkbehandlingstid per prov. Denna tidsminskning blir betydande när många prover bearbetas och kan förbättras ytterligare när flera OT-2-robotar används parallellt.
Bild 1: Schematiskt arbetsflöde. Proteiner som extraheras med tvättmedelshjälpmedel kommer att kräva bearbetning med ett extra steg av tvättmedelsborttagning före matsmältningen. Proteinprover smälts och peptider avsaltas på robotsystemet OT-2. Peptidröten injiceras i en Q-Exactive HF masspektrometer i kombination med en nano-LC. MS-spektra söks mot en proteindatabas för proteinidentifiering. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Robotdäck uppsatt för proteinrötning. De angivna positionerna för spetsställ, prover, skräp, temperaturmodul och magnetisk modul visas. Asterisker betecknar labware och reagenser som endast krävs för matsmältningsprotokollet med tvättmedelsborttagningssteg. Lådor med siffror anger obemannade däckspositioner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Robotdäck uppsatt för peptidrensningsskriptet. De angivna positionerna för spetsställ, prover, skräp och magnetisk modul visas. Lådor med siffror anger obemannade däckspositioner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 4: Antal peptidspektrummatchningar (PSMs) och peptider som detekteras i matsmältningen av BSA-protein (n = 5). Varje sammandrag delades upp i två för tekniska replikera peptid saneringar (R1 och R2). Variationskoefficient: 5,2 % för psms; 3,2% för peptider. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 5: Antal PSMs, peptider och proteiner som identifierats från en mänsklig hjärtlystna. Fem matsmältningar utfördes med SP3 tvättmedel borttagning. Varje sammandrag delades upp i två för peptidrensning (R1 och R2). Variationskoefficienter: 7,6 % för privata säkerhetsföretag; 5,9% för peptider; 3,6% för proteiner. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Matsmältningsenzym | Trypsin/P |
| Maximal missad klyvning | 2 |
| Fast ändring | Karbamidometylation av cystein |
| Variabel ändring | N-terminal proteinacetylering; oxidation av metionin |
| Peptid längd intervall | 7 – 25 aa |
| Masstolerans mot prekursorer | ± 4,5 ppm |
| MS/MS joner masstolerans | ± 20 ppm |
| Etikettfri kvantifiering | LFQ |
| Falsk upptäcktsfrekvens (FDR) för peptidspektrummatchning (PSM) | 0.01 |
Tabell 1: Sökparametrarna för peptiddatabasen (MaxQuant).
| Peptid | Protein-ID | PEPPA | Median XIC-intensitet | CV | |
| LSTSQIPQSQIR | Q92523 | 7.72E-08 | 1.96E+07 | 6.70% | |
| SEDFSLPAYMDR | P13073 | 9.64E-17 | 8.05E+08 | 7.30% | |
| YLQEIYNSNNQK | P02679 | 2.76E-23 | 9.69E+08 | 7.60% | |
| TDDCHPWVLPVVK | P17174 | 4.51E-14 | 4.60E+08 | 8.60% | |
| VIVVGNPANTNCLTASK | P40925 | 7.90E-29 | 1.17E+09 | 8.70% | |
| DYIWNTLNSGR | O75390 | 1.63E-15 | 1.38E+08 | 8.80% | |
| VSVPTHPEAVGDASLTVVK | P13611 | 1.86E-09 | 6.77E+07 | 9.10% | |
| QVAEQFLNMR | P22695 | 3.25E-08 | 1.09E+08 | 9.30% | |
| NTFWDVDGSMVPPEWHR | Q9UI09 | 2.05E-11 | 4.00E+07 | 9.60% | |
| SASDLTWDNLK | P02787 | 5.29E-11 | 1.92E+09 | 9.80% | |
Tabell 2: Extraherad jonkromatogram (XIC) intensitet kvantifiering av 10 peptider.
Kompletterande tabell 1: Jämförelse av manuella och automatiserade BCA-analyser. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Tilläggstabell 2: BSA-matsmältningen utfördes 2 månader från de prover som bearbetas i figur 4. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Kompletterande fil 1: En kopia av de utvecklade Python-skripten. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Metodparametrar för vätskekromatografiprogrammet för LC-MS/MS-analys. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: Metodparametrar för acquiring hagelgevär proteomik data med hjälp av en masspektrometer. Klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
För bästa prestanda bör Opentrons-verifierade labware, moduler och förbrukningsartiklar kompatibla med OT-2 användas. Anpassade labware kan skapas enligt Opentrons instruktion på Reference14. Se till att kalibrera OT-2-däcket, pipetter och labbprogram när de används för första gången. Det är också viktigt att följa riktlinjer från SP3 pärlor tillverkare för att förbereda pärlor för peptid och protein sanering. Under bead- och peptidbindningsreaktionen måste volymen av acetonitril i biverkningen vara ≥95%, och pärlkoncentrationen måste vara ≥0,1 μg/μL. Håll peptidkoncentrationen i intervallet 10 μg/mL-5 mg/mL. Med de optimerade parametrarna i peptidrensningsskriptet här är acetonitrilvolymförhållandet 95%, pärlkoncentrationen är 0,37 μg/μL och peptidkoncentrationen ligger i intervallet 14-37 μg/mL. Peptidemassan uppskattas till 40-100 μg i 100 μL av matsmältningsreaktionen från vår erfarenhet. För SP3-proteinrening användes 5-10 μg pärlor till 1 μg protein och säkerställde att den minimala pärlkoncentrationen är 0,5 μg/μL under proteinbindningen. Den rekommenderade proteinkoncentrationen ligger i intervallet 10 μg/mL-5 mg/ml. Med standardparametern i det medföljande skriptet används 1 mg pärlor för 100 μg protein och pärlkoncentrationen under bindningen är 3,75 μg/μL, medan proteinkoncentrationen är 0,35 mg/ml.
Ändringar och felsökning
Standardvariablerna i Python-skripten är optimerade för standardarbetsflöden i vårt laboratorium. Användare måste justera variablerna för att göra skripten kompatibla med sina program om det behövs. Om låg MS-intensitet observeras, kontrollera om det finns protein- eller peptidförlust efter varje betydande protokollavsnitt med proteinet BCA-analys och kvantitativ peptidanalys. När du använder protokollet på OT-2 för första gången, observera robothantering för varje steg för att säkerställa att roboten utför procedurer som förväntat. I skrivande stund är den elektroniska pipetten P50 inte längre tillgänglig i Opentrons-butiken. Det aktuella skriptet har ändrats för att ange var P20-pipetten får användas på plats. Användare kan referera till Opentrons API för att ändra skripten för att använda andra pipetter, om det behövs.
Teknikens begränsningar
Trots fördelarna med att använda ett robotiserat vätskehanteringssystem bör försiktighet iakttas vid utförandet av vätskeöverföring mellan tekniska replikat. Övervakning av roboten under de första installations- och vätskehanteringsstegen rekommenderas starkt. Efter den robotiserade vätskeöverföringen kan manuell återvinning av restvolymer krävas för att undvika provförlust och minska variabiliteterna.
Betydelse för befintliga metoder
Detta protokoll beskriver en halvautomatisk masspektrometribaserad provberedningsmetod med hjälp av lågkostnads- och öppen källkodsroboten OT-2 för vätskehantering. Helt nyligen har andra verk också börjat använda OT-2 mot proteomikapplikationer11. Jämfört med befintliga metoder inkluderar särskiljande egenskaper i detta protokoll användningen av en relativt billig, Python-programmerbar robot; Införlivande av halvautomatiska SP3-pärlor i två steg i provberedningsprotokollen, nämligen steget för avlägsnande av proteinprov och peptidavsaltning/saneringssteg. samt tillgängligheten av Python-skript med öppen källkod för att stödja vidare utveckling. SP3 Paramagnetiska pärlor binder proteiner och peptider effektivt och har kopplats ihop med automatiserade vätskehanteringssystem mot tillämpningar inom proteinrening/tvättmedelsborttagning före enzymatisk nedbrytning i MS-provberedning11,13.
Tre Python-skript med öppen källkod tillhandahålls tillsammans med detta protokoll till forskare. Skripten är anpassningsbara för enskilda experimentella förhållanden (t.ex. provnummer, replikatnummer, inkubationstemperatur och tid etc.) och möjliggör vidareutveckling för modifierade arbetsflöden. Protokollen gav en utmärkt 3%-6% tekniska CV i antalet peptider och/eller protein identifiering mellan MS körningar i vårt laboratorium, jämförbar med tidigare arbete på andra vätskehanteringssystem (<20%)9,11.
Framtida applikationer
Detta protokoll visar nyttan av ett billigt programmerbart vätskehanteringssystem i kombination med SP3-pärlor för halvautomatisk proteomikprovberedning, som kan vara potentiellt tillämplig på masspektrometrilaboratorier och kärnanläggningar för att förbättra effektiviteten i provbehandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH-utmärkelser F32-HL149191 till YH; R00-HL144829 till EL; R21-HL150456, R00-HL127302, R01-HL141278 till MPL. Figur 1, figur 2, figur 3 skapas med hjälp av ett webbaserat vetenskapligt illustrationsverktyg, BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 µL pipette tips | Opentrons | ||
| 4-in-1 tube rack set | Opentrons | Each set includes 2 base stands and 4 tube holder tops 1.5mL, 2mL, 15mL + 50mL, 15mL, and 50mL. We use 2mL and 15 mL + 50 mL tops in this study. | |
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Column | Thermo Scientific | #164568 | 3 μm particle; 100 Å pore; 75 μm x 150 mm |
| Acetonitrile LC-MS grade | VWR | #JT9829 | |
| Aluminum block set | Opentrons | This block set includes 3 tops that are compatible with 96-well, 2.0 mL tubes and a PCR strip to use with the OT-2 temperature module. We use the 2.0mL tube holder in this manuscript. | |
| Ammonium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | # A6141 | |
| Bovine Serum Albumin Standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | #23210 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) LC-MS grade | Thermo Scientific | #85190 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | #D5545 | |
| EASY-Spray HPLC Columns | Thermo Scientific | #ES800A | |
| EasynLC 1200 Nano LC | Thermo Scientific | #LC140 | |
| Ethanol Proof 195-200 | Fisher | #04-355-720 | |
| Formic Acid LC-MS grade | Thermo Scientific | #85178 | |
| Human heart lysate | Novus Biologicals | NB820-59217 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | #I1149 | |
| Magnetic tube rack | Thermo Scientific | #MR02 | |
| MAXQuant v.1.6.10.43 | Tyanova et al., 2016 (https://www.maxquant.org/) | ||
| mySPIN 6 Mini Centrifuge | Thermo Scientific | #75004061 | benchtop mini centrifuge for quick spin |
| NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | ||
| OT-2 magnetic module | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P300 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 P50 single channel pipette | Opentrons | GEN1 | |
| OT-2 robot pipetting robot | Opentrons | OT-2 | |
| OT-2 temperature module | Opentrons | GEN1 | |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Scientific | #23275 | |
| Protein LoBind tubes 2.0 mL | Eppendorf | #022431102 | |
| Protein Sequence Database | UniProt/SwissProt | https://www.uniprot.org/uniprot/?query=proteome:UP000005640% 20reviewed:yes |
|
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophobic | Cytiva | #65152105050250 | |
| Sera-Mag SpeedBead Carboxylate-Modified Magnetic Particles, Hydrophylic | Cytiva | #45152105050250 | |
| SpeedVac | Thermo Scientific | Vacuum evaporator | |
| Thermo Q Exactive HF Mass Spectrometer | Thermo Scientific | #IQLAAEGAAPFALGMBFZ | |
| Trypsin MS Grade | Thermo Scientific | #90057 | |
| Water LC-MS grade | VWR | #BDH83645.400 |
References
- Geyer, P. E., et al. Revisiting biomarker discovery by plasma proteomics. Molecular Systems Biology. 13 (9), 942 (2017).
- Coscia, F., et al. A streamlined mass spectrometry-based proteomics workflow for large-scale FFPE tissue analysis. The Journal of Pathology. 251 (1), 100-112 (2020).
- Yeung, Y. -G., Neives, E., Angeletti, R., Stanley, E. R., et al. Removal of detergents from protein digests for mass spectrometry analysis. Analytical Biochemistry. 382 (2), 135-137 (2008).
- Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
- Lowenthal, M. S., Liang, Y., Phinney, K. W., Stein, S. E. Quantitative bottom-up proteomics depends on digestion conditions. Analytical Chemistry. 86 (1), 551-558 (2014).
- Elliott, K. C., Resnik, D. B. Scientific reproducibility, human error, and public policy. Bioscience. 65 (1), 5-6 (2015).
- Brown, A. W., Kaiser, K. A., Allison, D. B. Issues with data and analyses: Errors, underlying themes, and potential solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (11), 2563-2570 (2018).
- van den Broek, I., et al. Automated multiplex LC-MS/MS assay for quantifying serum apolipoproteins A-I, B, C-I, C-II, C-III, and E with qualitative apolipoprotein E phenotypic. Clinical Chemistry. 62 (1), 188-197 (2016).
- Müller, T., et al. Automated sample preparation with SP3 for low-input clinical proteomics. Molecular Systems Biology. 16 (1), 9111 (2020).
- Fu, Q., et al. Highly reproducible automated proteomics sample preparation workflow for quantitative mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 17 (1), 420-428 (2018).
- Liu, X., Gygi, S. P., Paulo, J. A. A semiautomated paramagnetic bead-based platform for isobaric tag sample preparation. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (6), 1519-1529 (2021).
- Poulsen, K. M., Pho, T., Champion, J. A., Payne, C. K. Automation and low-cost proteomics for characterization of the protein corona: experimental methods for big data. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 6543-6551 (2020).
- Liang, Y., et al. Fully automated sample processing and analysis workflow for low-input proteome profiling. Analytical Chemistry. 93 (3), 1658-1666 (2021).
- Web URL. , Available from: https://opentrons.com/ot-app/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://docs.opentrons.com/v2/ (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/genomics/knowledge-center/cleanup-for-mass-spectrometry (2021).
- Web URL. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23275#/23275 (2021).
- Han, Y., Wright, J. M., Lau, E., Lam, M. P. Y. Determining alternative protein isoform expression using RNA sequencing and mass spectrometry. STAR Protocols. 1 (3), 100138 (2020).
