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Medicine

Un modèle d’abrasion épithéliale pour étudier la cicatrisation des plaies cornéennes

Published: December 29, 2021 doi: 10.3791/63112
Automatic Translation
1, 1, 2, 2,3, 1,2
1College of Optometry, University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center, Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID), Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Ici, un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Ce modèle de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies cornéennes compromises dans le contexte de maladies.

Abstract

La cornée est essentielle à la vision, représentant environ les deux tiers du pouvoir réfractif de l’œil. Sa transparence est cruciale pour le rôle de la cornée dans la vision. Cependant, en raison de sa position externe, la cornée est très sensible à une grande variété de blessures pouvant entraîner une perte de transparence cornéenne et éventuellement la cécité. Une cicatrisation efficace des plaies cornéennes en réponse à ces blessures est essentielle au maintien de l’homéostasie cornéenne et à la préservation de la transparence cornéenne et des capacités de réfraction. En cas de cicatrisation compromise des plaies cornéennes, la cornée devient vulnérable aux infections, aux ulcérations et aux cicatrices. Compte tenu de l’importance fondamentale de la cicatrisation des plaies cornéennes pour la préservation de la transparence et de la vision cornéennes, une meilleure compréhension du processus normal de cicatrisation des plaies cornéennes est une condition préalable à la compréhension de la cicatrisation altérée des plaies cornéennes associées à une infection et à une maladie. Pour atteindre cet objectif, les modèles murins de plaies cornéennes se sont avérés utiles pour approfondir notre compréhension des mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes fonctionnant dans des conditions physiologiques normales. Ici, un protocole pour créer une abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Dans ce modèle, une tréphine circulaire de 2 mm de diamètre, centrée sur la cornée, est utilisée pour délimiter la zone de la plaie. Le spud de club de golf est utilisé avec soin pour débrider l’épithélium et créer une plaie circulaire sans endommager la membrane basale épithéliale cornéenne. La réponse inflammatoire qui en résulte se déroule sous la forme d’une cascade bien caractérisée d’événements cellulaires et moléculaires essentiels à une cicatrisation efficace des plaies. Ce modèle simple de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et bien publié et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation compromise des plaies cornéennes dans le contexte de la maladie.

Introduction

La cornée est le tiers antérieur transparent de l’œil. La cornée remplit plusieurs fonctions, notamment la protection des structures internes de l’œil et la formation d’une barrière structurelle qui protège l’œil contre les infections1. Plus important encore, la cornée est essentielle à la vision, fournissant environ les deux tiers du pouvoir réfractif de l’œil 2,3. Sa transparence est cruciale pour le rôle de la cornée dans la vision. Cependant, en raison de sa position vers l’extérieur, la cornée est exposée à une grande variété de blessures au quotidien qui peuvent entraîner une perturbation de sa fonction de barrière, une perte de transparence et éventuellement la cécité. La perte de transparence cornéenne est l’une des principales causes de déficience visuelle dans le monde 4,5. Les abrasions cornéennes sont une raison courante des visites à la salle d’urgence , représentant la moitié des cas oculaires présentés à l’urgence6. On estime que plus de 1 million de personnes souffrent de blessures oculaires chaque année aux États-Unis7. Une cicatrisation efficace des plaies cornéennes en réponse à ces blessures est essentielle au maintien de l’homéostasie cornéenne et à la préservation de sa transparence et de ses capacités de réfraction. En cas de cicatrisation compromise de la plaie cornéenne, la cornée devient vulnérable aux infections, aux ulcérations et aux cicatrices 8,9. En outre, la popularité croissante des chirurgies réfractives place un défi traumatique unique sur la cornée10. Compte tenu de l’importance fondamentale de la cicatrisation des plaies cornéennes pour la préservation de la transparence et de la vision cornéennes, une meilleure compréhension du processus normal de cicatrisation des plaies cornéennes est une condition préalable à la compréhension de la cicatrisation altérée des plaies cornéennes associées à une infection et à une maladie.

À cette fin, plusieurs modèles animaux de cicatrisation des plaies cornéennes ont été développés 11,12,13,14,15. Les modèles murins de cicatrisation des plaies cornéennes se sont révélés utiles pour approfondir notre compréhension des mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes opérant dans des conditions physiologiques normales. Différents types de plaies cornéennes ont été utilisés dans l’étude de la cicatrisation des plaies cornéennes, chacune convenant à l’étude de différents aspects du processus de cicatrisation des plaies. Les types de modèles de plaies les plus courants utilisés dans les études sur la cicatrisation des plaies cornéennes sont les modèles de plaies mécaniques et chimiques. Les plaies cornéennes chimiques, impliquant principalement la création de brûlures alcalines sur la cornée, sont utiles pour étudier les ulcères cornéens, l’opacification et la néovascularisation13. Les plaies cornéennes mécaniques impliquent des plaies de débridement (abrasion) et des plaies de kératectomie 14,15,16. Une membrane basale épithéliale cornéenne intacte ou percée définit respectivement le débridement et les plaies de kératectomie. Dans les plaies de débridement, la membrane basale épithéliale reste intacte, tandis que dans les plaies de kératectomie, la membrane basale est percée avec pénétration principalement dans le stroma antérieur. Les plaies de débridement sont les plus utiles pour étudier la réépithélialisation, la prolifération des cellules épithéliales, la réponse immunitaire et la régénération nerveuse après une blessure cornéenne. Les plaies de kératectomie, d’autre part, sont les plus utiles pour étudier les cicatrices cornéennes14,15.

Ici, un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé est décrit. Ce modèle simple de cicatrisation des plaies cornéennes est hautement reproductible et bien publié et est maintenant utilisé pour évaluer la cicatrisation des plaies cornéennes compromises dans le contexte de la maladie17.

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Protocol

Tous les protocoles pour animaux ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Houston et du Baylor College of Medicine. Les lignes directrices décrites dans la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sur l’utilisation des animaux dans la recherche sur la vision et l’ophtalmologie ont été suivies dans la manipulation et l’utilisation des souris.

1. Préparation

  1. Préparation de la solution de fluorescéine
    1. Préparer une solution de fluorescéine à 1 % en dissolvant 10 mg de sel de fluorescéine de sodium dans 1 mL de solution saline stérile ou de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile 1x.
      REMARQUE: Préparer la solution de fluorescéine de sodium le jour de l’utilisation ou un jour avant pour éviter la contamination microbienne. Lorsqu’elle est préparée un jour avant utilisation, conserver la solution de fluorescéine à 4 °C à l’abri de la lumière. Enveloppez les tubes avec du papier d’aluminium pour éviter le photoblanchiment.
    2. Divisez la solution en aliquotes pouvant être utilisées dans une seule expérience. 1-1,5 μL de solution de fluorescéine est utilisé par souris et par point temporel. Utilisez la formule suivante pour calculer le volume d’aliquote approprié pour une seule expérience :
      Equation 1
      REMARQUE: Par exemple, si six souris sont étudiées dans une seule expérience avec la taille de la plaie surveillée à cinq points temporels, le volume d’aliquote approprié pour cette seule expérience serait:
      Equation 2
  2. Préparation d’un cocktail kétamine/xylazine pour l’anesthésie des souris.
    1. Pour préparer 10 mL de cocktail, mélanger 2,0 mL de kétamine (100 mg/mL) avec 1,0 mL de xylazine (20 mg/mL) et ajouter 7,0 mL de PBS stérile. Préparez un cocktail de kétamine/xylazine un jour avant ou le jour de la chirurgie.
      REMARQUE: Toutes les solutions doivent être utilisées à température ambiante, sauf indication contraire.

2. Anesthésie

  1. Peser la souris (souris de type sauvage C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines) pour déterminer la quantité appropriée d’anesthésique à administrer. Utilisez la technique de contention de souris à deux mains pour retenir et manipuler les souris pour l’injection de l’anesthésique18. Administrer le cocktail kétamine/xylazine par voie intrapéritonéale (i.p.) à une concentration finale de 80 mg/kg de kétamine et de 8 mg/kg de xylazine.
  2. Attendez que l’anesthésie complète soit réalisée avant d’effectuer une blessure cornéenne sur la souris. Évaluez la profondeur de l’anesthésie en évaluant le réflexe de pédale après le pincement des orteils. Lorsqu’une anesthésie adéquate est obtenue, la souris ne doit pas se déplacer sur le pincement des orteils.
    REMARQUE: Parce que les souris perdent rapidement de la chaleur corporelle pendant l’anesthésie, il est important de fournir une source de chaleur aux souris pour prévenir l’hypothermie. Placez les souris sur une source de chaleur (coussin chauffant) pendant les étapes d’anesthésie et de récupération.

3. Création d’une plaie cornéenne

  1. Plaiez uniquement l’œil droit ou gauche. Maintenir la cohérence avec l’œil (c.-à-d. gauche ou droit) qui est blessé lorsque vous passez d’une souris à l’autre.
    REMARQUE: Parce que les abrasions endommagent les nerfs cornéens et réduisent l’acuité, blesser les deux yeux peut causer un inconfort et une déficience importants. Étant donné que les analgésiques ont le potentiel de supprimer les réponses inflammatoires, leur utilisation peut être un facteur de confusion dans certaines expériences visant à comprendre l’inflammation de la cornée. Éviter les analgésiques dans les expériences sur les plaies cornéennes a été approuvé par notre Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC).
  2. Pour créer la plaie cornéenne épithéliale
    1. Sous un microscope à dissection, utilisez la tréphine de 2 mm de diamètre (voir la figure 1) pour délimiter le centre de la cornée, en gardant l’œil grand ouvert à l’aide du pouce et de l’index pour tenir les paupières. Faites doucement virevolter la tréphine pour faire une impression sur l’épithélium cornéen.
      REMARQUE: Il faut veiller à ne pas appliquer de pression excessive lors de l’utilisation de la tréphine, car cela peut entraîner une perforation de la cornée. En outre, il faut prendre soin de positionner la tréphine au centre. Les pupilles peuvent être utilisées comme point de repère pour localiser le centre de la cornée.
    2. Sous un microscope à dissection, tenez le spud de club de golf émoussé (voir la figure 1) à environ 45° de la surface de la cornée dans la zone délimitée par la tréphine. Grattez soigneusement et continuellement l’épithélium dans la zone délimitée avec le spud pour débrider l’épithélium.
      REMARQUE: N’appliquez pas de force excessive dans le débridement, car cela peut également provoquer une perforation cornéenne. Les yeux des souris peuvent se dessécher pendant le processus de blessure, ce qui rend le débridement difficile. Dans un tel cas, appliquez du PBS stérile sur la surface oculaire pour maintenir une hydratation optimale.

Figure 1
Figure 1 : tréphine de 2 mm et spud de club de golf émoussé. La tréphine est utilisée pour délimiter une région circulaire au centre de la cornée, et le spud du club de golf est utilisé pour enlever l’épithélium dans la région délimitée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Surveillance de la fermeture de la plaie et de la réépithélialisation

  1. Pipette 1-1,5 μL de solution de fluorescéine à 1% sur la surface blessée et image la cornée à l’aide d’un microscope numérique avec une source de lumière bleue.
  2. Acquérir des images dans la première minute de la solution de fluorescéine ajoutée pour éviter de se propager à l’épithélium environnant conduisant à une surestimation de la taille de la plaie. Les cornées blessées sont photographiées à des moments précis (c.-à-d. 0 h, 12 h, 18 h, 24 h et 30 h) après la blessure.
    REMARQUE: À tous les moments, l’imagerie est réalisée sous anesthésie; la kétamine/xylazine est utilisée au moment de la blessure tandis que l’isoflurane est utilisé à des moments ultérieurs. Les souris sont logées individuellement dans des cages séparées pendant toute la durée de la surveillance de la fermeture de la plaie. Lorsqu’elles sont logées ensemble, les souris ont tendance à lécher les yeux de leur compagnon de litière, un comportement dont il a été démontré qu’il affectait la cicatrisation des plaies dans différents tissus19,20.
  3. Analysez les images capturées, traçez la zone de la plaie à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. La zone de la plaie pour chaque point temporel est exprimée en pourcentage de la zone de la plaie d’origine à 0 h.

5. Imagerie et analyse de l’immunofluorescence

  1. Euthanasier les souris par une méthode approuvée par l’IACUC (dans ce cas, surdosage de dioxyde de carbone suivi d’une luxation cervicale) aux moments souhaités après la blessure.
  2. Récoltez les globes oculaires en appuyant doucement sur le canthus latéral pour déplacer le globe oculaire à l’aide de ciseaux incurvés à l’iris. Guidez les ciseaux derrière le globe oculaire pour saisir fermement le nerf optique, puis coupez le nerf, ce qui permet d’enlever le globe oculaire.
  3. Fixez chaque globe oculaire dans 1 mL de 1x PBS contenant 2% de paraformaldéhyde pendant 1 h à température ambiante, puis lavez trois fois dans 1 mL de 1x PBS pendant 5 min chacun.
  4. Sous un microscope à dissection, utilisez une lame chirurgicale pour faire une incision dans la sclérotique, à environ 500 μm distale du limbe, puis coupez à travers le globe. À l’aide d’une pince, retirez doucement la matière de l’iris de la cornée, puis coupez soigneusement le tissu scléral, en vous assurant de laisser les membres intacts.
  5. Faites quatre coupes radiales partielles, chacune d’environ 1 mm de longueur, qui s’étendent de la cornée périphérique et s’arrêtent au centre pour permettre à la cornée de s’aplatir.
  6. Perméabiliser et bloquer les cornées dans 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 2 % et de TritonX-100 à 0,01 % dans 1x PBS pendant 15 min, puis bloquer dans 2 % de BSA dans 1x PBS pendant 45 min supplémentaires à température ambiante.
  7. Incuber les cornées pendant la nuit à 4 °C dans un cocktail d’anticorps conjugués fluorochromes uniques directement marqués préparés dans 1x PBS contenant 2% de BSA.
    REMARQUE: Les anticorps sont ciblés pour marquer des cellules et des tissus spécifiques d’intérêt. Par exemple, l’endothélium, les neutrophiles et les plaquettes sont marqués avec des anticorps anti-CD31 21,22, anti-Ly-6G 23,24 et anti-CD4125,26, respectivement. Le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) est ajouté au cocktail d’anticorps pour visualiser les noyaux.
  8. Après l’incubation, lavez les cornées trois fois dans 1x PBS pendant 15 minutes chacune.
  9. Montez les cornées sur une lame de microscope dans une goutte de milieu de montage à fluorescence anti-décoloration, couvrez avec un couvercle et image avec le grossissement souhaité (objectif 4x à 100x) à l’aide d’un microscope à fluorescence. Prenez des images pleine épaisseur de la cornée dans différentes régions, comme illustré à la figure 2A.
    REMARQUE : Le modèle d’analyse microscopique illustré à la figure 2A est utilisé pour analyser des changements régionaux spécifiques dans l’inflammation et la division cellulaire. La coloration DAPI et Ly-6G est utilisée pour identifier les neutrophiles extravasculaires. Avec la coloration DAPI, les neutrophiles sphériques ont un noyau distinct en forme de fer à cheval ou de beignet (Figure 2B).

Figure 2
Figure 2: Stratégie d’imagerie cornéenne et infiltration de neutrophiles après abrasion centrale. (A) Représentation schématique d’un ensemble de cornée montrant neuf champs microscopiques sur le diamètre de la cornée. La zone grise représente la zone de plaie d’origine. La largeur de chaque région est de 500 μm. (B) Notez la forme distincte en fer à cheval ou en beignet des noyaux neutrophiles avec coloration DAPI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Representative Results

La figure 3 montre une micrographie électronique à transmission d’une plaie cornéenne créée avec le spud émoussé du club de golf, démontrant que la membrane basale épithéliale est en effet intacte après une blessure.

Figure 3
Figure 3 : La membrane basale épithéliale reste intacte après abrasion cornéenne. Micrographie électronique à transmission d’une plaie cornéenne créée avec le spud émoussé du club de golf. Les pointes de flèche pointent vers la membrane basale sous l’épithélium restant entourant la plaie, tandis que les flèches pointent vers la membrane basale dans la zone dénudée. Cela montre la continuité de la membrane basale des parties non abrasées aux parties abrasées de la cornée, démontrant que la membrane basale est laissée intacte après le débridement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ce protocole pour les plaies cornéennes a été largement utilisé pour caractériser la dynamique de cicatrisation d’une plaie d’abrasion épithélialede 2 mm 27,28,29,30,31,32,33. La capacité de surveiller le taux de fermeture et de réépithélialisation des plaies in vivo est un élément central de ce modèle. Comme le montre la figure 4A, l’utilisation d’une solution de fluorescéine et d’un microscope numérique avec une source de lumière bleue permet de visualiser la taille de la plaie. Dans ce modèle, la surveillance de la fermeture de la plaie est effectuée au moment de la blessure (0 h), 12 h, 18 h, 24 h et 30 h après la blessure. La figure 4B montre la cinétique de fermeture de la plaie sur 30 h. Chez les souris de type sauvage C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines, la fermeture et la réépithélialisation de la plaie sont généralement complètes 24 heures après la blessure, comme illustré à la figure 4B, et une réponse inflammatoire bien régulée est fondamentale pour une cicatrisation efficacedes plaies 34,35,36.

Figure 4
Figure 4 : La fermeture de la plaie épithéliale a été évaluée à l’aide d’une coloration à la fluorescéine. (A) Images représentatives de la coloration à la fluorescéine de la plaie cornéenne à 0 h, 12 h, 18 h, 24 h et 30 h. Dans ce modèle, la fermeture de la plaie est généralement complète 24 heures après la blessure. Notez l’absence de coloration verte dans la cornée centrale à 24 h et 30 h. (B) Cinétique de fermeture de la plaie indiquant une fermeture complète de la plaie de 24 h après la blessure. La valeur à chaque point temporel est exprimée en pourcentage de la zone de la plaie d’origine (c.-à-d. la zone de la plaie à 0 h) (n ≥ 6). Données présentées comme moyennes ± écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La réponse inflammatoire à la blessure dans ce modèle est bien caractérisée. La plaie d’abrasion épithéliale provoque une réponse inflammatoire rapide dans le système limbique cornéen principalement caractérisée par une vasodilatation, une extravasation plaquettaire confinée au limbus 37,38,39 et une extravasation neutrophile avec migration vers le centre de la cornée 40. La figure 5 montre le système vasculaire limbique d’une cornée non enroulée avec des neutrophiles extravasculaires (figure 5A) et d’une cornée blessée avec des plaquettes extravasculaires et des neutrophiles (figure 5B).

Figure 5
Figure 5 : Imagerie des cellules inflammatoires au niveau des limbes. Photomicrographie du limbe cornéen montrant une coloration des vaisseaux sanguins limbiques avec un anticorps anti-CD31 (en rouge), des neutrophiles avec un anticorps anti-Ly-6G (en vert) et des plaquettes avec un anticorps anti-CD41 (en bleu). (A) pas d’abrasion et (B) 30 h après l’abrasion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans ce modèle, l’infiltration de neutrophiles dans la cornée est évaluée dans cinq régions distinctes, comme illustré à la figure 2A. Pour déterminer ces régions distinctes, une image de l’ensemble de la cornée est capturée, visualisant le système vasculaire limbique avec une coloration anti-CD31. Le bord le plus interne de la région limbique sur chaque pétale est marqué en utilisant le système vasculaire limbique comme guide. La distance entre le bord le plus interne de la région limbique d’un pétale à l’autre dans la direction horizontale (x) ou verticale (y) est mesurée pour chaque monture entière de la cornée. Pour les souris de type sauvage C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines, cette distance est d’environ 3,7 mm. Cette distance couvre les régions périphérique à périphérique. Le centre du mont entier de la cornée est alors calculé comme le point correspondant à la moitié du diamètre horizontal ou vertical du montage entier. La région paracentrale est à 500 μm à gauche, à droite, en haut ou en bas du centre calculé. Les autres champs sont tous à 500 μm du champ précédent. La coloration DAPI et Ly-6G est utilisée pour identifier les neutrophiles extravasculaires. Le nombre de neutrophiles dans chaque région cornéenne des quatre quadrants est moyenné et exprimé en neutrophiles par champ.

L’évaluation des plaquettes dans ce modèle est effectuée au niveau du limbe seulement; pendant la cicatrisation des plaies cornéennes, les plaquettes extravasent et se localisent dans les limbes27,37. Le nombre total de plaquettes au niveau des limbes est compté, et les numérations sont exprimées en plaquettes/mm2 de la zone limbique. Les comptes des quatre pétales peuvent être totalisés ou moyennés.

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Discussion

Le but de cet article sur les méthodes était de décrire un protocole pour créer une plaie d’abrasion épithéliale cornéenne centrale chez la souris à l’aide d’une tréphine et d’un spud de club de golf émoussé. Ce modèle murin a été utilisé pour étudier l’inflammation de la cornée et sa contribution à la cicatrisation des plaies. Ce type de modèle peut être utilisé pour étudier les mécanismes de cicatrisation des plaies cornéennes dans des conditions physiologiques normales et dans des pathologies 17,28,29,41,42. Le modèle a été utilisé pour étudier la cicatrisation des plaies cornéennes dans des conditions pathologiques, comme en témoigne une étude sur la cicatrisation altérée des plaies cornéennes dans un modèle murin d’obésité induite par l’alimentation17. Un avantage distinct de ce modèle est qu’il crée une taille de plaie épithéliale reproductible exacte (2 mm) avec un emplacement central précis sans percer la membrane basale. Ce modèle de blessure cornéenne est simple et rapide à réaliser. En plus du club de golf émoussé spud 29,39,43,44,45, la bavure rotative (Algerbrush)38,46,47, et la lame diamantée 32,37,40,48,49,50,51 peuvent tous deux être utilisés pour créer la plaie d’abrasion dans ce modèle. Dans les mains d’un utilisateur expérimenté, il n’y a pas de différence substantielle dans la plaie d’abrasion créée par l’un ou l’autre outil. À des fins d’entraînement et entre les mains d’un novice, il est souvent plus facile d’obtenir des résultats reproductibles avec le spud de club de golf émoussé par rapport à la bavure rotative et à la lame diamantée. La bavure rotative (Algerbrush) nécessite un toucher délicat sinon la bavure rotative peut endommager la membrane basale épithéliale. Cela a également été rapporté par d’autres enquêteurs52,53. D’autre part, le spud de club de golf émoussé laisse constamment intacte la membrane basale épithéliale.

Pour reproduire avec succès ce protocole de plaie cornéenne et observer la réépithélialisation et la dynamique de l’inflammation ultérieures, la même souche et la même tranche d’âge de souris doivent être utilisées, et la taille et la profondeur de la plaie doivent être créées comme décrit ci-dessus. La dynamique et les délais de cicatrisation des plaies cornéennes décrits dans ce protocole concernent la souche de souris C57BL/6 et peuvent ne pas être partagés si une souche de souris différente est utilisée. Pal-Ghosh et coll.54 ont signalé des variations dans la capacité du C57BL/6 et du BALB/c à guérir les plaies de débridement épithélial cornéen. Pour la même taille de plaie cornéenne, la fermeture et la réépithélialisation de la plaie cornéenne sont plus lentes chez les souris BALB/c. Le calendrier pour l’achèvement de la fermeture de la plaie et la réponse inflammatoire caractéristique décrite ici sont pour une plaie circulaire de 2 mm de diamètre. Un temps de fermeture de la plaie plus long est prévu pour les diamètres de plaie supérieurs à 2 mm, tandis qu’un temps plus court est prévu pour les diamètres de plaie inférieurs à 2 mm. En outre, les plaies cornéennes plus grandes, en particulier celles qui sont plus proches des limbes, devraient provoquer une réponse inflammatoire plus exagérée, car davantage de leucocytes sont recrutés dans la cornée16. Plus important encore, la plaie doit être limitée à l’épithélium cornéen. Les plaies qui percent la membrane basale épithéliale ou pénètrent dans le stroma cornéen prennent plus de temps à guérir. Ces plaies sont également associées à une réponse inflammatoire altérée, à une néovascularisation, à la formation de myofibroblastes et à la cicatrisation55,56.

Des précautions doivent être prises à chaque étape pour prévenir l’infection microbienne de la cornée abrasée. L’infection microbienne modifie la réponse inflammatoire et peut entraîner des ulcérations, des cicatrices et une perte de vision57. Pour prévenir l’infection microbienne de la plaie, des outils et des solutions stériles doivent toujours être utilisés. Si plusieurs souris sont blessées à la fois, une tréphine stérile doit être utilisée pour chaque souris. Entre les souris, le spud du club de golf doit être lavé dans du PBS stérile, suivi d’une désinfection à 70% d’éthanol et lavé à nouveau dans du PBS stérile. Si la blessure est effectuée sur des souris supplémentaires sur plusieurs jours, elle doit être effectuée au même moment de la journée. Il s’agit de contrôler l’effet circadien sur la cicatrisation des plaies et l’inflammation. Chez les souris C57BL/6, le moment de la journée où la plaie est faite affecte le taux et la qualité de la cicatrisation de la plaie cornéenne. Une fermeture plus rapide de la plaie et une plus grande division cellulaire sont observées lorsque les souris sont blessées le matin par rapport aux blessures de l’après-midi ou du soir42. L’effet circadien sur la cicatrisation des plaies a été rapporté dans d’autres tissus, y compris la peau58,59. La blessure dans ce modèle est toujours effectuée le matin.

La réponse inflammatoire résultante à la blessure dans ce modèle se déroule comme une cascade bien caractérisée d’événements cellulaires et moléculaires qui sont essentiels pour une cicatrisation efficace des plaies. Les acteurs cellulaires les mieux caractérisés dans l’inflammation induite par l’abrasion dans ce modèle sont les neutrophiles et les plaquettes. Les neutrophiles sont les premiers intervenants sur le site de l’abrasion cornéenne; des niveaux significatifs de neutrophiles sont détectés dans le stroma cornéen dans les 6 heures suivant la blessure. Les neutrophiles sont responsables de l’élimination des débris cellulaires, un processus intrinsèque à l’inflammation et à la réparation desplaies 60. En plus de leurs activités phagocytaires, les neutrophiles contiennent des facteurs de croissance tels que les facteurs de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF)61. Le VEGF est un facteur neuro-régénérateur crucial pour la régénération des nerfs cornéens après une blessure de 62,63 et est également important pour la division des cellules épithéliales cornéennes 45,63. L’infiltration de neutrophiles au niveau des limbes se produit en deux vagues, le premier pic à 18 h et le second à 30 h après40 s de blessure. En utilisant des souris neutropéniques37,40, l’extravasation des neutrophiles et la migration ultérieure vers le centre de la cornée se sont avérées cruciales pour la cicatrisation des plaies cornéennes. Bien que traditionnellement connues pour être essentielles dans le maintien de l’hémostase et de la coagulation sanguine, les plaquettes ont également un rôle clé reconnu dans la cicatrisation des plaies cornéennes37. Les plaquettes contiennent de nombreux médiateurs qui contribuent à l’inflammation et à la résolution tissulaire64,65. Chez les souris atteintes de thrombocytopénie, ce modèle a été utilisé pour montrer que les plaquettes sont importantes pour une cicatrisation efficace des plaies cornéennes37.

Bien que les neutrophiles et les plaquettes soient les cellules les mieux caractérisées de ce modèle, il a également été démontré que les cellules immunitaires telles que les lymphocytes T gamma delta, les cellules tueuses naturelles et les cellules dendritiques sont impliquées dans la réponse immunitaire à la blessure à l’aide de ce modèle27,48. Une extravasation des cellules tueuses naturelles dans le stroma28,29 et la migration des lymphocytes T gamma delta dans l’épithélium cicatrisant27 ont été rapportées. Ce modèle a également été utilisé pour identifier les molécules d’adhésion clés de l’extravasation des cellules immunitaires pendant la cicatrisation des plaies cornéennes. L’antigène de la fonction lymphocytaire-1 (LFA-1)32, CD1851 et la molécule d’adhésion intercellulaire-1 (ICAM-1)47,49 se sont tous révélés cruciaux pour l’extravasation des neutrophiles et la cicatrisation efficace des plaies cornéennes à l’aide de ce modèle. La division des cellules épithéliales en réponse à la blessure, qui est essentielle pour la restratification épithéliale après la fermeture de la plaie est évaluée à l’aide de chiffres mitotiques. La condensation chromosomique au cours des différents stades de la division cellulaire donne aux noyaux un aspect caractéristique connu sous le nom de figure mitotique. La coloration DAPI du noyau permet de visualiser ces figures mitotiques.

Le modèle de plaie d’abrasion cornéenne de souris s’est avéré remarquablement reproductible et a fourni des informations considérables sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contribuent à une cicatrisation efficace des plaies. Cependant, il convient de noter que le modèle présente des limites en ce qui concerne son applicabilité clinique. Le modèle et ses résultats ne sont applicables qu’aux abrasions épithéliales simples et non pénétrantes. Comme indiqué précédemment, les lésions cornéennes résultant de plaies pénétrantes causées par une insulte physique ou chimique entraîneront des cinétiques et des résultats différents de cicatrisation, en particulier si la plaie est infectée, comme cela se produit souvent dans le cas de blessures à la cornée humaine. Cela étant dit, le modèle de plaie d’abrasion cornéenne de souris fournit une excellente base pour étudier les principes fondamentaux de l’inflammation qui modulent la cicatrisation des plaies cornéennes.

Le protocole de blessure cornéenne décrit ici est simple et facile à reproduire. Il fournit un outil utile pour étudier les questions fondamentales sur le processus de cicatrisation des plaies cornéennes et sa réponse inflammatoire associée. Son potentiel pour aider à comprendre les pathologies cornéennes associées aux complications de la cicatrisation des plaies n’est que le début.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Financement : Soutenu par : NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. et R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) et Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les points de vue officiels des National Institutes of Health ou de Sigma Xi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947

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Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).

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