Summary
Здесь мы представляем протокол для ятрогенного перелома ствола бедренной кости крыс-альбиносов Wistar и наблюдения за развитием мозоли. Эта модель остеотомии бедренной кости может помочь исследователям оценить процесс заживления переломов и изучить, как препарат может повлиять на заживление переломов.
Abstract
Заживление переломов – это физиологический процесс, приводящий к регенерации костных дефектов скоординированным действием остеобластов и остеокластов. Остеоанаболические препараты могут увеличить восстановление переломов, но имеют ограничения, такие как высокая стоимость или нежелательные побочные эффекты. Потенциал заживления костей препарата может быть первоначально определен исследованиями in vitro , но для окончательного доказательства концепции необходимы исследования in vivo . Наша цель состояла в том, чтобы разработать модель остеотомии бедренной кости грызунов, которая могла бы помочь исследователям понять развитие образования мозоли после перелома ствола бедренной кости и которая могла бы помочь установить, обладает ли потенциальный препарат свойствами заживления костей. Взрослые самцы крыс-альбиносов Wistar были использованы после разрешения Институционального комитета по этике животных. Грызунов обезболивали, а в асептических условиях создавались полные поперечные переломы на средней трети стволов бедренных костей с помощью открытой остеотомии. Переломы были уменьшены и внутренне зафиксированы с помощью интрамедуллярных K-проводов, и было разрешено вторичное заживление переломов. После операции в течение 5 дней давали внутрибрюшинные анальгетики и антибиотики. Последовательные еженедельные рентгеновские снимки оценивали образование мозоли. Крыс приносили в жертву на основе радиологически заранее определенных временных точек, а развитие перелома мозоли анализировали рентгенологически и с помощью иммуногистохимии.
Introduction
Кость представляет собой плотную соединительную ткань, состоящую из костеобразующих клеток, остеобластов и костно-резорбирующих клеток, остеокластов. Заживление переломов – это физиологический процесс, приводящий к регенерации костных дефектов скоординированным действием остеобластов и остеокластов1. Когда есть перелом, остеобластная и остеокластическая активность в месте перелома являются одними из важных факторов, которые определяют заживление кости2. Когда заживление перелома отклоняется от своего нормального течения, это приводит к задержке союза, неправильному объединению или непрофсоюзированию. Говорят, что перелом находится в непрофсоюзном состоянии, когда происходит неудача соединения перелома в течение 9 месяцев, без прогрессирования восстановления в течение последних 3 месяцев3. Примерно 10%-15% всех переломов испытывают задержку в восстановлении, которая может прогрессировать до несоединения4. Коэффициент несращения для всех переломов составляет 5%-10% и варьируется в зависимости от вовлеченной кости и места перелома5.
Нынешняя схема лечения несращения переломов включает хирургические и/или медицинские методы. В настоящее время отсроченные или несращенные переломы могут быть преодолены хирургическими стратегиями, такими как пересадка кости. Тем не менее, костная трансплантация имеет свои ограничения и осложнения, такие как доступность ткани трансплантата, боль в донорском участке, заболеваемость и инфекция6. Медицинское лечение включает остеоанаболические препараты, такие как костный морфогенетический белок (BMP) и терипаратид (аналог паратормона). Используемые в настоящее время остеоанаболические агенты обладают потенциалом для увеличения восстановления переломов, но имеют ограничения, такие как непомерные затраты или нежелательные побочные эффекты7. Таким образом, существуют возможности для выявления экономически эффективных, нехирургических альтернатив заживлению костей. Потенциал заживления костей препарата может быть первоначально определен исследованиями in vitro , но для окончательного доказательства концепции необходимы исследования in vivo . Препарат, который, как известно, улучшает заживление костей, должен оцениваться in vitro и, если он будет признан многообещающим, может быть использован для исследований in vivo на животных. Если окажется, что препарат способствует формированию и ремоделированию костей в модели in vivo , он может перейти к следующему этапу (т. Е. Клиническим испытаниям).
Оценка заживления переломов у животных является логическим шагом вперед для оценки нового агента, введенного для заживления костей, прежде чем он пройдет испытания на людях. Для исследований заживления переломов in vivo на животных грызуны становятся все более популярной моделью8. Модели грызунов вызвали растущий интерес из-за низких эксплуатационных расходов, ограниченной потребности в пространстве и меньшего времени, необходимого для заживления костей9. Кроме того, грызуны обладают широким спектром антител и генных мишеней, что позволяет проводить исследования молекулярных механизмов заживления и регенерации костей10. Консенсусное совещание всесторонне выделило различные модели заживления костей мелких животных и сосредоточилось на различных параметрах, влияющих на заживление костей, а также на нескольких моделях переломов мелких животных и имплантатах11.
Базовые модели переломов можно в широком смысле разделить на открытые или закрытые модели. Модели закрытых переломов используют трех- или четырехточечную изгибающую силу на кости и не требуют обычного хирургического подхода. Они приводят к косым или спиральным переломам, напоминающим у человека переломы длинных костей, но отсутствие стандартизации расположения и размеров переломов может выступать в качестве сбивающего с толку фактора в них12. Открытые модели переломов требуют хирургического доступа для остеотомии кости, помогают достичь более последовательной картины перелома в месте перелома, но связаны с задержкой заживления по сравнению с закрытыми моделями13. Выбор кости, используемой для изучения заживления переломов, в основном остается большеберцовая и бедренная кости из-за их размеров и доступности. Выбор места перелома обычно является диафизом или метафизом. Метафизарная область специально выбирается в тех случаях, когда заживление переломов изучается у остеопоротических субъектов, так как метафиз больше подвержен влиянию остеопороза14. Несколько имплантатов, таких как интрамедуллярные штифты и внешние фиксаторы, могут быть использованы для стабилизации перелома11,15.
Цель этого исследования состояла в том, чтобы разработать простую и легкую в использовании модель грызунов, которая могла бы помочь исследователям не только понять развитие мозоли после перелома бедренной кости, но и помочь определить, обладает ли потенциальный препарат свойствами заживления костей, понимая механизм, с помощью которого он действует.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были проведены после получения этического одобрения от Институционального комитета по этике животных (IAEC), AIIMS, Нью-Дели, Индия (286/IAEC-1/2021).
1. Предоперационная процедура
- Домашний самец крыс-альбиносов Wistar в возрасте 6-8 недель, весом от 150 до 200 г каждый, в Центральном животноводческом учреждении (CAF) в отдельных индивидуальных клетках. Это гарантирует отсутствие хирургической травмы / травмы места перелома, когда несколько крыс делят клетки.
- Держите крыс при температуре 23 ° C ± 2 ° C в среде с контролируемой влажностью с относительной влажностью 50% ± 5%, подвергайте их 12-часовому циклу темноты / света и дайте ad libitum доступ к пище (стандартная полусинтетическая диета): пеллетная диета (сухая) и вода. Состав стандартной полусинтетической диеты следующий: жареная бенгальская граммовая мука (60%), пшеничная мука (22%), казеин (4%), сухое обезжиренное молоко (5%), рафинированное масло (4%), соляная смесь с крахмалом (4,8%), витаминно-холиновая смесь с крахмалом (0,2%).
- Акклиматизируйте крыс в течение не менее 48 ч до операции.
- Взвесьте каждую крысу на цифровых весах и запишите вес.
- Вводят внутрибрюшинные (IP) инъекции цефуроксима (100 мг/кг массы тела), трамадола (25 мг/кг массы тела) и комбинации кетамина (75 мг/кг массы тела) с ксилазином (10 мг/кг массы тела) крысам за 15 мин до начала хирургической процедуры. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость глаз.
- Удалите волосы с правой нижней конечности, от области бока до коленного сустава, с местным нанесением крема для удаления волос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь (0,5 мл) может быть собрана из хвостовой вены каждой крысы для базового анализа различных параметров. Кровь можно собирать снова каждые 2 недели после операции.
2. Хирургическая процедура создания полного поперечного перелома путем открытой остеотомии
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте специально отведенное операционное с операционным столом и оптимальной температурой окружающей среды (26 °C) для выполнения процедуры.
- Поместите восковой блок (алюминиевый лоток 30 см х 30 см х 4 см, содержащий воск на глубину до 2,5 см) на операционный стол и накройте его стерильными шторами. Восковой блок предотвращает любое изменение положения животного во время операции.
- Подтвердите начало анестезии (проверив потерю защемления пальцев ног). Поместите анестезированную крысу на стерильную драпировку в левом боковом положении. Попросите помощника держать правую нижнюю конечность (колено и бедро) в разгибании. Держите стерильную жесткую опору (мраморный блок) под правой ногой, чтобы поддерживать бедренную кость. Очистите место операции спиртом и бетадином.
- Вводят местную анестезию (0,25 мл 1% лигнокаина) в место разреза (боковой аспект правого бедра), вырезают отверстие в другой стерильной драпировке и подвергают через нее только правую ногу крысы для операции.
- Сделайте вертикальный разрез кожи 1 см на боковой стороне правого бедра и вытяните его по мере необходимости хирургическим лезвием No 15.
- Обнажите мышцу vastus lateralis, отделив глубокую фасцию с помощью ножниц Метценбаума. Расщепление vastus lateralis в соответствии с мышечными волокнами с помощью щипцов артерий до тех пор, пока не будет достигнут стержень бедренной кости.
- Освободите кость от прикрепленных к ней мышц с помощью периостального лифта.
- Вводят местную анестезию (0,2 мл 1% лигнокаина) в надкостницу и вокруг нее для предотвращения вазовагального рефлекса.
- Создайте углубление в средней трети стержня бедренной кости с помощью хирургического лезвия No 15 и переломите кость в средней трети вала (полный перелом), поместив зубило на сделанный углубление (чтобы зубило не соскользнуло) и аккуратно постукивая молотком по зубилу. Используйте стерильную жесткую опору (мраморный блок) для поддержки кости при ее разрыве, чтобы обеспечить чистый разрыв.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная жесткая опора обычно не вызывает значительной травмы мышц под ней. - Внутренне зафиксируйте перелом с помощью стерильной K-проволоки (1,0 мм), проводимой с помощью силовой дрели с батарейным питанием. Пропустите К-проволоку в медуллярный канал дистального фрагмента через место перелома. Затем просверлите K-провод через дистальный конец бедренной кости с помощью силовой дрели с батарейным питанием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продезинфицируйте поверхность силовой дрели спиртом перед использованием. Смените перчатки после фиксации K-wire. - После уменьшения перелома продвигают К-проволоку от дистального конца в канал проксимального фрагмента до тех пор, пока она не приобретется в трохантерической области. Отрежьте дистальную часть К-проволоки, выступающую через кожу, с помощью проволочного резака.
- Согните кончик K-проволоки примерно до 90° с помощью плоскогубцев и используйте марлевую повязку, пропитанную бетадином, для повязки на месте штифта. К-проволока действует как интрамедуллярная шина для удержания перелома в уменьшенном положении.
- Обеспечьте полный гемостаз перед закрытием кожи с помощью нейлонового шва 3-0. Надавите на область кровотечения, используя стерильную марлю или щипцы артерий, чтобы остановить любое кровотечение.
- Очистите рану бетадином, и накройте ее стерильной марлей и микропористой скотчем.
3. Послеоперационный уход
- Верните крыс в клетки, допустите нормальную амбулацию и продолжайте давать стандартную полусинтетическую диету до тех пор, пока не принесут их в жертву, а также антибиотики (инъекция цефуроксима 100 мг/кг) и анальгетики (инъекция трамадола 25 мг/кг/сут в двух разделенных дозах) внутрибрюшинно в течение 5 дней после процедуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крыс можно разделить на лечебные и контрольные группы для тестирования конкретного препарата. Если препарат водорастворим, его можно вводить перорально через гиваж. Вес отдельных животных может быть отмечен для расчета дозы препарата, который будет использоваться. Критерии включения и исключения могут соблюдаться для обеспечения однородности групп животных. - Размещайте животных в отдельных клетках в условиях, аналогичных предоперационному периоду. Осматривайте место операции каждый день, чтобы найти любые признаки послеоперационной боли, раневой инфекции, скольжения швов или любого вздутия живота или дискомфорта.
- Оцените заживление костей с помощью рентгеновского снимка места перелома один раз в неделю.
4. Рентгенологическая процедура
- Перед рентгеном обезболивают крыс внутрибрюшинной инъекцией кетамина (50 мг/кг массы тела) и ксилазина (5 мг/кг массы тела).
- Держите тазобедренный сустав крысы в согнутом и похищенном положении, в то время как коленный сустав держится полусогнутым, чтобы сделать рентгеновский снимок сломанной конечности со следующими настройками воздействия: Ref. kVp ≈ 62; Ссылка mAS = 6,4; и автоматические настройки экспозиции (Ref. mA=160).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рентгеновские снимки были сделаны на исходном уровне (через 1 день после операции), а затем один раз в неделю до жертвоприношения или 5 недель.
5. Эвтаназия животных и извлечение мозоли
- Жертвуют крыс передозировкой углекислого газа (вводят 100%СО2 со скоростью потока 7-8 л/мин в течение 1 мин с последующим периодом ожидания 4-5 мин), в двух заранее определенных временных точках, исходя из рентгенологического вида мягких и жестких мостовых мозолей соответственно.
- Разрезайте кожу параллельно бедренной кости и тщательно отделите вышележащие мышцы, чтобы избежать повреждения ткани мозоли.
- Перелом кости между тазобедренным суставом и мозолью с помощью молотка и зубила. Аналогично перелом кости между мозолью и коленным суставом. Удалите K-проволоку и очистите кусок кости в физиологическом растворе, чтобы удалить сгустки крови и мягкие ткани.
- Немедленно переложите мозоль в маркированный контейнер с 10% нейтральным буферизованным формалином (20 мл на образец) и храните его в течение 3 дней при комнатной температуре (RT).
6. Декальцинация костной и мозолистой ткани
- Возьмите мозолистую ткань из формалина и держите ее на RT в 20% растворе ETDA, рН 7, для декальцинации костной ткани.
- Меняйте свежий раствор ЭДТА каждые 2 дня в течение примерно 3 недель и проверяйте декальцификацию кости, тыкая кость иглой, не нарушая ткань мозоли. Оптимальное декальцинирование обозначается потерей нормального зернистого ощущения костной ткани.
- После полной декальцификации отрежьте сагиттальный участок мозоли и подготовьте парафиновые блоки ткани мозоли. Отрезают участки мозолистой ткани толщиной 4 мкм для гистопатологического16 и любого другого сравнительного анализа17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это исследование было предпринято для разработки модели остеотомии бедренной кости у крыс-альбиносов Wistar. Эта модель может быть использована для оценки заживления костей, а также остеогенного эффекта перспективного остеоанаболического препарата в заживлении костей. Соблюдались стандартные хирургические меры предосторожности и протоколы. Для процедуры использовались стерильные халаты, шторы и хирургическое оборудование (рисунок 1). Оборудование (таблица 1) стерилизовали за 48 ч до операции. Анестетик, анальгетик и антибиотики использовались в соответствии с протоколом, чтобы гарантировать, что животные всегда были без боли и инфекции. Кровь (0,5 мл) может быть собрана из хвостовой вены каждой крысы для исходного анализа и последовательного хронологического сравнительного наблюдения за различными параметрами по мере заживления переломов. Волосы удаляли от области бока до области колена с помощью крема для удаления волос (рисунок 2). Процедура остеотомии заняла около 10 минут (от первого разреза до шва). Инфекция и смертность были незначительными при соблюдении асептических мер предосторожности. Разрез делали после местной анестезии (лигнокаина), а стержень бедренной кости обнажали после втягивания волокон vastus lateralis (рисунок 3). Углубление (бороздка) было создано в кости с помощью хирургического лезвия, чтобы убедиться, что зубило не соскользнуло. Стерильная твердая опора (мраморный блок) использовалась для поддержки кости при ее разрыве для обеспечения чистого разрыва (рисунок 1). Полный поперечный перелом был вызван в средней трети вала бедренной кости с помощью зубила и молотка (рисунок 4).
Перелом был внутренне зафиксирован с помощью стерильной K-проволоки (1,0 мм). К-проволока пропускалась в медуллярный канал дистального фрагмента через место перелома. Затем K-проволоку просверливали через дистальный конец бедренной кости. Перелом уменьшали, а затем К-проволоку продвигали от дистального конца в канал проксимального фрагмента до тех пор, пока он не получил покупку в трохантерической области. Дистальная часть К-проволоки, выступавшая через кожу, была отрезана. K-провод действовал как интрамедуллярная шина, чтобы удерживать перелом в уменьшенном положении (рисунок 5).
Рентгеновский снимок переломной области был сделан через 1 день после операции и еженедельно после этого, чтобы оценить внешний вид мозоли (начало заживления перелома) и появление мостовой мозоли (первая точка, когда разрыв перелома был заживлен), как оценивал радиолог (рисунок 6). Двумя радиологическими временными точками для сравнительной оценки заживления переломов были появление (визуализация) (мягкой) мозоли и появление мостовой (твердой) мозоли.
После жертвоприношения бедренную кость тщательно сохраняли в формалине, за которым следовал протокол декальцификации кости (рисунок 7). К-образная проволока была удалена во время жертвоприношения, заботясь о том, чтобы не потревожить мозоль. После полной декальцинации кость разрезали на сагиттальные участки и сохраняли в парафиновых блоках для секционирования (участки толщиной 4 мкм) по мере необходимости. Гематоксилин-и-эозин-окрашенный участок места перелома и мозоли подтвердили образование хряща и новой кости в конце 5 недель (рисунок 8).
Рисунок 1: Стерильные хирургические инструменты, хранящиеся на хирургической драпировке на операционном столе. Хирург готов начать хирургическую процедуру в стерильной среде со стерильными инструментами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Обезболенную крысу держат на операционном столе. После обезболивания крысе и удаления волоса вокруг места разреза его держат на операционном столе в левом боковом положении, обнажая правую ногу для остеотомии. Другая хирургическая драпировка используется для пропуска правой ноги через отверстие в этой драпировке, чтобы гарантировать, что только нога подвергается воздействию, тем самым сводя к минимуму раневые инфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Хирургическая процедура: Обнажение стержня бедренной кости крысы. Во время остеотомии, после того, как vastus lateralis обнажается, он расщепляется в соответствии с мышечными волокнами, чтобы обнажить стержень бедренной кости. Кость освобождается от прикрепленных мышц с помощью периостального лифта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Создание полной поперечной остеотомии в средней трети стержня бедренной кости с помощью зубила и молотка. Полный поперечный перелом создается в средней трети вала бедренной кости путем осторожного постукивания молотком по зубилу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: К-образная проволока действует как интрамедуллярная шина для удержания перелома в уменьшенном положении. К-проволока пропускается в медуллярный канал дистального фрагмента через место перелома. Затем K-проволока просверливается через дистальный конец бедренной кости. Перелом уменьшается, а затем К-проволока продвигается от дистального конца в канал проксимального фрагмента до тех пор, пока он не получит покупку в трохантерической области. Это делается с помощью силовой дрели с батарейным питанием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Рентген бедренной кости крысы с помощью K-wire in situ. (A) Перед индуцированием перелома и (B) через 1 день после операции. Заживление перелома контролируется радиологически путем последовательного еженедельного рентгеновского снимка прооперированного участка для радиологической оценки образования мозоли. Перелом остается уменьшенным и обездвиженным интрамедуллярной К-проволокой. Репрезентативные данные до и после не принадлежат одному и тому же животному. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Кость с мозолью (после оптимальной декальцификации), полученная после принесения животного в жертву в заранее определенный момент времени. (А) Неповрежденная мозоль; (B) Сагиттальное сечение мозоли. После жертвоприношения животного участок места перелома получают, сохраняют и декальцифицируют по описанной методике. Мозоль периодически оценивается для обеспечения оптимальной декальцификации, прежде чем оценивать ее любыми другими методами (эталонная шкала в сантиметрах). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Гематоксилин-и-эозин-окрашенный участок места перелома, показывающий твердую мозоль с образованием хряща и новой кости. (A) Низкое увеличение; (B) Высокое увеличение. Гематоксилин-и-эозин-окрашенные участки места перелома показывают твердую мозоль с образованием хряща (черные стрелки) и новой кости (желтые стрелки) (A: 40x; B: 100x). Синяя стрелка показывает перелом конца кости, а красная стрелка показывает вторую кортикальную область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод ясно описывает детали, необходимые для разработки модели остеотомии переломов у крыс-альбиносов Wistar. Эта модель может быть использована для оценки остеогенного эффекта перспективного остеоанаболического препарата в заживлении переломов, а также для понимания тонкостей заживления костей. Характерной особенностью этого метода является то, что он прост и не требует слишком много времени или сложного оборудования. В этом методе взрослые самцы крыс-альбиносов Wistar были выбраны в качестве модели грызунов для экспериментов. Однородный пол был выбран, чтобы устранить любой мешающий фактор заживления костей, связанный с половыми гормонами.
Это исследование проводилось по процедуре открытой остеотомии, которая аналогична той, за которой следуют другие группы, а также другие модели мелких животных 11,18,19. Преимущество открытой остеотомии, используемой в этом методе, перед другими моделями заживления кости заключается в том, что вызванная травмой (полный перелом кортикальной кости) напоминает обычный длинный перелом кости, а заживление перелома в этом методе напоминает заживление обычного перелома, где происходит вторичное заживление кости (энхондральное окостенение) путем образования мозоли, по сравнению с повреждением кости буровым отверстием, где имеет место первичное заживление костей (внутримембранозное окостенение)20. Метод открытой остеотомии также лучше, чем закрытая остеотомия или трехточечный метод, индуцирующий давление, где существует вероятность разрушения кости и широкого неравенства в линии перелома, что приводит к разнице в заживлении перелома21. Открытая остеотомия увеличивает вероятность раневой инфекции по сравнению с закрытой остеотомией, но, как и в других исследованиях, мы наблюдали, что при надлежащих мерах предосторожности раневая инфекция была незначительной22. В этой методике также было замечено, что создание бороздки (углубления) на кости лезвием перед разрывом ее зубилом и молотком служило для создания равномерной линии перелома и избегало скольжения зубила на кости. Другая модификация, которую мы ввели в этот метод, заключалась в том, чтобы держать твердый, стерильный блок ниже кости, подлежащей перелому. Это не только обеспечило контрсилу при создании перелома, но и помогло избежать разрушения, раздавливания или неправильной линии перелома. Обычно это не вызывает каких-либо значительных травм для мышц под ними.
Наше исследование использовало рентгеновские лучи для определения временных точек жертвоприношения на основе радиологического внешнего вида мозоли в качестве первой точки времени и появления мостовой (твердой) мозоли в качестве второй временной точки у животных перед началом полного эксперимента. Вся сравнительная группа животных должна быть принесена в жертву, когда любая лечебная или контрольная группа достигает определенного момента времени, чтобы сравнить их мозоли с помощью иммуногистохимического анализа остеобластных и остеокластических маркеров. Это обеспечит объективное сравнение между различными группами лечения и контрольной группой. Рентген переломного участка крыс должен делаться с недельными интервалами, а образцы крови (хвостовая вена) должны быть взяты через 2 еженедельных интервала, пока они не достигнут соответствующих временных точек жертвоприношения. Еженедельные рентгеновские снимки были сделаны (под анестезией) для оценки образования мозоли рентгенологом (который был ослеплен к контрольной и лечебной группам). Рентген также помог обосновать и подтвердить биологические параметры заживления костей.
Этот метод включает в себя применение К-проволоки в качестве интрамедуллярной шины для удержания перелома обездвиженным в уменьшенном положении. Однако интрамедуллярная фиксация штифта не обеспечивает абсолютной стабильности перелома, как это делают гальванические и внешние фиксаторы, и иногда может быть связана с осложнениями, такими как раневая инфекция, миграция штифтов, перфорация коры бедренного вала и т. Д. Наше исследование также предполагает, что лучше вводить лигнокаин в надкостницу и вокруг нее, которая чрезвычайно чувствительна к боли. Это предотвращает сильную боль и возможность нейрогенного шока во время остеотомии. Было также отмечено, что поддержание низкого объема внутрибрюшинных инъекций помогло свести к минимуму последующий респираторный дистресс у крыс. Анальгетики и антибиотики продолжали принимать в течение 5 дней после операции, чтобы предотвратить любую боль или инфекцию. Для этого исследования бедренная кость была выбрана для индуцирования перелома, так как к ней было легко получить доступ, легко сломаться, а также из-за ее прямого контура, который легче для вставки K-проволоки. Следует соблюдать осторожность, когда К-проволока продвигается в проксимальный фрагмент бедренной кости, так как существует риск кровотечения при травмировании бедренной артерии. Было замечено, что крысы, как правило, вытаскивают K-проволоку, если слишком много остаточной проволоки остается выступающим из кожи.
Параметрами исхода заживления костей являются остеобластные и остеоклонастические маркеры в крови и мозоли животных (различных групп и разных временных точек). Для остеобластных маркеров можно выбрать остеокальцин, Col1A1, RANKL, P1NP и костно-специфическую щелочную фосфатазу, в то время как CTX и RANK могут быть оценены для оценки остеокластической активности. Некоторые из этих параметров могут быть оценены в сыворотке крови, в то время как другие могут быть оценены с помощью иммуногистохимии в ткани мозоли. Эти параметры дают целостное представление о ремоделировании костей путем одновременной оценки остеобластной и остеокластической активности.
Ограничение этого исследования заключается в том, что оно не оценивает прочность на растяжение мозоли. В идеале биомеханические исследования повышают ценность данных. Необходимо соблюдать осторожность при обработке мозоли и прилегающей костной ткани для декальцификации, так как неполная декальцинация не даст оптимальных результатов в иммуногистохимии.
Этот протокол для оценки заживления переломов с помощью модели грызунов будет полезен для всех групп, которые пытаются оценить перспективные препараты с остеоанаболической активностью. Это простая модель для точной оценки заживления костей и переломов в модели грызунов при оценке остеобластной и остеокластической активности и ремоделирования костей, которые дают полезные механистические идеи. Если ресурсы и логистика, вращающиеся вокруг количества животных, допустимы, биологические показатели также могут быть усилены рентгенологической оценкой заживления переломов, а также сравнением прочности на растяжение, которое оценивает механический рост зажившей кости. Исследования, которые выясняют механизм действия, предпочтительнее чисто наблюдательных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни у одного из авторов нет конфликта интересов или каких-либо других финансовых раскрытий.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Центральный совет по исследованиям в области гомеопатии (CCRH), Министерство AYUSH, правительство Индии, за финансирование исследований. Авторы благодарны за помощь и поддержку Центрального животного фонда, AIIMS, Нью-Дели, за их помощь и поддержку в экспериментах на животных и CMET, AIIMS, Нью-Дели, за их помощь и поддержку в фотографии и видеографии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
