Summary
Qui, presentiamo un protocollo per fratturare iatrogenicamente l'asta del femore dei ratti albini Wistar e seguire lo sviluppo del callo. Questo modello di osteotomia del femore può aiutare i ricercatori a valutare il processo di guarigione delle fratture e a studiare come un farmaco potrebbe influenzare la guarigione delle fratture.
Abstract
La guarigione delle fratture è un processo fisiologico che porta alla rigenerazione dei difetti ossei mediante l'azione coordinata di osteoblasti e osteoclasti. I farmaci osteoanabolizzanti hanno il potenziale per aumentare la riparazione delle fratture, ma hanno vincoli come costi elevati o effetti collaterali indesiderati. Il potenziale di guarigione ossea di un farmaco può inizialmente essere determinato da studi in vitro , ma sono necessari studi in vivo per la prova finale del concetto. Il nostro obiettivo era quello di sviluppare un modello di roditore osteotomia del femore che potesse aiutare i ricercatori a comprendere lo sviluppo della formazione di callo dopo la frattura dell'albero del femore e che potesse aiutare a stabilire se un potenziale farmaco ha proprietà di guarigione ossea. I ratti albini Wistar maschi adulti sono stati utilizzati dopo l'autorizzazione del Comitato etico istituzionale per gli animali. I roditori sono stati anestetizzati e, in condizioni asettiche, sono state create fratture trasversali complete al terzo centrale degli alberi dei femori utilizzando l'osteotomia aperta. Le fratture sono state ridotte e fissate internamente utilizzando fili K intramidollari e la guarigione secondaria delle fratture è stata consentita. Dopo l'intervento chirurgico, analgesici intraperitoneali e antibiotici sono stati somministrati per 5 giorni. Le radiografie settimanali sequenziali hanno valutato la formazione di callo. I ratti sono stati sacrificati sulla base di punti temporali radiologicamente predeterminati e lo sviluppo del callo della frattura è stato analizzato radiologicamente e utilizzando l'immunoistochimica.
Introduction
L'osso è un tessuto connettivo denso costituito da cellule che formano l'osso, gli osteoblasti e le cellule che riassorbono l'osso, gli osteoclasti. La guarigione delle fratture è un processo fisiologico che porta alla rigenerazione dei difetti ossei mediante l'azione coordinata di osteoblasti e osteoclasti1. Quando c'è una frattura, l'attività osteoblastica e osteoclastica nel sito della frattura sono alcuni dei fattori importanti che determinano la guarigione ossea2. Quando la guarigione delle fratture devia dal suo corso normale, si traduce in un'unione ritardata, in una malunione o in una non unione. Una frattura si dice non unione quando c'è un fallimento dell'unione della frattura per 9 mesi, senza progressione di riparazione negli ultimi 3 mesi3. Circa il 10%-15% di tutte le fratture subisce un ritardo nella riparazione che può progredire fino alla non-unione4. Il tasso di non unione per tutte le fratture è del 5% -10% e varia a seconda dell'osso coinvolto e del sito di frattura5.
L'attuale regime per il trattamento della non unione delle fratture comprende modalità chirurgiche e/o mediche. Attualmente, il ritardo o la mancata unione delle fratture può essere superato da strategie chirurgiche come l'innesto osseo. Tuttavia, l'innesto osseo ha i suoi limiti e complicazioni come la disponibilità di tessuto di innesto, il dolore del sito donatore, la morbilità e l'infezione6. Il trattamento medico comprende farmaci osteoanabolizzanti come la proteina morfogenetica ossea (BMP) e teriparatide (analogo paratormonale). Gli agenti osteoanabolizzanti attualmente utilizzati hanno il potenziale per aumentare la riparazione delle fratture, ma hanno vincoli come costi esorbitanti o effetti collaterali indesiderati7. Quindi, c'è spazio per identificare alternative economiche e non chirurgiche per la guarigione ossea. Il potenziale di guarigione ossea di un farmaco può inizialmente essere determinato da studi in vitro , ma sono necessari studi in vivo per la prova finale del concetto. Un farmaco noto per migliorare la guarigione ossea deve essere valutato in vitro e, se trovato promettente, può essere utilizzato per studi su modelli animali in vivo . Se il farmaco dimostra di promuovere la formazione e il rimodellamento osseo nel modello in vivo , potrebbe procedere alla fase successiva (cioè studi clinici).
Valutare la guarigione delle fratture negli animali è un passo avanti logico per valutare un nuovo agente introdotto per la guarigione ossea prima che venga sottoposto a prove umane. Per gli studi in vivo su modelli animali di guarigione delle fratture, i roditori sono diventatiun modello 8 sempre più popolare. I modelli di roditori hanno generato un crescente interesse a causa dei bassi costi operativi, della limitata necessità di spazio e del minor tempo necessario per la guarigione delle ossa9. Inoltre, i roditori hanno un ampio spettro di anticorpi e bersagli genici, che consentono studi sui meccanismi molecolari di guarigione e rigenerazione ossea10. Una riunione di consenso ha evidenziato in modo completo vari modelli di guarigione delle ossa di piccoli animali e si è concentrata sui diversi parametri che influenzano la guarigione ossea, oltre a sottolineare diversi modelli di fratture e impianti di piccoli animali11.
I modelli di frattura di base possono essere ampiamente suddivisi in modelli aperti o chiusi. I modelli di frattura chiusa utilizzano una forza di flessione a tre o quattro punti sull'osso e non richiedono un approccio chirurgico convenzionale. Portano a fratture oblique o a spirale, simili a fratture ossee lunghe negli esseri umani, ma la mancanza di standardizzazione della posizione e delle dimensioni della frattura può agire come fattore di confusione in loro12. I modelli di frattura aperti richiedono l'accesso chirurgico per l'osteotomia dell'osso, aiutano a raggiungere un modello di frattura più coerente nel sito di frattura, ma sono associati a una guarigione ritardata rispetto ai modelli chiusi13. La scelta dell'osso utilizzato per studiare la guarigione delle fratture rimane principalmente la tibia e il femore a causa delle loro dimensioni e accessibilità. La scelta del sito di frattura è di solito la diafisi o metafisi. La regione metafisaria è appositamente scelta nei casi in cui la guarigione delle fratture è studiata in soggetti osteoporotici, poiché la metafisi è più influenzata dall'osteoporosi14. Diversi impianti come perni intramidollari e fissatori esterni possono essere utilizzati per stabilizzare la frattura11,15.
L'obiettivo di questo studio era quello di sviluppare un modello di roditore semplice e facile da seguire che potesse aiutare i ricercatori non solo a comprendere lo sviluppo del callo dopo la frattura del femore, ma potrebbe aiutare a determinare se un potenziale farmaco ha proprietà di guarigione ossea comprendendo il meccanismo con cui agisce.
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Protocol
Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti dopo aver ottenuto l'approvazione etica dall'Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, Nuova Delhi, India (286 / IAEC-1 / 2021).
1. Procedura preoperatoria
- Ratti albini Wistar maschi di 6-8 settimane di età, del peso compreso tra 150-200 g ciascuno, in una struttura animale centrale (CAF) in gabbie individuali separate. Ciò garantisce l'assenza di lesioni chirurgiche / fratture quando più ratti condividono le gabbie.
- Mantenere i ratti ad una temperatura di 23 °C ± 2 °C in un ambiente a umidità controllata con un'umidità relativa del 50% ± del 5%, esporli a un ciclo buio/luce di 12 ore e dare accesso ad libitum al cibo (dieta semisintetica standard): dieta pellet (secca) e acqua. La composizione della dieta semi-sintetica standard è la seguente: farina di grammo del Bengala tostata (60%), farina di frumento (22%), caseina (4%), latte scremato in polvere (5%), olio raffinato (4%), miscela di sale con amido (4,8%) e miscela di colina vitaminica con amido (0,2%).
- Acclimatare i ratti per un periodo di almeno 48 ore prima dell'intervento chirurgico.
- Pesare ogni ratto su una bilancia digitale e annotare il peso.
- Somministrare iniezioni intraperitoneali (IP) di cefuroxima (100 mg/kg di peso corporeo), tramadolo (25 mg/kg di peso corporeo) e una combinazione di ketamina (75 mg/kg di peso corporeo) con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) ai ratti 15 minuti prima di iniziare la procedura chirurgica. Applicare unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'occhio secco.
- Rimuovere i peli dall'arto inferiore destro, dalla regione del fianco fino all'articolazione del ginocchio, con applicazione topica di una crema depilatoria.
NOTA: Il sangue (0,5 ml) può essere raccolto dalla vena caudale di ciascun ratto per l'analisi di base di diversi parametri. Il sangue può essere raccolto di nuovo ogni 2 settimane dopo l'intervento.
2. Procedura chirurgica per la creazione di una frattura trasversale completa attraverso osteotomia aperta
NOTA: Utilizzare una sala operatoria designata con un tavolo operatorio e una temperatura ambiente ottimale (26 °C) per eseguire la procedura.
- Posizionare il blocco di cera (vassoio in alluminio 30 cm x 30 cm x 4 cm contenente cera fino a una profondità di 2,5 cm) sul tavolo operatorio e coprirlo con teli sterili. Il blocco di cera impedisce qualsiasi cambiamento nella posizione dell'animale durante l'intervento chirurgico.
- Confermare l'inizio dell'anestesia (controllando la perdita del pizzico del dito del piede). Posizionare il ratto anestetizzato su un drappo sterile in posizione laterale sinistra. Chiedi a un assistente di tenere l'arto inferiore destro (ginocchio e anca) in estensione. Tenere un supporto duro sterile (blocco di marmo) sotto la gamba destra per sostenere il femore. Pulire il sito chirurgico con alcool e betadine.
- Iniettare l'anestesia locale (0,25 ml di lignocaina all'1%) nel sito di incisione (aspetto laterale della coscia destra), praticare un foro in un altro drappeggio sterile ed esporre solo la gamba destra del ratto attraverso di esso per un intervento chirurgico.
- Dare un'incisione cutanea verticale di 1 cm sul lato laterale della coscia destra ed estenderla secondo necessità con una lama chirurgica n. 15.
- Esporre il muscolo vasto laterale separando la fascia profonda usando le forbici Metzenbaum. Dividere il vasto laterale in linea con le fibre muscolari usando una pinza arteriosa fino a raggiungere l'asta del femore.
- Liberare l'osso dai muscoli ad esso attaccati usando l'ascensore periostale.
- Iniettare l'anestesia locale (0,2 ml di lignocaina all'1%) all'interno e intorno al periostio per prevenire il riflesso vasovagale.
- Creare una rientranza nel terzo centrale dell'asta del femore usando la lama chirurgica n. 15 e fratturare l'osso nel terzo medio dell'asta (frattura completa) posizionando uno scalpello sulla rientranza fatta (in modo che lo scalpello non scivoli) e picchiettando delicatamente lo scalpello con un martello. Utilizzare il supporto duro sterile (blocco di marmo) per sostenere l'osso mentre lo frattura per garantire una rottura pulita.
NOTA: Il supporto duro sterile di solito non causa lesioni significative ai muscoli sottostanti. - Fissare internamente la frattura utilizzando un filo K sterile (1,0 mm) tenuto con l'aiuto di un trapano elettrico a batteria. Passare il filo K nel canale midollare del frammento distale attraverso il sito di frattura. Quindi, perforare il filo K attraverso l'estremità distale del femore utilizzando il trapano elettrico a batteria.
NOTA: Disinfettare la superficie del trapano elettrico con alcool prima dell'uso. Cambiare i guanti dopo aver fissato il filo K. - Dopo aver ridotto la frattura, far avanzare il filo K dall'estremità distale nel canale del frammento prossimale fino a quando non ottiene l'acquisto nella regione trocanterica. Tagliare la parte distale del filo K che sporge attraverso la pelle usando un tagliafilo.
- Piegare la punta del filo K a circa 90° usando una pinza e utilizzare una benda di garza imbevuta di betadine per la medicazione del sito di spillo. Il filo K agisce come una stecca intramidollare per mantenere la frattura in una posizione ridotta.
- Assicurarsi un'emostasi completa prima di chiudere la pelle utilizzando una sutura di nylon 3-0. Applicare pressione sull'area sanguinante utilizzando una garza sterile o una pinza arteriosa per fermare qualsiasi sanguinamento.
- Pulire la ferita con betadine e coprirla con garza sterile e nastro adesivo a micropori.
3. Cure postoperatorie
- Riportare i ratti nelle loro gabbie, consentire la normale deambulazione e continuare a dare una dieta semi-sintetica standard fino a sacrificarli, così come antibiotici (iniezione cefuroxima 100 mg / kg) e analgesici (iniezione tramadolo 25 mg / kg / die in due dosi divise) per via intraperitoneale per 5 giorni dopo la procedura.
NOTA: I ratti possono essere suddivisi in gruppi di trattamento e di controllo per testare un particolare farmaco. Se il farmaco è solubile in acqua, può essere somministrato per via orale attraverso il gavage. Il peso dei singoli animali può essere annotato per calcolare la dose del farmaco da utilizzare. I criteri di inclusione ed esclusione possono essere seguiti per garantire l'omogeneità dei gruppi di animali. - Ospitare gli animali in gabbie individuali in condizioni simili al periodo preoperatorio. Ispezionare il sito chirurgico ogni giorno per cercare eventuali segni di dolore postoperatorio, infezione della ferita, scivolamento dei punti di sutura o qualsiasi gonfiore o disagio addominale.
- Valutare la guarigione ossea mediante radiografia del sito fratturato una volta alla settimana.
4. Procedura radiologica
- Prima della radiografia, anestetizzare i ratti con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (50 mg/kg di peso corporeo) e xilazina (5 mg/kg di peso corporeo).
- Mantenere l'articolazione dell'anca del ratto in posizione flessa e abdotta mentre l'articolazione del ginocchio viene mantenuta semiflessa per eseguire la radiografia dell'arto fratturato con le seguenti impostazioni di esposizione: Rif. kVp ≈ 62; mAS = 6.4; e impostazioni di esposizione automatica (Rif. mA=160).
NOTA: I raggi X sono stati presi al basale (1 giorno dopo l'intervento chirurgico) e poi una volta alla settimana fino al sacrificio o 5 settimane.
5. Eutanasia animale e recupero del callo
- Sacrificare i ratti con un sovradosaggio di anidride carbonica (somministrare il 100% di CO2 ad una portata di 7-8 L/min per 1 minuto, seguito da un periodo di attesa di 4-5 minuti), in due punti temporali precedentemente determinati, in base all'aspetto radiologico di calli morbidi e duri, rispettivamente.
- Incidere la pelle parallelamente al femore e separare accuratamente i muscoli sovrastanti per evitare danni al tessuto calloso.
- Frattura dell'osso tra l'articolazione dell'anca e il tessuto callo usando un martello e uno scalpello. Allo stesso modo, frattura dell'osso tra il callo e l'articolazione del ginocchio. Rimuovere il filo K e pulire il pezzo di osso in soluzione salina per rimuovere coaguli di sangue e tessuti molli.
- Trasferire immediatamente il callo in un contenitore marcato con formalina tamponata neutra al 10% (20 ml per campione) e conservarlo per 3 giorni a temperatura ambiente (RT).
6. Decalcificazione dell'osso e del tessuto callo
- Prelevare il callo dalla formalina e mantenerlo a RT in soluzione ETDA al 20%, pH 7, per la decalcificazione del tessuto osseo.
- Cambiare la soluzione di EDTA fresca ogni 2 giorni per circa 3 settimane e controllare la decalcificazione ossea colpendo l'osso con un ago senza disturbare il tessuto calloso. La decalcificazione ottimale è denotata dalla perdita della normale sensazione granulosa del tessuto osseo.
- Dopo completa decalcificazione, tagliare la sezione sagittale del callo e preparare blocchi di paraffina del tessuto calloso. Tagliare sezioni spesse 4 μm del tessuto del callo per istopatologico16 e qualsiasi altra analisi comparativa17.
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Representative Results
Questo studio è stato intrapreso per sviluppare un modello di osteotomia del femore in ratti albini Wistar. Questo modello può essere utilizzato per valutare la guarigione ossea, così come l'effetto osteogenico di un promettente farmaco osteoanabolico nella guarigione ossea. Sono state seguite le precauzioni chirurgiche e i protocolli standard. Per la procedura sono stati utilizzati camici sterili, tende e attrezzature chirurgiche (Figura 1). L'apparecchiatura (Tabella 1) è stata sterilizzata 48 ore prima dell'intervento. Anestetici, analgesici e antibiotici sono stati utilizzati secondo il protocollo per garantire che gli animali fossero mantenuti sempre privi di dolore e infezione. Il sangue (0,5 ml) può essere raccolto dalla vena caudale di ciascun ratto per l'analisi basale e il follow-up comparativo cronologico sequenziale di diversi parametri man mano che si verifica la guarigione delle fratture. I peli sono stati rimossi dalla regione del fianco alla regione del ginocchio usando la crema depilatoria (Figura 2). La procedura di osteotomia ha richiesto circa 10 minuti per essere completata (dalla prima incisione alla sutura). L'infezione e la mortalità sono state trascurabili seguendo precauzioni asettiche. Un'incisione è stata fatta dopo l'anestesia locale (lignocaina) e l'asta del femore è stata esposta dopo aver retratto le fibre del vasto laterale (Figura 3). Una rientranza (solco) è stata creata nell'osso usando una lama chirurgica per garantire che lo scalpello non scivolasse. Il supporto duro sterile (blocco di marmo) è stato utilizzato per sostenere l'osso durante la fratturazione per garantire una rottura netta (Figura 1). Una frattura trasversale completa è stata indotta nel terzo centrale dell'asta del femore usando uno scalpello e un martello (Figura 4).
La frattura è stata fissata internamente utilizzando un filo K sterile (1,0 mm). Il filo K è stato fatto passare nel canale midollare del frammento distale attraverso il sito di frattura. Il filo K è stato quindi perforato attraverso l'estremità distale del femore. La frattura è stata ridotta, e quindi il filo K è stato avanzato dall'estremità distale nel canale del frammento prossimale fino a quando non ha ottenuto l'acquisto nella regione trocanterica. La parte distale del filo K che sporgeva attraverso la pelle è stata tagliata. Il filo K ha agito come una stecca intramidollare per mantenere la frattura in una posizione ridotta (Figura 5).
Una radiografia dell'area fratturata è stata eseguita 1 giorno dopo l'intervento chirurgico e successivamente settimanalmente per valutare l'aspetto del callo (inizio della guarigione delle fratture) e l'aspetto del callo ponte (il primo punto temporale in cui il divario di frattura è stato guarito), come valutato dal radiologo (Figura 6). Due punti temporali radiologici per la valutazione comparativa della guarigione delle fratture erano l'aspetto (visualizzazione) del callo (morbido) e l'aspetto del callo ponte (duro).
Dopo il sacrificio, il femore è stato accuratamente conservato in formalina, seguito dal protocollo per la decalcificazione ossea (Figura 7). Il filo K è stato rimosso durante il sacrificio, facendo attenzione a non disturbare il callo. Dopo la completa decalcificazione, l'osso è stato tagliato in sezioni sagittali e conservato in blocchi di paraffina per il sezionamento (sezioni spesse 4 μm) come e quando richiesto. Una sezione colorata con ematossilina ed eosina del sito di frattura e del callo ha confermato la cartilagine e la formazione di nuovo osso alla fine di 5 settimane (Figura 8).
Figura 1: Strumenti chirurgici sterili tenuti sul drappo chirurgico sul tavolo operatorio. Il chirurgo è pronto per iniziare la procedura chirurgica in un ambiente sterile con strumenti sterili. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Ratto anestetizzato tenuto sul tavolo operatorio. Dopo aver somministrato l'anestesia al ratto e rimosso i peli attorno al sito di incisione, viene tenuto sul tavolo operatorio in posizione laterale sinistra, esponendo la gamba destra per l'osteotomia. Un altro drappo chirurgico viene utilizzato per far passare la gamba destra attraverso un foro in quel drappo per garantire che solo la gamba sia esposta, riducendo così al minimo le infezioni della ferita. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Procedura chirurgica: esposizione dell'asta del femore di ratto. Durante l'osteotomia, dopo che il vasto laterale è esposto, viene diviso in linea con le fibre muscolari per esporre l'asta del femore. L'osso viene liberato dai muscoli attaccati usando l'ascensore periostale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Creazione di un'osteotomia trasversale completa nel terzo centrale dell'asta del femore usando uno scalpello e un martello. Una frattura trasversale completa viene creata nel terzo centrale dell'asta del femore picchiettando delicatamente lo scalpello con il martello. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: K-wire agisce come una stecca intramidollare per mantenere la frattura in una posizione ridotta. Il filo K viene fatto passare nel canale midollare del frammento distale attraverso il sito di frattura. Il filo K viene quindi perforato attraverso l'estremità distale del femore. La frattura viene ridotta e quindi il filo K viene avanzato dall'estremità distale nel canale del frammento prossimale fino a quando non ha ottenuto l'acquisto nella regione trocanterica. Questo viene fatto usando un trapano elettrico a batteria. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Radiografia del femore del ratto con il filo K in situ . (A) Prima di indurre la frattura e (B) 1 giorno dopo l'intervento. La guarigione della frattura viene monitorata radiologicamente effettuando radiografie settimanali sequenziali del sito operato per valutare radiologicamente la formazione del callo. La frattura rimane ridotta e immobilizzata con il filo K intramidollare. I dati rappresentativi prima e dopo non provengono dallo stesso animale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Osso con callo (dopo decalcificazione ottimale) ottenuto dopo aver sacrificato l'animale in un punto temporale predeterminato. (A) Callo intatto; (B) Sezione sagittale del callo. Dopo aver sacrificato l'animale, l'area del sito di frattura viene ottenuta, preservata e decalcificata utilizzando la metodologia descritta. Il callo viene valutato in modo intermittente per garantire una decalcificazione ottimale prima di valutarlo con qualsiasi altra tecnica (scala di riferimento in centimetri). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Sezione colorata con ematossilina ed eosina del sito di frattura che mostra un callo duro con formazione di cartilagine e nuovo osso. (A) Basso ingrandimento; (B) Alto ingrandimento. Le sezioni colorate di ematossilina ed eosina del sito di frattura mostrano un callo duro con formazione di cartilagine (frecce nere) e nuovo osso (frecce gialle) (A: 40x; B: 100x). La freccia blu mostra l'estremità della frattura dell'osso e la freccia rossa mostra la seconda regione corticale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Questo metodo descrive lucidamente i dettagli necessari per sviluppare un modello di osteotomia per frattura nei ratti albini Wistar. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'effetto osteogenico di un promettente farmaco osteoanabolico nella guarigione delle fratture, nonché per comprendere la complessità della guarigione ossea. La caratteristica saliente di questo metodo è che è semplice e non richiede troppo tempo o attrezzature sofisticate. In questo metodo, i ratti albini maschi adulti Wistar sono stati selezionati come modello di roditore per gli esperimenti. Il genere uniforme è stato selezionato per rimuovere qualsiasi fattore confondente sulla guarigione ossea correlato agli ormoni sessuali.
Questo studio ha seguito la procedura di osteotomia aperta, che è simile a quella seguita da altri gruppi, così come altri piccoli modelli animali11,18,19. Il vantaggio dell'osteotomia aperta seguita in questo metodo rispetto ad altri modelli di guarigione ossea è che la lesione indotta (frattura ossea corticale completa) assomiglia a una normale frattura ossea lunga, e la guarigione della frattura in questo metodo assomiglia a quella di una frattura regolare, dove c'è una guarigione ossea secondaria (ossificazione encondrale) mediante formazione di callo, rispetto alla lesione ossea del foro di perforazione, dove c'è guarigione ossea primaria (ossificazione intramembranosa)20. Il metodo dell'osteotomia aperta è anche migliore dell'osteotomia chiusa o del metodo di induzione della pressione a tre punti, dove esiste la possibilità di frantumazione ossea e ampia disparità nella linea di frattura, portando così alla differenza nella guarigione della frattura21. L'osteotomia aperta aumenta la possibilità di infezione della ferita rispetto all'osteotomia chiusa, ma, simile ad altri studi, abbiamo osservato che con le dovute precauzioni, l'infezione della ferita era trascurabile22. È stato anche osservato in questa metodologia che creare un solco (rientranza) sull'osso con una lama prima di fratturarlo con uno scalpello e un martello serviva a creare una linea di frattura uniforme ed evitare lo scivolamento dello scalpello sull'osso. Un'altra modifica che abbiamo introdotto in questo metodo è stata quella di mantenere un blocco duro e sterile sotto l'osso da fratturare. Ciò non solo ha fornito una controforza durante la creazione della frattura, ma ha anche contribuito a evitare la frantumazione, lo schiacciamento o una linea di frattura irregolare. Questo di solito non causa alcuna lesione significativa ai muscoli sottostanti.
Il nostro studio ha utilizzato i raggi X per determinare i punti temporali del sacrificio in base all'aspetto radiologico del callo come primo punto temporale e all'aspetto del callo (duro) come secondo punto temporale negli animali prima di iniziare l'esperimento completo. L'intero gruppo comparativo di animali dovrebbe essere sacrificato quando un gruppo di trattamento o di controllo raggiunge un particolare punto temporale per confrontare i loro calli utilizzando l'analisi immunoistochimica dei marcatori osteoblastici e osteoclastici. Ciò garantirà un confronto imparziale tra i diversi gruppi di trattamento e di controllo. La radiografia del sito fratturato dei ratti deve essere eseguita a intervalli settimanali e i campioni di sangue (vena della coda) devono essere prelevati a intervalli settimanali fino a raggiungere i rispettivi punti temporali di sacrificio. Sono state eseguite radiografie settimanali (sotto anestesia) per valutare la formazione di callo da parte del radiologo (che è stato accecato ai gruppi di controllo e trattamento). I raggi X hanno anche contribuito a sostanziare e corroborare i parametri biologici della guarigione ossea.
Questo metodo prevede l'applicazione di un K-wire come stecca intramidollare per mantenere la frattura immobilizzata in una posizione ridotta. Tuttavia, la fissazione intramidollare del perno non fornisce stabilità assoluta alla frattura, così come la placcatura e i fissatori esterni, e a volte può essere associata a complicazioni come l'infezione della ferita, la migrazione del perno, la perforazione della corteccia dell'albero femorale, ecc. Il nostro studio suggerisce anche che è meglio iniettare lignocaina dentro e intorno al periostio, che è estremamente sensibile al dolore. Ciò previene il dolore severo e la possibilità di shock neurogeno durante l'osteotomia. È stato anche osservato che mantenere basso il volume delle iniezioni intraperitoneali ha contribuito a ridurre al minimo il successivo distress respiratorio nei ratti. Analgesici e antibiotici sono stati continuati per 5 giorni dopo l'intervento chirurgico per prevenire qualsiasi dolore o infezione. Per questo studio, il femore è stato scelto per indurre la frattura in quanto era di facile accesso, facile da rompere in modo pulito e per il suo contorno dritto, che è più facile per l'inserimento del filo K. Si deve prestare attenzione quando il filo K viene avanzato nel frammento prossimale del femore, poiché esiste il rischio di sanguinamento ferendo l'arteria femorale. È stato osservato che i ratti tendono a estrarre il filo K se viene lasciato troppo filo residuo che sporge dalla pelle.
I parametri del risultato della guarigione ossea sono marcatori osteoblastici e osteoclastici nel sangue e nel callo degli animali (di vari gruppi e diversi punti temporali). Per i marcatori osteoblastici, è stato possibile selezionare osteocalcina, Col1A1, RANKL, P1NP e fosfatasi alcalina specifica per l'osso, mentre CTX e RANK potrebbero essere valutati per valutare l'attività osteoclastica. Alcuni di questi parametri possono essere valutati nel siero, mentre altri possono essere valutati mediante immunoistochimica nel tessuto calloso. Questi parametri forniscono una visione olistica del rimodellamento osseo valutando contemporaneamente l'attività osteoblastica e osteoclastica.
Il limite di questo studio è che non valuta la resistenza alla trazione del callo. Idealmente, gli studi biomeccanici aggiungono valore ai dati. È necessario prestare attenzione durante la lavorazione del callo e del tessuto osseo adiacente per la decalcificazione, poiché la decalcificazione incompleta non darà risultati ottimali nell'immunoistochimica.
Questo protocollo per valutare la guarigione delle fratture utilizzando il modello di roditore sarà utile per tutti i gruppi che stanno cercando di valutare farmaci promettenti con attività osteoanabolica. Si tratta di un modello semplice per valutare con precisione la guarigione ossea e delle fratture nel modello di roditore mentre si valuta l'attività osteoblastica e osteoclastica e il rimodellamento osseo, che forniscono utili intuizioni meccanicistiche. Se le risorse e la logistica che ruotano attorno al numero di animali sono ammissibili, gli indicatori biologici possono anche essere rafforzati dalla valutazione radiologica della guarigione delle fratture, nonché dal confronto della resistenza alla trazione, che valuta la statura meccanica dell'osso guarito. Gli studi che chiariscono il meccanismo d'azione sono preferiti agli studi puramente osservazionali.
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Disclosures
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse o altre informazioni finanziarie.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Consiglio centrale per la ricerca in omeopatia (CCRH), il Ministero dell'AYUSH, il governo dell'India, per il finanziamento della ricerca. Gli autori sono grati per l'aiuto e il supporto di Central Animal Facility, AIIMS, Nuova Delhi, per il loro aiuto e supporto con gli esperimenti sugli animali e CMET, AIIMS, Nuova Delhi, per il loro aiuto e supporto nella fotografia e nella videografia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
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