Summary
Her præsenterer vi en protokol til iatrogent brud på lårbenet på Wistar albino rotter og følge op på udviklingen af callus. Denne lårbens osteotomimodel kan hjælpe forskere med at evaluere processen med brudheling og studere, hvordan et lægemiddel kan påvirke brudheling.
Abstract
Frakturheling er en fysiologisk proces, der resulterer i regenerering af knogledefekter ved koordineret virkning af osteoblaster og osteoklaster. Osteoanabolic medicin har potentiale til at øge reparationen af brud, men har begrænsninger som høje omkostninger eller uønskede bivirkninger. Knoglehelingspotentialet for et lægemiddel kan i første omgang bestemmes ved in vitro-undersøgelser, men in vivo-undersøgelser er nødvendige for det endelige proof of concept. Vores mål var at udvikle en femur osteotomi gnaver model, der kunne hjælpe forskere med at forstå udviklingen af callus dannelse efter brud på lårbenets skaft, og som kunne hjælpe med at fastslå, om et potentielt lægemiddel har knoglehelende egenskaber. Voksne Wistar albino hanrotter blev brugt efter godkendelse fra den institutionelle dyreetiske komité. Gnavere blev bedøvet, og under aseptiske forhold blev komplette tværgående brud på midten af en tredjedel af lårbensakslerne skabt ved hjælp af åben osteotomi. Frakturerne blev reduceret og internt fikseret ved hjælp af intramedullære K-ledninger, og sekundær frakturheling fik lov til at finde sted. Efter operationen blev intraperitoneale analgetika og antibiotika givet i 5 dage. Sekventielle ugentlige røntgenbilleder vurderede callusdannelse. Rotterne blev ofret baseret på radiologisk forudbestemte tidspunkter, og udviklingen af bruddet blev analyseret radiologisk og ved hjælp af immunhistokemi.
Introduction
Knogle er et tæt bindevæv bestående af knogledannende celler, osteoblasterne og knogleresorberende celler, osteoklasterne. Frakturheling er en fysiologisk proces, der resulterer i regenerering af knogledefekter ved koordineret virkning af osteoblaster og osteoklaster1. Når der er brud, er osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet på brudstedet nogle af de vigtige faktorer, der bestemmer knogleheling2. Når brudheling afviger fra sit normale forløb, resulterer det i en forsinket union, malunion eller nonunion. En brud siges at være i nonunion, når der er en manglende forening af bruddet i 9 måneder, uden progression af reparation i de sidste 3 måneder3. Ca. 10%-15% af alle brud oplever en forsinkelse i reparation, der kan udvikle sig til nonunion4. Nonunionsraten for alle brud er 5%-10% og varierer afhængigt af den involverede knogle og frakturstedet5.
Det nuværende regime til behandling af frakturer omfatter kirurgiske og/eller medicinske metoder. I øjeblikket kan forsinket eller ikke-forening af brud overvindes ved kirurgiske strategier som knogletransplantation. Knogletransplantation har imidlertid sine begrænsninger og komplikationer som tilgængelighed af transplantatvæv, smerter på donorstedet, sygelighed og infektion6. Medicinsk behandling omfatter osteoanabolic lægemidler som knoglemorfogenetisk protein (BMP) og teriparatid (parathormon analog). I øjeblikket anvendes osteoanabolic midler har potentiale til at øge reparationen af brud, men har begrænsninger som ublu omkostninger eller uønskede bivirkninger7. Derfor er der mulighed for at identificere omkostningseffektive, ikke-kirurgiske alternativer til knogleheling. Knoglehelingspotentialet for et lægemiddel kan i første omgang bestemmes ved in vitro-undersøgelser, men in vivo-undersøgelser er nødvendige for det endelige proof of concept. Et lægemiddel, der er kendt for at forbedre knogleheling, bør evalueres in vitro og, hvis det findes lovende, kan bruges til in vivo dyremodelundersøgelser. Hvis lægemidlet viser sig at fremme knogledannelse og ombygning i in vivo-modellen, kan det gå videre til næste trin (dvs. kliniske forsøg).
Vurdering af brudheling hos dyr er et logisk skridt fremad for at evaluere et nyt middel, der introduceres til knogleheling, før det gennemgår menneskelige forsøg. For in vivo dyremodelstudier af brudheling er gnavere blevet en stadig mere populær model8. Gnavermodellerne har skabt stigende interesse på grund af de lave driftsomkostninger, begrænset behov for plads og mindre tid, der er nødvendig til knogleheling9. Derudover har gnavere et bredt spektrum af antistoffer og genmål, som tillader undersøgelser af de molekylære mekanismer for knogleheling og regenerering10. Et konsensusmøde fremhævede omfattende forskellige smådyrs knoglehelingsmodeller og fokuserede på de forskellige parametre, der påvirker knogleheling, samt understregede flere små dyrebrudsmodeller og implantater11.
Grundlæggende brudmodeller kan stort set opdeles i åbne eller lukkede modeller. Lukkede brudmodeller bruger en tre- eller firepunkts bøjningskraft på knoglen og kræver ikke en konventionel kirurgisk tilgang. De fører til skrå eller spiralbrud, der ligner lange knoglebrud hos mennesker, men manglen på standardisering af brudplacering og dimensioner kan fungere som en forvirrende faktor i dem12. Åbne frakturmodeller kræver kirurgisk adgang til osteotomi af knoglen, hjælper med at opnå et mere konsistent brudmønster på brudstedet, men er forbundet med forsinket heling sammenlignet med de lukkede modeller13. Valget af knogle, der bruges til at studere brudheling, forbliver hovedsageligt skinnebenet og lårbenet på grund af deres dimensioner og tilgængelighed. Valget af brudstedet er normalt diafysen eller metafysen. Den metafysiske region er specielt udvalgt i tilfælde, hvor frakturheling studeres hos osteoporotiske forsøgspersoner, da metafysen er mere påvirket af osteoporose14. Flere implantater som intramedullære stifter og eksterne fixatorer kan bruges til at stabilisere bruddet11,15.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en enkel og let at følge gnavermodel, der kunne hjælpe forskere med ikke kun at forstå udviklingen af callus efter brud på lårbenet, men kunne hjælpe med at afgøre, om et potentielt lægemiddel har knoglehelende egenskaber ved at forstå den mekanisme, hvormed det virker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev udført efter at have taget etisk godkendelse fra Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, New Delhi, Indien (286/IAEC-1/2021).
1. Præoperativ procedure
- Hushanner Wistar albino rotter 6-8 uger, vejer mellem 150-200 g hver, på et Central Animal Facility (CAF) i separate individuelle bure. Dette sikrer, at der ikke opstår kirurgiske/brudskader, når flere rotter deler bure.
- Hold rotterne ved en temperatur på 23 °C ± 2 °C i et fugtighedskontrolleret miljø med en relativ luftfugtighed på 50 % ± 5 %, udsæt dem for en 12 timers mørk/lys cyklus, og giv ad libitum adgang til mad (standard halvsyntetisk kost): pelletdiæt (tør) og vand. Sammensætningen af standard halvsyntetisk diæt er som følger: ristet bengalsk kikærtemel (60%), hvedemel (22%), kasein (4%), skummetmælkspulver (5%), raffineret olie (4%), saltblanding med stivelse (4,8%) og vitamin cholinblanding med stivelse (0,2%).
- Akklimatisere rotterne i en periode på mindst 48 timer før operationen.
- Vej hver rotte på en digital vægt, og noter vægten.
- Intraperitoneale (IP) injektioner af cefuroxim (100 mg/kg legemsvægt), tramadol (25 mg/kg legemsvægt) og en kombination af ketamin (75 mg/kg legemsvægt) med xylazin (10 mg/kg legemsvægt) administreres til rotterne 15 minutter før den kirurgiske procedure påbegyndes. Påfør oftalmisk salve på begge øjne for at forhindre tørre øjne.
- Fjern håret fra højre underben, fra flankeområdet op til knæleddet, med topisk påføring af en hårfjerningscreme.
BEMÆRK: Blod (0,5 ml) kan opsamles fra halevenen på hver rotte til baseline-analysen af forskellige parametre. Blod kan indsamles igen hver 2. uge efter operationen.
2. Kirurgisk procedure for at skabe fuldstændig tværgående brud gennem åben osteotomi
BEMÆRK: Brug et udpeget operationsrum med operationsbord og optimal omgivelsestemperatur (26 °C) til at udføre proceduren.
- Placer voksblokken (aluminiumsbakke 30 cm x 30 cm x 4 cm indeholdende voks op til en dybde på 2,5 cm) på operationsbordet og dæk den med sterile gardiner. Voksblokken forhindrer enhver ændring i dyrets position under operationen.
- Bekræft begyndelsen af anæstesi (ved at kontrollere tab af tåspidsning). Placer den bedøvede rotte på en steril drapering i venstre lateral position. Bed en assistent om at holde højre underben (knæ og hofte) i forlængelse. Hold en steril hård støtte (marmorblok) under højre ben for at støtte lårbenet. Rengør det kirurgiske sted med alkohol og betadin.
- Injicer lokalbedøvelse (0,25 ml 1% lignocain) på snitstedet (lateralt aspekt af højre lår), skær et hul i en anden steril drapering, og udsæt kun rottens højre ben gennem det til operation.
- Giv et 1 cm lodret hudsnit på sidesiden af højre lår, og forlæng det efter behov med et kirurgisk blad nr. 15.
- Udsæt vastus lateralis muskel ved at adskille den dybe fascia ved hjælp af Metzenbaum saks. Opdel vastus lateralis på linje med muskelfibrene ved hjælp af arterietang, indtil lårbenets skaft er nået.
- Frigør knoglen fra musklerne, der er fastgjort til den ved hjælp af periosteal elevatoren.
- Injicer lokalbedøvelse (0,2 ml 1% lignocain) i og omkring periosteum for at forhindre vasovagalrefleks.
- Opret en fordybning i den midterste tredjedel af lårbenets skaft ved hjælp af operationsbladet nr. 15, og brække knoglen i den midterste tredjedel af skaftet (komplet brud) ved at placere en mejsel på den foretagne fordybning (så mejslen ikke glider) og forsigtigt banke mejslen med en hammer. Brug den sterile hårde støtte (marmorblok) til at støtte knoglen, mens du brækker den for at sikre en ren pause.
BEMÆRK: Den sterile hårde støtte forårsager normalt ikke en væsentlig skade på musklerne nedenunder. - Fastgør bruddet indvendigt ved hjælp af en steril K-ledning (1,0 mm), der holdes ved hjælp af en batteridrevet boremaskine. Før K-tråden ind i medullær kanal af det distale fragment gennem brudstedet. Bor derefter K-ledningen ud gennem lårbenets distale ende ved hjælp af den batteridrevne boremaskine.
BEMÆRK: Desinficer overfladen på boremaskinen med alkohol inden brug. Skift handsker, når K-tråden er fastgjort. - Efter at have reduceret bruddet, skal du føre K-tråden fra den distale ende ind i kanalen i det proksimale fragment, indtil det opnår køb i det trochanteriske område. Skær den distale del af K-tråden, der stikker ud gennem huden, af ved hjælp af en trådskærer.
- Bøj spidsen af K-tråden til omkring 90 ° ved hjælp af en tang, og brug en gazebandage gennemblødt i betadin til pin-site dressing. K-tråden fungerer som en intramedullær skinne til at holde bruddet i en reduceret position.
- Sørg for fuldstændig hæmostase, før du lukker huden ved hjælp af en 3-0 nylonsutur. Påfør tryk på blødningsområdet ved hjælp af sterilt gasbind eller arterietang for at stoppe blødning.
- Rens såret med betadin, og dæk det med sterilt gasbind og mikropore tape.
3. Postoperativ pleje
- Returner rotterne til deres bure, tillader normal ambulation, og fortsæt med at give en standard halvsyntetisk kost, indtil de ofres, samt antibiotika (injektion cefuroxim 100 mg / kg) og analgetika (injektion tramadol 25 mg / kg / dag i to opdelte doser) intraperitonealt i 5 dage efter proceduren.
BEMÆRK: Rotterne kan opdeles i behandlings- og kontrolgrupper for at teste et bestemt lægemiddel. Hvis lægemidlet er vandopløseligt, kan det gives oralt gennem sonde. Vægten af de enkelte dyr kan noteres for at beregne dosis af det lægemiddel, der skal anvendes. Inklusions- og udelukkelseskriterier kan følges for at sikre homogenitet i dyregrupperne. - Hus dyrene i individuelle bure under lignende forhold som den præoperative periode. Undersøg det kirurgiske sted hver dag for at se efter tegn på postoperativ smerte, sårinfektion, glidning af suturer eller hævelse i maven eller ubehag.
- Vurder knogleheling ved røntgen af det brudte sted en gang ugentligt.
4. Radiologisk fremgangsmåde
- Før røntgenstrålen bedøves rotterne med en intraperitoneal injektion af ketamin (50 mg / kg legemsvægt) og xylazin (5 mg / kg legemsvægt).
- Hold rottens hofteled i en bøjet og bortført position, mens knæleddet holdes halvbøjet for at tage røntgen af det brækkede lem med følgende eksponeringsindstillinger: Ref. kVp ≈ 62; Ref. mAS = 6,4; og automatiske eksponeringsindstillinger (Ref. mA=160).
BEMÆRK: Røntgenbilleder blev taget ved baseline (1 dag efter operationen) og derefter en gang ugentligt indtil ofring eller 5 uger.
5. Dyreaflivning og hentning af hård hud
- Ofr rotterne ved en overdosis kuldioxid (administrer 100% CO2 ved en strømningshastighed på 7-8 l / min i 1 min, efterfulgt af en ventetid på 4-5 min) på to tidligere bestemte tidspunkter baseret på det radiologiske udseende af henholdsvis bløde og hårde brofaste hård hud.
- Skær huden parallelt med lårbenet og adskil de overliggende muskler omhyggeligt for at undgå skade på callusvævet.
- Bræk knoglen mellem hofteleddet og callusvævet ved hjælp af en hammer og mejsel. På samme måde brækker knoglen mellem callus og knæleddet. Fjern K-tråden og rengør knoglestykket i saltvand for at fjerne blodpropper og blødt væv.
- Overfør straks callus til en mærket beholder med 10% neutral bufferet formalin (20 ml pr. Prøve) og opbevar den i 3 dage ved stuetemperatur (RT).
6. Afkalkning af knogle- og callusvæv
- Tag callusvævet fra formalin og hold det ved RT i 20% ETDA-opløsning, pH 7, til afkalkning af knoglevævet.
- Skift frisk EDTA-opløsning hver 2. dag i ca. 3 uger, og kontroller for knogleafkalkning ved at stikke knoglen med en nål uden at forstyrre callusvævet. Optimal afkalkning betegnes ved tabet af den normale grynede fornemmelse af knoglevævet.
- Efter fuldstændig afkalkning skæres den sagittale del af callus og forbereder paraffinblokke af callusvævet. Skær 4 μm tykke sektioner af callusvævet til histopatologisk16 og enhver anden sammenlignende analyse17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne undersøgelse blev foretaget for at udvikle en lårbens osteotomi model i Wistar albino rotter. Denne model kan bruges til at evaluere knogleheling samt den osteogene virkning af et lovende osteoanabolic lægemiddel i knogleheling. Standard kirurgiske forholdsregler og protokoller blev fulgt. Sterile kjoler, gardiner og kirurgisk udstyr blev brugt til proceduren (figur 1). Udstyret (tabel 1) blev steriliseret 48 timer før operationen. Anæstetisk, smertestillende og antibiotika blev brugt i henhold til protokollen for at sikre, at dyr blev holdt smerte- og infektionsfri til enhver tid. Blod (0,5 ml) kan opsamles fra halevenen på hver rotte til baselineanalyse og sekventiel kronologisk sammenlignende opfølgning af forskellige parametre, når brudheling forekommer. Hår blev fjernet fra flankeområdet til knæområdet ved hjælp af hårfjerningscreme (figur 2). Osteotomiproceduren tog ca. 10 minutter at gennemføre (fra det første snit til suturen). Infektion og dødelighed var ubetydelig ved at følge aseptiske forholdsregler. Et snit blev foretaget efter lokalbedøvelse (lignocain), og lårbenets skaft blev udsat efter tilbagetrækning af fibrene i vastus lateralis (figur 3). En fordybning (rille) blev skabt i knoglen ved hjælp af et kirurgisk blad for at sikre, at mejslen ikke gled. Steril hård støtte (marmorblok) blev brugt til at understøtte knoglen, mens den brækkede den for at sikre en ren pause (figur 1). En fuldstændig tværgående brud blev induceret i den midterste tredjedel af lårbenets skaft ved hjælp af en mejsel og hammer (figur 4).
Bruddet blev internt fastgjort ved hjælp af en steril K-ledning (1,0 mm). K-tråden blev ført ind i medullære kanal af det distale fragment gennem brudstedet. K-tråden blev derefter boret ud gennem lårbenets distale ende. Bruddet blev reduceret, og derefter blev K-tråden avanceret fra den distale ende ind i kanalen af det proksimale fragment, indtil det opnåede køb i det trochanteriske område. Den distale del af K-tråden, der stak ud gennem huden, blev afskåret. K-tråden fungerede som en intramedullær skinne for at holde bruddet i en reduceret position (figur 5).
Et røntgenbillede af det brækkede område blev taget 1 dag efter operationen og ugentligt derefter for at evaluere udseendet af callus (begyndelsen af brudheling) og udseendet af den brobyggende callus (det første gangspunkt, hvor brudgabet blev helet), som evalueret af radiologen (figur 6). To radiologiske tidspunkter for sammenlignende evaluering af brudheling var udseendet (visualisering) af den (bløde) callus og udseendet af den brobyggende (hårde) callus.
Efter ofring blev lårbenet omhyggeligt bevaret i formalin efterfulgt af protokollen for knogleafkalkning (figur 7). K-tråden blev fjernet under ofringen og sørgede for ikke at forstyrre callus. Efter fuldstændig afkalkning blev knoglen skåret i sagittale sektioner og konserveret i paraffinblokke til sektionering (4 μm tykke sektioner) efter behov. En hæmatoxylin-og-eosin-farvet del af brudstedet og callus bekræftede brusk og ny knogledannelse i slutningen af 5 uger (figur 8).
Figur 1: Sterile kirurgiske instrumenter, der opbevares på operationsdraperingen på operationsbordet. Kirurgen er klar til at starte den kirurgiske procedure i et sterilt miljø med sterile instrumenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Anæstesiseret rotte opbevares på operationsbordet. Efter at have givet anæstesi til rotten og fjernet håret omkring snitstedet, holdes det på operationsbordet i venstre lateral position og udsætter højre ben for osteotomi. En anden kirurgisk drapering bruges til at føre højre ben gennem et hul i den drapering for at sikre, at kun benet udsættes for og derved minimerer sårinfektioner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kirurgisk indgreb: Eksponering af rottelårbenets skaft. Under osteotomi, efter at vastus lateralis er udsat, splittes den i tråd med muskelfibrene for at udsætte lårbenets skaft. Knoglen frigøres fra de vedhæftede muskler ved hjælp af periosteal elevatoren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Oprettelse af en komplet tværgående osteotomi i den midterste tredjedel af lårbenets skaft ved hjælp af en mejsel og hammer. En komplet tværgående brud skabes i midten af en tredjedel af lårbenets skaft ved forsigtigt at banke mejslen med hammeren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: K-wire fungerer som en intramedullær skinne til at holde bruddet i en reduceret position. K-tråden føres ind i medullære kanal af det distale fragment gennem brudstedet. K-tråden bores derefter ud gennem lårbenets distale ende. Bruddet reduceres, og derefter føres K-tråden fra den distale ende ind i kanalen af det proksimale fragment, indtil det opnåede køb i det trochanteriske område. Dette gøres ved hjælp af en batteridrevet boremaskine. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Røntgen af rottens lårben med K-tråden in situ . (A) Før inducering af bruddet og (B) 1 dag efter operationen. Frakturhelingen overvåges radiologisk ved at tage sekventielle ugentlige røntgenbilleder af det opererede sted for radiologisk at vurdere callusdannelsen. Frakturen forbliver reduceret og immobiliseret med den intramedullære K-ledning. De repræsentative data før og efter er ikke fra samme dyr. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Ben med callus (efter optimal afkalkning) opnået efter ofring af dyret på et forudbestemt tidspunkt. (A) intakt callus (B) Sagittal del af callus. Efter ofring af dyret opnås området på brudstedet, bevares og afkalkes ved hjælp af den beskrevne metode. Callus vurderes intermitterende for at sikre optimal afkalkning, inden den evalueres ved hjælp af andre teknikker (referenceskala i centimeter). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Hæmatoxylin-og-eosin-farvet del af brudstedet, der viser en hård callus med dannelse af brusk og ny knogle. (A) lav forstørrelse; (B) Høj forstørrelse. De hæmatoxylin- og eosinfarvede sektioner af brudstedet viser en hård callus med dannelse af brusk (sorte pile) og ny knogle (gule pile) (A: 40x; B: 100x). Den blå pil viser knoglens brudende, og den røde pil viser den anden kortikale region. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode beskriver klart de detaljer, der er nødvendige for at udvikle en frakturostotomimodel hos Wistar albino rotter. Denne model kan bruges til at evaluere den osteogene virkning af et lovende osteoanabolic lægemiddel i frakturheling samt forstå forviklingerne ved knogleheling. Det fremtrædende træk ved denne metode er, at den er enkel og ikke har brug for for meget tid eller sofistikeret udstyr. I denne metode blev voksne mandlige Wistar albino rotter valgt som gnavermodel for forsøgene. Ensartet køn blev valgt for at fjerne enhver forvirrende faktor på knogleheling relateret til kønshormonerne.
Denne undersøgelse fulgte proceduren for åben osteotomi, som ligner den, der følges af andre grupper, samt andre smådyrsmodeller11,18,19. Fordelen ved den åbne osteotomi, der følges i denne metode i forhold til andre knoglehelingsmodeller, er, at den skadesinducerede (komplet kortikal knoglebrud) ligner en regelmæssig lang knoglebrud, og brudheling i denne metode ligner en regelmæssig brud, hvor der er sekundær knogleheling (enchondral ossifikation) ved callusdannelse sammenlignet med borehulsknogleskade, hvor der er primær knogleheling (intramembranøs ossifikation)20. Metoden med åben osteotomi er også bedre end den lukkede osteotomi eller trepunkts trykfremkaldende metode, hvor der er mulighed for knogleknusning og stor forskel i brudlinjen, hvilket fører til forskellen i brudheling21. Åben osteotomi øger chancen for sårinfektion sammenlignet med lukket osteotomi, men i lighed med andre undersøgelser observerede vi, at med passende forholdsregler var sårinfektion ubetydelig22. Det blev også observeret i denne metode, at oprettelse af en rille (fordybning) på knoglen med et blad, før det brækkes med en mejsel og hammer, tjente til at skabe en ensartet brudlinje og undgik glidning af mejslen på knoglen. En anden ændring, vi introducerede i denne metode, var at holde en hård, steril blok under knoglen, der skulle brækkes. Dette gav ikke kun en modkraft, mens bruddet blev skabt, men hjalp også med at undgå at knuse, knuse eller en uregelmæssig brudlinje. Dette forårsager normalt ingen væsentlig skade på musklerne nedenunder.
Vores undersøgelse brugte røntgenstråler til at bestemme tidspunkterne for ofring baseret på callus radiologiske udseende som det første gangpunkt og udseendet af den brobyggende (hårde) callus som det andet tidspunkt i dyrene, før det komplette eksperiment startede. Hele den sammenlignende gruppe af dyr bør ofres, når en behandlings- eller kontrolgruppe når et bestemt tidspunkt for at sammenligne deres hård hud ved hjælp af immunohistokemisk analyse af osteoblastiske og osteoklastiske markører. Dette vil sikre upartisk sammenligning mellem de forskellige behandlings- og kontrolgrupper. Røntgen af rotternes brækkede sted skal udføres med ugentlige intervaller, og blodprøver (halevene) skal tages med 2 ugentlige intervaller, indtil de når de respektive offerpunkter. Ugentlige røntgenstråler blev udført (under anæstesi) for at evaluere callusdannelse af radiologen (som blev blindet for kontrol- og behandlingsgrupperne). Røntgenbillederne hjalp også med at underbygge og bekræfte de biologiske parametre for knogleheling.
Denne metode indebærer påføring af en K-tråd som en intramedullær skinne for at holde bruddet immobiliseret i en reduceret position. Imidlertid giver intramedullær pinfiksering ikke absolut stabilitet til bruddet, ligesom plettering og eksterne fixatorer, og kan til tider være forbundet med komplikationer som sårinfektion, pinmigration, perforering af lårbenskaftets cortex osv. Vores undersøgelse tyder også på, at det er bedre at injicere lignocain i og omkring periosteum, som er ekstremt smertefølsomt. Dette forhindrer alvorlig smerte og muligheden for neurogent chok under osteotomi. Det blev også observeret, at holde mængden af intraperitoneale injektioner lav hjalp med at minimere efterfølgende åndedrætsbesvær hos rotterne. Analgetika og antibiotika blev fortsat i 5 dage efter operationen for at forhindre smerter eller infektion. Til denne undersøgelse blev lårbenet valgt til at fremkalde brud, da det var let tilgængeligt, let at bryde rent og på grund af dets lige kontur, hvilket er lettere for K-wire indsættelse. Der skal udvises forsigtighed, når K-tråden føres ind i lårbenets proksimale fragment, da der er risiko for blødning ved at skade lårbensarterien. Det blev observeret, at rotter har tendens til at trække K-tråden ud, hvis der er for meget resterende ledning, der stikker ud af huden.
Parametrene for resultatet af knogleheling er osteoblastiske og osteoklastiske markører i dyrenes blod og callus (af forskellige grupper og forskellige tidspunkter). For osteoblastiske markører kunne osteocalcin, Col1A1, RANKL, P1NP og knoglespecifik alkalisk phosphatase vælges, mens CTX og RANK kunne vurderes for at evaluere osteoklastisk aktivitet. Nogle af disse parametre kan evalueres i serum, mens andre kan evalueres ved immunhistokemi i callusvæv. Disse parametre giver et holistisk billede af knogleombygning ved samtidig at evaluere osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet.
Begrænsningen af denne undersøgelse er, at den ikke vurderer trækstyrken af callus. Ideelt set tilføjer biomekaniske undersøgelser værdi til data. Der skal udvises forsigtighed under behandling af callus og tilstødende knoglevæv til afkalkning, da ufuldstændig afkalkning ikke giver optimale resultater i immunhistokemi.
Denne protokol til vurdering af frakturheling ved hjælp af gnavermodellen vil være nyttig for alle grupper, der forsøger at evaluere lovende lægemidler med osteoanabolic aktivitet. Det er en simpel model til nøjagtigt at vurdere knogle- og brudheling i gnavermodellen, mens man evaluerer osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet og knogleombygning, som giver nyttig mekanistisk indsigt. Hvis ressourcer og logistik, der drejer sig om antallet af dyr, er tilladt, kan biologiske indikatorer også forstærkes af den radiologiske vurdering af brudheling samt sammenligning af trækstyrke, som vurderer den helbredte knogles mekaniske statur. Undersøgelser, der belyser virkningsmekanismen, foretrækkes frem for rent observationsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen af forfatterne har interessekonflikter eller andre finansielle oplysninger.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Central Council for Research in Homoeopathy (CCRH), Ministeriet for AYUSH, Indiens regering, for forskningsfinansiering. Forfatterne er taknemmelige for hjælp og støtte fra Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi, for deres hjælp og støtte med dyreforsøgene og CMET, AIIMS, New Delhi, for deres hjælp og støtte inden for fotografering og videografi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
