Summary
ここでは、Wistarアルビノラットの大腿骨のシャフトを医原性的に破壊し、カルスの発達を追跡するためのプロトコルを提示します。この大腿骨骨切り術モデルは、研究者が骨折治癒のプロセスを評価し、薬物が骨折治癒にどのように影響するかを研究するのに役立ちます。
Abstract
骨折治癒は、骨芽細胞と破骨細胞の協調作用によって骨欠損の再生をもたらす生理学的プロセスです。オステオアナボリック薬は骨折の修復を強化する可能性がありますが、高コストや望ましくない副作用などの制約があります。薬物の骨治癒の可能性は、最初はin vitro 研究によって決定することができますが、最終的な概念実証には in vivo 研究が必要です。私たちの目的は、研究者が大腿骨のシャフトの骨折後のカルス形成の発達を理解するのに役立ち、潜在的な薬物が骨治癒特性を持っているかどうかを確認するのに役立つ大腿骨骨切り術げっ歯類モデルを開発することでした。成体のオスのWistarアルビノラットは、施設動物倫理委員会の認可後に使用されました。げっ歯類は麻酔をかけ、無菌条件下では、大腿骨のシャフトの中央3分の1で完全な横骨折が開いた骨切り術を使用して作成されました。骨折は髄内Kワイヤーを使用して縮小および内部固定され、二次骨折治癒が行われました。手術後、腹腔内鎮痛薬と抗生物質を5日間投与しました。連続した毎週のX線はカルス形成を評価した。放射線学的に事前に決定された時点に基づいてラットを屠殺し、骨折カルスの発達を放射線学的および免疫組織化学を用いて分析した。
Introduction
骨は、骨形成細胞である骨芽細胞と骨吸収細胞である破骨細胞からなる密な結合組織です。骨折治癒は、骨芽細胞と破骨細胞の協調作用によって骨欠損の再生をもたらす生理学的プロセスである1。骨折がある場合、骨折部位の骨芽細胞および破骨細胞の活動は、骨治癒を決定する重要な要素のいくつかです2。骨折治癒が通常の経過から逸脱すると、結合の遅延、不和合、または非癒合が発生します。骨折は、骨折の癒合が9か月間失敗し、過去3か月間修復が進行しない場合、非癒合状態にあると言われます3。すべての骨折の約10%〜15%は、非癒合4に進行する可能性のある修復の遅延を経験します。すべての骨折の非癒合率は5%〜10%であり、関与する骨と骨折部位によって異なります5。
骨折非癒合の治療のための現在のレジメンは、外科的および/または医学的モダリティで構成されています。現在、骨折の遅延または非癒合は、骨移植などの外科的戦略によって克服することができます。ただし、骨移植には、移植組織の利用可能性、ドナー部位の痛み、罹患率、感染などの制限と合併症があります6。治療には、骨形成タンパク質(BMP)やテリパラチド(パラトホルモン類似体)などの骨同化薬が含まれます。現在使用されている骨同化剤は、骨折の修復を強化する可能性がありますが、法外なコストや望ましくない副作用などの制約があります7。したがって、骨治癒のための費用効果の高い非外科的代替案を特定する余地があります。薬物の骨治癒の可能性は、最初はin vitro 研究によって決定することができますが、最終的な概念実証には in vivo 研究が必要です。骨治癒を促進することが知られている薬物は in vitro で評価する必要があり、有望であることが判明した場合は、 in vivo 動物モデル研究に使用できます。薬物が in vivo モデルで骨形成とリモデリングを促進することが証明された場合、次の段階(すなわち、臨床試験)に進む可能性があります。
動物の骨折治癒を評価することは、ヒト試験を受ける前に骨治癒のために導入された新しい薬剤を評価するための論理的な前進です。骨折治癒の in vivo 動物モデル研究のために、げっ歯類はますます人気のあるモデル8になりました。げっ歯類モデルは、運用コストが低く、スペースの必要性が限られており、骨の治癒に必要な時間が短いため、関心が高まっています9。さらに、げっ歯類は広範囲の抗体と遺伝子標的を持っているため、骨の治癒と再生の分子メカニズムに関する研究が可能になります10。コンセンサス会議では、さまざまな小動物の骨治癒モデルを包括的に強調し、骨の治癒に影響を与えるさまざまなパラメーターに焦点を当て、いくつかの小動物の骨折モデルとインプラントを強調しました11。
基本的な破壊モデルは、開モデルと閉モデルに大きく分けることができます。閉鎖骨折モデルは、骨に3点または4点の曲げ力を使用し、従来の外科的アプローチを必要としません。それらは、ヒトの長骨骨折に似た斜めまたはらせん状の骨折を引き起こしますが、骨折の位置と寸法の標準化の欠如は、それらの交絡因子として機能する可能性があります12。開放骨折モデルは、骨の骨切り術のための外科的アクセスを必要とし、骨折部位においてより一貫した骨折パターンを達成するのを助けるが、閉鎖モデル13と比較して治癒の遅延と関連している。骨折治癒を研究するために使用される骨の選択は、それらの寸法とアクセシビリティのために、主に脛骨と大腿骨のままです。骨折部位の選択は通常、骨幹または骨幹です。骨端領域は、骨粗鬆症の影響を受けやすいため、骨粗鬆症の被験者で骨折治癒が研究されている場合に特別に選択されます14。髄内ピンや外部固定具などのいくつかのインプラントを使用して、骨折を安定させることができます11,15。
この研究の目的は、研究者が大腿骨骨折後のカルスの発達を理解するのに役立つだけでなく、潜在的な薬物が骨治癒特性を持っているかどうかを判断するのに役立つ、シンプルでわかりやすいげっ歯類モデルを開発することでしたそれが作用するメカニズムを理解することによって。
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Protocol
動物実験は、インドのニューデリーにあるAIIMSの機関動物倫理委員会(IAEC)から倫理的承認を得た後に行われました(286 / IAEC-1 / 2021)。
1.術前処置
- 6〜8週齢のオスのWistarアルビノラットを、それぞれ体重150〜200 gの中央動物施設(CAF)で別々のケージに入れます。これにより、複数のラットがケージを共有するときに外科的/骨折部位の損傷がなくなります。
- ラットを相対湿度50%±5%の湿度制御された環境で23°C±2°Cの温度に保ち、12時間の暗/明サイクルにさらし、食物(標準的な半合成食):ペレット食(乾燥)と水。標準的な半合成食の組成は以下の通りである:ローストベンガルグラム小麦粉(60%)、小麦粉(22%)、カゼイン(4%)、脱脂粉乳(5%)、精製油(4%)、デンプンとの塩混合物(4.8%)、およびデンプンを含むビタミンコリン混合物(0.2%)。
- 手術前に少なくとも48時間ラットを順応させる。
- デジタル体重計で各ラットの体重を量り、体重を記録します。
- セフロキシム(100 mg / kg体重)、トラマドール(25 mg / kg体重)、およびケタミン(75 mg / kg体重)とキシラジン(10 mg / kg体重)の組み合わせの腹腔内(IP)注射をラットに投与します 外科的処置を開始する15分前に。.眼科用軟膏を両目に塗り、ドライアイを防ぎます。
- 右下肢から、脇腹領域から膝関節まで、脱毛クリームを局所塗布して脱毛します。
注:血液(0.5 mL)は、さまざまなパラメーターのベースライン分析のために、各ラットの尾静脈から収集できます。手術後2週間ごとに再度採血することができます。
2.開腹骨切り術による完全横断骨折の外科的処置
注意: 手順を実行するには、手術台と最適な周囲温度(26°C)を備えた指定された操作室を使用してください。
- ワックスブロック(深さ2.5 cmまでのワックスを含む30 cm x 30 cm x 4 cmのアルミニウムトレイ)を手術台に置き、滅菌ドレープで覆います。ワックスブロックは、手術中の動物の位置の変化を防ぎます。
- 麻酔の開始を確認します(つま先のピンチの喪失を確認することによって)。麻酔をかけたラットを左横位置の滅菌ドレープの上に置きます。アシスタントに右下肢(膝と股関節)を伸ばすように依頼します。大腿骨を支えるために、右脚の下に滅菌済みのハードサポート(大理石のブロック)を保管してください。アルコールとベタジンで手術部位をきれいにします。
- 切開部位(右大腿部の外側)に局所麻酔(0.25mLの1%リグノカイン)を注射し、別の滅菌ドレープに穴を開け、ラットの右脚のみを手術のために露出させます。
- 右太ももの外側に1cmの垂直皮膚切開を行い、必要に応じて15番の手術用ブレードで伸ばします。
- メッツェンバウムハサミを使用して深部筋膜を分離することにより、外側広筋を露出させます。大腿骨の軸に達するまで、動脈鉗子を使用して筋線維に沿って外側広筋を分割します。
- 骨膜エレベーターを使用して、それに付着した筋肉から骨を解放します。
- 血管迷走神経反射を防ぐために、骨膜内およびその周囲に局所麻酔(0.2 mLの1%リグノカイン)を注入します。.
- 15番の手術刃で大腿骨の軸の真ん中3分の1にくぼみを作り、作ったくぼみにノミを置き(ノミが滑らないように)、ハンマーでノミを軽くたたくことで、シャフトの中央3分の1の骨を骨折します(完全骨折)。滅菌ハードサポート(大理石ブロック)を使用して、骨を骨折しながら骨を支え、きれいな破損を確保します。
注意: 滅菌ハードサポートは通常、下の筋肉に重大な損傷を引き起こしません。 - バッテリー駆動の電動ドリルを使用して保持された滅菌K線(1.0 mm)を使用して、骨折を内部で固定します。Kワイヤーを骨折部位を通って遠位断片の髄管に通します。次に、電池式の電動ドリルを使用して、大腿骨の遠位端にKワイヤーをドリルで開けます。
注意: 使用する前に、電動ドリルの表面をアルコールで消毒してください。Kワイヤーを固定した後、手袋を交換してください。 - 骨折を減少させた後、転子領域で購入が得られるまで、Kワイヤを遠位端から近位断片の管に進めます。ワイヤーカッターを使用して、皮膚から突き出ているKワイヤーの遠位部分を切り取ります。
- ペンチを使用してKワイヤーの先端を約90°に曲げ、ベタジンに浸したガーゼ包帯を使用してピンサイトドレッシングを行います。Kワイヤーは、骨折を縮小した位置に保つための髄内スプリントとして機能します。
- 3-0ナイロン縫合糸を使用して皮膚を閉じる前に、完全な止血を確認してください。滅菌ガーゼまたは動脈鉗子を使用して出血領域に圧力をかけ、出血を止めます。
- ベタジンで傷口をきれいにし、滅菌ガーゼとマイクロポア粘着テープで覆います。
3.術後ケア
- ラットをケージに戻し、通常の歩行を許可し、犠牲になるまで標準的な半合成食を与え続け、抗生物質(注射セフロキシム100 mg / kg)と鎮痛薬(注射トラマドール25 mg / kg /日を2回に分けて)手順後5日間腹腔内に投与します。.
注:ラットは、特定の薬物をテストするために治療群と対照群に分けることができます。薬物が水溶性である場合、それは経管栄養を通して経口投与することができる。個々の動物の体重は、使用される薬物の用量を計算するために留意され得る。動物群の均質性を確保するために、包含基準および除外基準に従うことができる。 - 術前と同様の条件下で動物を個々のケージに収容する。手術部位を毎日検査して、術後の痛み、創傷感染、縫合糸の滑り、または腹部の腫れや不快感の兆候を探します。
- 骨折部位のX線による骨治癒を週に一度評価します。
4.放射線処置
- X線の前に、ケタミン(50 mg / kg体重)とキシラジン(5 mg / kg体重)の腹腔内注射でラットを麻酔します。.
- ラットの股関節を屈曲および外転した位置に保ち、膝関節を半屈曲させたままにして、次の露出設定で骨折した肢のX線を撮影します:参照kVp ≈ 62;参照 mAS = 6.4;および自動露出設定(参照mA = 160)。
注:X線はベースライン時(手術後1日)に撮影され、その後、犠牲または5週間まで週に1回撮影されました。
5.動物の安楽死とカルス回収
- ソフトブリッジングカルスの放射線学的外観に基づいて、以前に決定された2つの時点で、二酸化炭素の過剰摂取(100%CO2 を7〜8 L / minの流量で1分間投与し、その後4〜5分の待機期間を投与)によってラットを犠牲にします。
- 大腿骨と平行に皮膚を切開し、カルス組織への損傷を避けるために、上にある筋肉を注意深く分離します。
- ハンマーとノミを使用して、股関節とカルス組織の間の骨を骨折します。同様に、カルスと膝関節の間の骨を骨折します。Kワイヤーを取り外し、生理食塩水で骨片をきれいにして、血栓と軟部組織を取り除きます。
- カルスを直ちに10%中性緩衝ホルマリン(サンプルあたり20 mL)を含むラベル付き容器に移し、室温(RT)で3日間保管します。
6.骨およびカルス組織の脱灰
- ホルマリンからカルス組織を採取し、骨組織の脱灰のために20%ETDA溶液、pH 7でRTに保ちます。
- 新鮮なEDTA溶液を2日ごとに約3週間交換し、カルス組織を乱さずに針で骨を突いて骨の脱灰を確認します。最適な脱灰は、骨組織の通常のざらざらした感覚の喪失によって示されます。
- 完全に脱灰した後、カルスの矢状部分を切断し、カルス組織のパラフィンブロックを調製する。病理組織16 およびその他の比較分析17のために、カルス組織の4μmの厚さの切片を切り取ります。
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Representative Results
この研究は、Wistarアルビノラットの大腿骨骨切り術モデルを開発するために行われました。このモデルは、骨治癒、および骨治癒における有望な骨同化薬の骨形成効果を評価するために使用できます。標準的な外科的予防措置とプロトコルに従った。滅菌ガウン、ドレープ、および手術器具が手順に使用されました(図1)。装置(表1)は手術の48時間前に滅菌された。麻酔薬、鎮痛薬、および抗生物質は、動物が常に痛みや感染のない状態に保たれるようにするために、プロトコルに従って使用されました。血液(0.5 mL)を各ラットの尾静脈から採取して、ベースライン分析と、骨折治癒が発生したときのさまざまなパラメーターの時系列比較フォローアップを行うことができます。脱毛クリームを用いて脇腹領域から膝領域まで毛髪を除去した(図2)。骨切り術は、完了するまでに約10分かかりました(最初の切開から縫合まで)。無菌予防策に従うと、感染と死亡率はごくわずかでした。.局所麻酔(リグノカイン)後に切開を行い、外側広筋の線維を引っ込めた後に大腿骨の軸を露出させた(図3)。ノミが滑らないように、外科用ブレードを使用して骨にくぼみ(溝)を作成しました。滅菌ハードサポート(大理石ブロック)を使用して、骨折しながら骨を支え、きれいな破損を確保しました(図1)。ノミとハンマーを使用して、大腿骨のシャフトの中央3分の1に完全な横方向の骨折が誘発されました(図4)。
骨折は滅菌K線(1.0mm)を用いて内部固定した。Kワイヤーは、骨折部位を通って遠位断片の髄管に通された。次に、Kワイヤーを大腿骨の遠位端からドリルアウトしました。骨折は減少し、次にKワイヤーは転子領域で購入が得られるまで遠位端から近位断片の運河に進められました。皮膚から突き出ていたKワイヤーの遠位部が切断された。Kワイヤーは髄内スプリントとして機能し、骨折を縮小した位置に保つことができました(図5)。
術後1日とその後毎週骨折部位のX線を撮影し、放射線科医が評価したカルスの外観(骨折治癒の開始)とブリッジングカルスの出現(骨折ギャップが治癒した最初の時点)を評価しました(図6)。骨折治癒の比較評価のための2つの放射線学的時点は、(柔らかい)カルスの出現(視覚化)とブリッジング(硬い)カルスの出現でした。
屠殺後、大腿骨をホルマリンで注意深く保存し、続いて骨脱灰のプロトコルを行いました(図7)。Kワイヤーは、カルスを乱さないように注意しながら、犠牲の間に取り外されました。完全な脱灰後、骨を矢状切片に切断し、必要に応じて切片化のためにパラフィンブロック(厚さ4μmの切片)に保存した。骨折部位とカルスのヘマトキシリンとエオジン染色された切片では、5週間の終わりに軟骨と新しい骨の形成が確認されました(図8)。
図1:手術台の手術用ドレープに保管された滅菌手術器具。 外科医は、滅菌器具を備えた無菌環境で外科手術を開始する準備ができています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:手術台に置かれた麻酔付きラット。 ラットに麻酔を与え、切開部位の周りの毛を取り除いた後、手術台上で左横位で保持し、骨切り術のために右脚を露出させる。別の外科用ドレープを使用して、右脚をそのドレープの穴に通し、脚だけが露出するようにし、それによって創傷感染を最小限に抑えます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:外科的処置:ラット大腿骨のシャフトの露出。骨切り術中、外側広筋が露出した後、筋線維に沿って分割され、大腿骨のシャフトが露出します。骨は骨膜エレベーターを使用して付着した筋肉から解放されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ノミとハンマーを使用して、大腿骨のシャフトの中央3分の1に完全な横方向の骨切り術を作成します。 ハンマーでノミを軽くたたくことにより、大腿骨のシャフトの中央3分の1に完全な横方向の骨折が作成されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:Kワイヤーは、骨折を縮小した位置に保つための髄内スプリントとして機能します。 Kワイヤーは、骨折部位を通って遠位断片の髄管に通される。次に、Kワイヤーを大腿骨の遠位端からドリルアウトします。骨折は減少し、次いでKワイヤは、転子領域で購入が得られるまで、遠位端から近位断片の管に進められる。これは、バッテリー駆動の電動ドリルを使用して行われます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:Kワイヤーをその場で使用したラットの大腿骨のX線。 (A)骨折を誘発する前、および(B)手術の1日後。骨折の治癒は、カルス形成を放射線学的に評価するために手術部位の連続した毎週のX線を撮影することによって放射線学的に監視されます。骨折は縮小されたままであり、髄内Kワイヤーで固定されています。なお、前後の代表データは同一動物由来ではない。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図7:事前に決定された時点で動物を犠牲にした後に得られたカルスを有する骨(最適な脱灰後)。 (a)無傷のカルス;(B)カルスの矢状部分。動物を犠牲にした後、骨折部位の面積が得られ、保存され、記載された方法論を使用して脱灰される。カルスは、他の技術(センチメートル単位の基準スケール)で評価する前に、最適な脱灰を確実にするために断続的に評価されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図8:骨折部位のヘマトキシリンおよびエオジン染色された切片は、軟骨および新しい骨の形成を伴う硬いカルスを示す。 (a)低倍率;(B)高倍率。骨折部位のヘマトキシリンおよびエオジン染色された切片は、軟骨(黒い矢印)と新しい骨(黄色の矢印)の形成を伴う硬いカルスを示しています(A:40x;B: 100倍)。青い矢印は骨の骨折端を示し、赤い矢印は2番目の皮質領域を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この方法は、Wistarアルビノラットの骨折骨切りモデルを開発するために必要な詳細を明確に説明しています。このモデルは、骨折治癒における有望な骨同化薬の骨形成効果を評価し、骨治癒の複雑さを理解するために使用できます。この方法の顕著な特徴は、それが単純であり、あまり多くの時間や洗練された機器を必要としないことです。この方法では、成体の雄のWistarアルビノラットを実験のげっ歯類モデルとして選択した。性ホルモンに関連する骨治癒の交絡因子を除去するために、均一な性別が選択されました。
この研究は、他のグループや他の小動物モデルと同様に、開腹骨切り術の手順に従いました11、18、19。この方法で行われる開腹骨切り術が他の骨治癒モデルよりも優れている点は、損傷誘発性(完全皮質骨骨折)が通常の長骨骨折に似ていることであり、この方法の骨折治癒は、ドリル穴の骨損傷と比較して、カルス形成による二次骨治癒(軟骨骨化)がある通常の骨折の治癒に似ています。 一次骨治癒(膜内骨化)があるところ20。開放骨切り術の方法は、骨が粉砕し、骨折線に大きな格差が生じる可能性がある閉鎖骨切り術または3点圧力誘発法よりも優れているため、骨折治癒の違いにつながります21。開腹骨切り術は閉鎖骨切り術と比較して創傷感染の可能性を高めますが、他の研究と同様に、適切な予防策を講じれば、創傷感染はごくわずかであることがわかりました22。また、この方法論では、ノミとハンマーで破砕する前に、刃で骨に溝(くぼみ)を作成することが、均一な破断線を作成し、骨の上でノミが滑るのを防ぐのに役立つことも観察されました。この方法で導入した別の変更は、骨折する骨の下に硬くて無菌のブロックを保つことでした。これは、フラクチャーを作成する際の反力を提供するだけでなく、粉砕、押しつぶし、または不規則なフラクチャーラインを回避するのにも役立ちました。これは通常、下の筋肉に重大な損傷を引き起こすことはありません。
私たちの研究では、X線を使用して、完全な実験を開始する前に、最初の時点としてのカルスの放射線学的外観と、2番目の時点としてのブリッジング(ハード)カルスの出現に基づいて犠牲の時点を決定しました。治療群または対照群が特定の時点に達したときに、骨芽細胞および破骨細胞マーカーの免疫組織化学的分析を使用してカルスを比較するために、動物の比較グループ全体を犠牲にする必要があります。これにより、異なる治療群と対照群間の公平な比較が保証されます。ラットの骨折部位のX線は毎週の間隔で行い、血液サンプル(尾静脈)は、それぞれの犠牲の時点に達するまで2週間間隔で採取する必要があります。毎週のX線撮影(麻酔下で)は、放射線科医(対照群と治療群を盲検化された)によるカルス形成を評価するために行われました。X線はまた、骨治癒の生物学的パラメータを実証し、裏付けるのに役立ちました。
この方法では、骨折を縮小した位置に固定したままにするための髄内スプリントとしてKワイヤーを適用します。ただし、髄内ピン固定は、メッキや外部固定具のように骨折に絶対的な安定性を提供するわけではなく、創傷感染、ピンの移動、大腿骨シャフト皮質の穿孔などの合併症に関連する場合があります。私たちの研究はまた、非常に痛みに敏感な骨膜の中とその周辺にリグノカインを注射する方が良いことを示唆しています。これにより、骨切り術中の激しい痛みや神経原性ショックの可能性が防止されます。腹腔内注射の量を低く抑えることは、ラットのその後の呼吸困難を最小限に抑えるのに役立つことも観察されました。.鎮痛薬と抗生物質は、痛みや感染を防ぐために手術後5日間継続されました。本研究では,大腿骨はアクセスしやすく,きれいに折れやすく,輪郭がまっすぐでK線の挿入が容易であることから,骨折を誘発するために選択しました。Kワイヤーを大腿骨の近位断片に進める場合は、大腿動脈を傷つけて出血する恐れがあるため注意が必要です。ラットは、皮膚から突き出た残留ワイヤーが多すぎると、Kワイヤーを引き抜く傾向があることが観察されました。
骨治癒の結果のパラメータは、動物の血液およびカルス(さまざまなグループおよびさまざまな時点の)の骨芽細胞および破骨細胞マーカーです。骨芽細胞マーカーについては、オステオカルシン、Col1A1、RANKL、P1NP、および骨特異的アルカリホスファターゼを選択し、CTXおよびRANKを評価して破骨細胞活性を評価することができました。これらのパラメータのいくつかは血清中で評価することができ、他のものはカルス組織における免疫組織化学によって評価することができる。これらのパラメータは、骨芽細胞と破骨細胞の活動を同時に評価することにより、骨リモデリングの全体像を提供します。
この研究の限界は、カルスの引張強度を評価しないことです。理想的には、生体力学的研究はデータに付加価値をもたらします。不完全な脱灰は免疫組織化学において最適な結果をもたらさないため、脱灰のためにカルスおよび隣接する骨組織を処理する際には注意が必要です。
げっ歯類モデルを使用して骨折治癒を評価するこのプロトコルは、骨同化活性を有する有望な薬物を評価しようとしているすべてのグループに役立ちます。これは、骨芽細胞および破骨細胞の活動と骨リモデリングを評価しながら、げっ歯類モデルにおける骨と骨折の治癒を正確に評価するための簡単なモデルであり、有用なメカニズムの洞察を提供します。動物の数を中心に展開する資源と物流が許容される場合、生物学的指標は、骨折治癒の放射線学的評価、および治癒した骨の機械的身長を評価する引張強度の比較によっても強化できます。作用機序を解明する研究は、純粋に観察的な研究よりも好まれます。
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Disclosures
いずれの著者も、利益相反またはその他の財務開示を行っていません。
Acknowledgments
著者らは、研究資金を提供してくれたAYUSH省のホメオパシー研究中央評議会(CCRH)に感謝したい。著者らは、ニューデリーのAIIMSの中央動物施設の支援と支援、およびニューデリーのAIIMSのCMETの写真とビデオ撮影の支援と支援に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
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