Summary
在这里，我们提出了由血管紧张素II输注诱导的高血压小鼠肾交感神经去神经支配（RDN）的方案。该程序可重复，方便，并允许研究RDN对高血压和心脏肥大的调节机制。
Abstract
近年来，肾交感神经去神经支配（RDN）对血压的益处已在大量临床试验中得到证实。然而，RDN对高血压的调节机制仍然难以捉摸。因此，在小鼠中建立更简单的RDN模型至关重要。在这项研究中，将充满血管紧张素II的渗透迷你泵植入14周龄的C57BL / 6小鼠中。植入微型渗透泵一周后，使用苯酚对小鼠的双侧肾动脉进行改良的RDN程序。给予年龄性别匹配的小鼠盐水并作为假组。在基线时测量血压，随后每周测量血压，持续21天。然后，收集肾动脉，腹主动脉和心脏，使用H&E和Masson染色进行组织学检查。在这项研究中，我们提出了一种简单、实用、可重复和标准化的RDN模型，可以控制高血压，缓解心脏肥大。该技术可以去神经支配周围肾交感神经，而不会造成肾动脉损伤。与以前的模型相比，改进的RDN有助于研究高血压的病理生物学和病理生理学。
Introduction
高血压是全世界主要的慢性心血管疾病。不受控制的高血压可能会损害靶器官并导致心力衰竭、中风和慢性肾脏疾病1，2，3。1991年至2007年间，中国的高血压患病率从20%上升到31%。在最近修订高血压诊断标准（130/80 mmHg）4后，中国成人高血压患者人数可能会翻一番。高血压可以通过药物控制，然而，大约20%的患者无法控制他们的高血压，即使以最大耐受剂量接受至少三种抗高血压药物（包括一种利尿剂），这可能导致耐药性高血压的发展5。
肾交感神经去神经支配（RDN）已被证明是高血压的潜在治疗方法。2009年，Krum及其同事首次报告了使用RDN进行难治性高血压治疗。结果发现经皮肾动脉消融术可有效引起患者持续性血压降低6.然而，Symplicity Hypertension 3 （HTN-3） 试验的失败阻碍了 RDN 7 的应用，使 RDN成为一种有争议的疗法。然而，RDN的前景尚未被排除。最近的临床试验，包括RADIANCE-HTN SOLO，SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED和SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal已经证实了RDN对高血压8，9，10，11，12的疗效。因此，需要进行更详细的机理研究来探索RDN的影响。
本研究的总体目的是证明如何修改小鼠中的RDN以产生更简单，更稳定的手术。大量的实验研究了RDN的各种方法，如血管内冷冻消融，体外超声和化学或神经毒素在不同动物模型中的局部应用13，14，15，16，17。使用苯酚化学消融生成的RDN模型是研究交感神经激活对高血压发病机制的成熟实验模型。该模型是通过使用棉签10%苯酚/乙醇溶液对肾交感神经进行化学腐蚀而产生的18。一方面，常规RDN潜在地抑制肾交感神经活性，从而减少肾素分泌和钠重吸收，并增加肾血流量。另一方面，它抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统19。因此，RDN对高血压有有益的作用。然而，化学消融生成的RDN模型缺乏消融标准和消融时间，实验过程的细节尚不清楚。此外，没有可用的技术报告。在本报告中，我们描述了一种使用称重纸在血管紧张素II（Ang II）诱导的C57BL / 6小鼠高血压中用苯酚生成RDN模型的手术方案。我们用含有苯酚的称量纸包裹肾动脉并统一消融时间，这有助于建立更可重复、更可靠的 RDN 模型。该实验模型旨在评估RDN对高血压的影响。
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Protocol
所有动物实验程序均符合实验动物护理和使用的相关伦理指南（NIH出版物编号85-23，2011年修订），并得到复旦大学附属华东医院动物研究委员会的批准。将14周龄雄性C57BL/6小鼠（28-30g）随机分为4组：假鼠组、假+Ang II组、RDN组、RDN+Ang II组，每组n = 6。所有动物均在24±1°C的温度受控室中在特定封闭的无病原体条件下饲养，光照/黑暗循环12小时，并随意获得标准啮齿动物食物和水。
1. 操作场的准备
- 用70%乙醇消毒操作台。将加热垫温度调节至37°C。
- 确保所有手术器械在手术前在121°C下灭菌30分钟或通过其他方法。该手术需要微型手术剪刀、两个细直钳、两个细弯曲镊子、止血钳、无菌纱布和称重纸。
2.血管紧张素II.诱导的高血压
- 在麻醉诱导前不久向C57BL / 6小鼠提供美洛昔康（0.5mg / kg，SC）。然后，如前所述使用戊巴比妥钠注射液麻醉小鼠20，21。如果愿意，也可以使用异氟醚。用负脚趾捏反射确认麻醉深度。
- 用剃须刀去除背部的头发。在眼睛上涂抹兽医软膏以防止麻醉时干燥。
- 将动物放在背部位置的手术台上。用聚维酮碘擦拭并擦拭剃光区域，然后用 70% 乙醇擦拭三片。
- 使用垂直于尾巴的无菌手术刀刀片在前腿肩胛骨的耳朵后面做一个 1 厘米的切口。
- 使用无菌止血器在皮下建立皮下隧道并为泵22创建一个口袋。将充满血管紧张素 II （1，000 ng/kg/min） 的渗透泵轻轻插入口袋。确保有足够的自由空间缝合伤口，而不会拉伸皮肤。
- 用中断的6-0 Vicryl缝合线缝合肌肉，并用中断的4-0尼龙缝合线闭合皮肤。用聚维酮碘擦拭并擦拭伤口部位。对对照组使用等体积的盐水进行相同的手术。
- 将所有手术器械放入灭菌器中10秒，并在手术之间更换无菌手套。监测所有小鼠，直到完全恢复。
- 在第一周内每天至少两次密切监测和观察小鼠的伤口愈合情况，随后每天一次，包括发红，肿胀和感染。如果小鼠在Ang II输注期间死亡，请立即进行解剖。
- 在基线和每周用有意识的小鼠的尾袖体积描记法23 输注Ang II后测量血压。确保血压测量实验在22±2°C的安静区域进行，在实验开始前将小鼠适应1小时。在基线血压测量之前习惯小鼠至少连续5天23，24。
3.双侧肾去神经支配
- 选择血压（BP）升高≥140 / 90mmHg或收缩压/舒张压升高25%的小鼠，输注Ang II后1周。
- 术前记录动物体重，并选择最小体重为24g的动物进行肾去神经支配手术。
- 使用戊巴比妥钠麻醉小鼠。用负脚趾捏反射确认麻醉深度。
- 用剃须刀去除腹部的毛发。仔细彻底地执行此过程，以避免任何手术污染。
- 将小鼠放在手术台上，保持腹部向上并用胶带固定其四肢。用聚维酮碘消毒腹部皮肤，然后用70%乙醇擦拭三片。
- 使用手术刀刀片做一个 2 cm 的腹侧中线腹部切口。用浸泡在37°C盐水中的纱布拉回肠道，露出左肾动脉。使用弯曲的镊子仔细而直截了当地将脂肪从肾动脉中解剖出来。（图 1A-C）。
- 用无菌锋利的剪刀将称重纸切成与肾动脉大小相同的矩形。作为参考，将称量纸切成 与图1C虚线所示相同的尺寸。
注意：这是手术的关键部分，尝试一次切几张称重纸以保持相同的形状。 - 将称量纸浸入10%苯酚/乙醇溶液中至少30秒。覆盖左肾动脉表面并用称重纸包裹血管，保持2分钟（图1D）。使用纱布保护周围组织，避免称量纸接触周围的肾脏和肠道。
注意：苯酚溶液在塑料管中稳定，但在玻璃小瓶中不稳定。因此，必须为每个实验18新鲜制备溶液。 - 对右肾动脉执行相同的程序。用浸入盐水中的称量纸进行假手术。
- 将肌肉重新定位到其初始位置，并在中断缝合中用6-0 Vicryl缝合线关闭腹膜。然后，用中断的4-0尼龙缝合线闭合皮肤。监测所有小鼠，直到完全恢复。
4. 术后护理
- 将聚维酮碘涂抹在切口上，并将动物放在加热的电热毯中以进行恢复和术后监测。
- 每天监测小鼠两次，以评估发红，肿胀，疼痛或腹部感染。在RDN手术前约1小时和之后约24小时向所有小鼠提供美洛昔康（0.5mg / kg，SC）。
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Representative Results
统计学
所有数据均表示为平均值±标准偏差。单因素方差分析用于具有三个或更多条件的实验，然后进行Bonferroni事后检验以比较各个组。将等于或小于 0.05 的 p 值视为显著性。使用商业软件进行所有统计分析。
RDN后，Ang II引起的血压升高减弱
在输注Ang II后1周观察到收缩压（SBP）显着升高。与Sham + Ang II组相比，RDN + Ang II组在RDN手术后21天显示SBP显着降低（143.50±5.43 vs 196.67±14.26 mmHg，p < 0.01）。在RDN后2周，假组和RDN组之间没有差异（113.33±9.35 vs 113.17±8.47 mmHg，p > 0.05）（图2）。
确认RDN和肾动脉损伤
输注Ang II21天后，用腹腔注射戊巴比妥钠（250mg / kg）对动物实施安乐死。收集心脏和肾脏。进行H&E染色以检测肾神经和肾动脉的损伤。结果显示，各组肾血管内膜层无明显增厚（图3A-D）。肾神经的H&E染色显示RDN引起的大量肾小核，消化室和肿胀的神经核（图3E-H）。神经束的免疫组织化学显示，RDN组和RDN + Ang II组酪氨酸羟化酶（TH，1：500稀释度）的表达显着降低（图4）。RDN降低正常血压组和高血压组的肾皮质去甲肾上腺素含量（假手术组vs RDN组，18.60 ± vs 180.76 ± 11.47 ng/g，p < 0.01;图5）。
RDN治疗减轻Ang II输注诱导的病理性心脏肥大
马萨森染色显示这些组中腹主动脉内膜介质无显著增加。RDN治疗改善了Ang II输注诱导的心脏肥大，表现为间质纤维化（7.45%±0.28 vs 4.53%±0.32，p < 0.01）和心肌细胞大小（348.39 ± 31.56 vs 322.21 ± 22.26 μm，p = 0.37; 图6）。
图1：使用称重纸进行RDN的过程 。 （A，B）来自C57BL / 6（离体）小鼠的肾动脉解剖图像。（C）两条虚线内的部分是指称重纸覆盖的区域。（D）用浸入10%苯酚/乙醇溶液中的适当称量纸覆盖双侧肾动脉表面。不要覆盖虚线以外的滤纸。* 表示称量纸。 请点击此处查看此图的大图。
图2：RDN缓解Ang II输注引起的高血压。 基线时和Ang II输注后每周采用尾袖体积描记法测量血压。* 表示统计显著性（p < 0.05），** 表示统计显著性（p < 0.01）。值表示为平均值±标准误差;每组N = 6;RDN + Ang II组表明在C57BL / 6小鼠输注Ang II后1周进行肾去神经支配。缩写：SBP = 收缩压。 请点击此处查看此图的大图。
图3：肾交感神经和肾动脉的代表性图像。 （A-D）四组未见肾动脉内膜层增厚。RDN后受损肾神经的代表性图像。（E-H）RDN和RDN + Ang II组均观察到神经内组织的碎裂和凹凸核，消化，肿胀。请点击此处查看此图的大图。
图4：肾交感神经中酪氨酸羟化酶的免疫染色 。 （A）在假手术小鼠中观察到对TH抗体染色的强烈阳性反应，而在RDN手术小鼠中观察到较弱的反应。比例尺= 50μm。 （B）肾神经中TH表达的定量。** 表示统计学显著性（p < 0.01），ns表示不显著。值是平均值±标准误差;每组N = 6;RDN + Ang II组表明在C57BL / 6小鼠输注Ang II后1周进行肾去神经支配。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：ELISA 分析的肾皮质组织去甲肾上腺素水平。 去神经支配肾肾中肾皮质去甲肾上腺素含量明显降低。** 表示统计学显著性（p < 0.01），ns表示不显著。值是平均值±标准误差;每组N = 6;RDN+Ang II 组提示在 C57BL/6 中输注 Ang II 后 1 周进行肾去神经支配。 请点击此处查看此图的大图。
图6：RDN缓解Ang II诱导的病理性心脏肥大 。 （A）腹主动脉的代表性图片。在这些组中未观察到腹主动脉内膜层增厚（Masson染色）。（乙，丙）不同组中心肌的代表性图像（H&E，Masson染色）。（D）左心室区域纤维化百分比的量化和纤维化区域百分比（每只小鼠视野数）的分析。比例尺 = 50 μm. N = 6 每组;RDN + Ang II 表示在 C57BL/6 中输注 Ang II 后 1 周进行肾去神经支配。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
自症状性HTN-3试验7，25的阴性结果发表以来，RDN是否可以降低血压一直存在争议。然而，几项临床试验和动物实验已经证明了RDN对高血压人和动物的积极有效结果9，10，11，12，13，14，15，16，17。苯酚用于破坏动物的肾神经，消融的细节在以前的研究中仍然未知，例如消融面积和消融时间，这可能导致不同的结果16。
RDN的常规方法，例如在大鼠中使用含苯酚的棉签，基于导管的消融和猪的立体定向放疗，对肾神经造成损害18，26，27，28。这些方法也不适合重达几十克的老鼠，更容易导致死亡。此外，这些方法会导致肾动脉狭窄。事实上，我们准备了RDN模型，并在我们的预实验中使用这些方法。然而，40/50小鼠死亡。使用棉签和苯酚的方法导致高死亡率。
因此，在这项研究中，建立了一种能够实现RDN标准化性能但需要较少手术技能和缩短手术时间的方法。我们用10%苯酚/乙醇溶液浸泡的称量纸，在肾动脉上放置2分钟，为腐蚀小鼠肾交感神经提供了一种可靠的方法。其有效性由肾神经的组织病理学证实。它显著减弱了Ang II诱导的SBP升高。此外，它还缓解了Ang II引起的心脏肥大。此外，与传统程序相比，改进的程序具有几个特征，包括易于执行和提高成功率和存活率。
该方案最关键的部分是装有苯酚的称量纸不应接触周围组织，否则可能会导致致命的肠梗阻、腹部感染和肾动脉狭窄。建议不要接触肾脏溶液，因为只有少量的苯酚就可能导致肾交感神经过度活跃18。此外，切割称纸时应特别注意。最好用手术剪刀在显微镜下剪裁它。我们不建议用微镊子隔离肾神经，因为这可能会损害肾血管。通常，即使性能缓慢，该过程也可以在20分钟内安全执行。此外，苯酚的熔点为40.5°C。
改进的RDN程序的主要局限性是术后随访时间仅为2周。长期RDN对血压和肾神经再生的影响尚不清楚。
该模型的未来应用是产生更标准化的去神经支配动物模型，有助于阐明高血压和心脏肥大过程的途径。
总之，这种方法是实用且可重复的。最重要的是，它可以生成标准化的RDN模型来研究控制高血压和对抗心脏肥大等心血管疾病的机制。
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Disclosures
不存在提交人所宣称的财务或其他利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了国家自然科学基金（81770420）、上海市科学技术委员会（20140900600）、上海市老年临床医学重点实验室（13dz2260700）、上海市临床重点专科（shslczdzk02801）和复旦大学附属华东医院老年冠状动脉疾病中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sangon Biotech | CAS:4474-91-3 | To make a hypertensive animol model |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Abcam | ab137869 | To evaluate the expression of TH of renal nerves |
| Blood Pressure Analysis | Visitech Systems | BP-2000 | Measure the blood pressure of mice |
| Mini-osmotic pump | DURECT Corporation | CA 95014 | To fill with Angiotensin II |
| Norepinephrine ELISA Kit | Abcam | ab287789 | to measure renal norepinephrine levels |
| Phenol | Sangon Biotech | CAS:108-95-2 | Damage the renal sympathetic nerve |
| Weighing paper | Sangon Biotech | F512112 | To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. |
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