Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la denervación simpática renal (RDN) en ratones con hipertensión inducida por infusión de angiotensina II. El procedimiento es repetible, conveniente y permite estudiar los mecanismos reguladores de RDN sobre hipertensión e hipertrofia cardíaca.
Abstract
Los beneficios de la denervación simpática renal (RDN) sobre la presión arterial se han demostrado en un gran número de ensayos clínicos en los últimos años. Sin embargo, el mecanismo regulador de RDN en la hipertensión sigue siendo difícil de alcanzar. Por lo tanto, es esencial establecer un modelo RDN más simple en ratones. En este estudio, se implantaron mini bombas osmóticas llenas de angiotensina II en ratones C57BL / 6 de 14 semanas de edad. Una semana después de la implantación de la mini bomba osmótica, se realizó un procedimiento RDN modificado en las arterias renales bilaterales de los ratones utilizando fenol. A los ratones de la misma edad se les dio solución salina y se les sirvió como grupo simulado. La presión arterial se midió al inicio del estudio y cada semana posteriormente durante 21 días. Luego, se recolectaron la arteria renal, la aorta abdominal y el corazón para el examen histológico utilizando tinción de H&E y Masson. En este estudio, presentamos un modelo de RDN simple, práctico, repetible y estandarizado, que puede controlar la hipertensión y aliviar la hipertrofia cardíaca. La técnica puede denervar los nervios simpáticos renales periféricos sin daño a la arteria renal. En comparación con los modelos anteriores, el RDN modificado facilita el estudio de la patobiología y la fisiopatología de la hipertensión.
Introduction
La hipertensión es una enfermedad cardiovascular crónica importante en todo el mundo. La hipertensión no controlada podría dañar los órganos diana y contribuir a la insuficiencia cardíaca, accidente cerebrovascular y enfermedades renales crónicas 1,2,3. La prevalencia de la hipertensión ha aumentado del 20% al 31% entre 1991 y 2007 en China. El número de adultos con hipertensión en China podría duplicarse tras una reciente revisión de los criterios diagnósticos para la hipertensión (130/80 mmHg)4. La hipertensión puede ser controlada por medicamentos, sin embargo, aproximadamente el 20% de los pacientes son incapaces de controlar su hipertensión, incluso cuando reciben al menos tres fármacos antihipertensivos (incluyendo un diurético) a la dosis máxima tolerada, lo que puede conducir al desarrollo de hipertensión resistente a los medicamentos5.
Se ha demostrado que la denervación simpática renal (RDN) es un tratamiento potencial para la hipertensión. En 2009, Krum y sus colegas informaron sobre el tratamiento de la hipertensión resistente utilizando RDN por primera vez. Se encontró que la ablación percutánea de la arteria renal puede causar efectivamente la reducción persistente de la presión arterial en los pacientes6. Sin embargo, el fracaso del ensayo Symplicity Hypertension 3 (HTN-3) impidió la aplicación de RDN7, convirtiendo RDN en una terapia controvertida. Sin embargo, la perspectiva de RDN aún no se ha descartado. Ensayos clínicos recientes, incluyendo RADIANCE-HTN SOLO, SPYRAL HTN-OFF MED/ON MED y SPYRAL HTN-OFF MED Pivotal han confirmado la eficacia de RDN en la hipertensión 8,9,10,11,12. Por lo tanto, es necesario realizar una investigación mecanicista más detallada para explorar los efectos de la RDN.
El propósito general de este estudio es demostrar cómo se puede modificar la RDN en ratones para producir una cirugía más simple y estable. Un gran número de experimentos han estudiado diversos enfoques de RDN, como la crioablación intravascular, la ecografía extracorpórea y la aplicación local de una sustancia química o neurotoxina en diferentes modelos animales 13,14,15,16,17. El modelo RDN generado mediante ablación química con fenol es un modelo experimental bien establecido para estudiar la patogénesis de la activación simpática en la hipertensión. Este modelo se genera por corrosión química de los nervios simpáticos renales con solución de fenol / etanol al 10% utilizando un hisopo de algodón18. Por un lado, la RDN convencional inhibe potencialmente la actividad simpática renal, que luego disminuye la secreción de renina y la reabsorción de sodio, y aumenta el flujo sanguíneo renal. Por otro lado, suprime el sistema renina-angiotensina-aldosterona19. Por lo tanto, RDN tiene un efecto beneficioso sobre la hipertensión. Sin embargo, el modelo RDN generado por ablación química carece de criterios de ablación y tiempo de ablación y los detalles del procedimiento experimental aún no están claros. Además, no hay informes técnicos disponibles. En este informe, describimos un protocolo quirúrgico para la generación del modelo RDN con fenol utilizando papel de pesaje en hipertensión inducida por angiotensina II (Ang II) en ratones C57BL / 6. Envolvemos la arteria renal con papel de pesaje que contiene fenol y unificamos el tiempo de ablación, lo que ayuda a establecer un modelo RDN más reproducible y confiable. Este modelo experimental tiene como objetivo evaluar el efecto de la RDN sobre la hipertensión.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales con animales cumplieron con la Guía ética relevante para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Publicación de los NIH no. 85-23, revisada en 2011) y fueron aprobados por los comités de investigación animal del Hospital Huadong afiliados a la Universidad de Fudan. Los ratones machos C57BL / 6 de catorce semanas de edad (28-30 g) se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: grupo simulado, grupo Sham + Ang II, grupo RDN, grupo RDN + Ang II, n = 6 en cada grupo. Todos los animales se mantuvieron en condiciones específicas de ausencia de patógenos cerrados en una habitación con temperatura controlada a 24 ± 1 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y libre acceso a comida estándar para roedores y agua ad libitum.
1. Preparación del campo de operación
- Desinfecte la mesa de operaciones con etanol al 70%. Ajuste la temperatura de la almohadilla térmica a 37 °C.
- Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan antes de la cirugía a 121 °C durante 30 minutos o por otros métodos. Este procedimiento requiere tijeras microquirúrgicas, dos pinzas rectas finas, dos pinzas curvas finas, pinzas hemostáticas, gasas estériles y papeles de pesaje.
2. Hipertensión inducida por angiotensina II
- Proporcionar meloxicam (0,5 mg/kg, SC) a los ratones C57BL/6 poco antes de la inducción de la anestesia. Luego, anestesiar a los ratones usando la inyección de pentobarbital de sodio como se describió anteriormente20,21. También se puede usar isoflurano, si se prefiere. Confirme la profundidad de la anestesia con un reflejo negativo de pellizco en el dedo del pie.
- Retire el vello de la espalda con una afeitadora. Aplique ungüento veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Coloque al animal en una mesa de operaciones en posición dorsal. Frota y limpia el área afeitada con povidona yodada seguida de tres toallitas con etanol al 70%.
- Haga una incisión de 1 cm con una hoja de bisturí estéril, perpendicular a la cola, detrás de la oreja sobre el omóplato de la pierna delantera.
- Use un hemostático estéril para hacer un túnel subcutáneo debajo de la piel y cree un bolsillo para la bomba22. Inserte suavemente una bomba osmótica llena de angiotensina II (1,000 ng / kg / min) en el bolsillo. Asegúrese de que haya suficiente espacio libre para suturar la herida sin estirar la piel.
- Suturar el músculo con suturas 6-0 Vicryl interrumpidas y cerrar la piel con suturas de nylon 4-0 interrumpidas. Frota y limpia el sitio de la herida con povidona yodada. Realizar la misma cirugía con igual volumen de solución salina para el grupo control.
- Coloque todos los instrumentos quirúrgicos en un esterilizador durante 10 s y reemplace los guantes estériles entre cirugías. Controle a todos los ratones hasta que estén completamente recuperados.
- Monitoree de cerca y observe la cicatrización de heridas en ratones al menos dos veces al día durante la primera semana y una vez al día posteriormente, incluyendo enrojecimiento, hinchazón e infección. Realice la disección inmediatamente si los ratones mueren durante la infusión de Ang II.
- Mida la presión arterial al inicio y cada semana después de la infusión de Ang II con el método de pletismografía23 del manguito de la cola en ratones conscientes. Asegúrese de que los experimentos de medición de la presión arterial se realicen en un área tranquila, a 22 ± 2 ° C, donde los ratones se aclimaten durante 1 h antes de que comience el experimento. Habituar ratones durante al menos 5 días consecutivos antes de las mediciones basales de la presión arterial23,24.
3. Denervación renal bilateral
- Seleccione los ratones con presión arterial elevada (PA) ≥140/90mmHg o aumento del 25% en la PA sistólica / PA diastólica, 1 semana después de la infusión de Ang II.
- Registre el peso del animal antes de la cirugía y elija animales con un peso mínimo de 24 g para la cirugía de denervación renal.
- Anestesiar a los ratones usando pentobarbital de sodio. Confirme la profundidad de la anestesia con un reflejo negativo de pellizco en el dedo del pie.
- Retire el vello del abdomen con una afeitadora. Realice este procedimiento con cuidado y minuciosamente para evitar cualquier contaminación quirúrgica.
- Coloque los ratones en la mesa de operaciones, manteniendo el abdomen en alto y fije sus extremidades con cinta adhesiva. Desinfecte la piel abdominal con povidona yodada seguida de tres toallitas con etanol al 70%.
- Haga una incisión abdominal ventral de 2 cm en la línea media con una cuchilla de bisturí. Tirar hacia atrás del intestino con una gasa empapada en solución salina a 37 °C para exponer la arteria renal izquierda. Diseccionar cuidadosamente pero sin rodeos la grasa lejos de la arteria renal usando pinzas curvas. (Figura 1A-C).
- Corte el papel de pesaje en un rectángulo del mismo tamaño que la arteria renal con tijeras afiladas estériles. Como referencia, corte el papel de pesaje en el mismo tamaño que se muestra en la línea punteada de la figura 1C.
NOTA: Es una parte crítica de la cirugía, trate de cortar varios trozos del papel de pesaje a la vez para mantener la misma forma. - Sumerja el papel de pesaje en una solución de fenol/etanol al 10% durante al menos 30 s. Cubra la superficie de la arteria renal izquierda y envuelva el vaso con el papel de pesaje, manténgalo durante 2 minutos (Figura 1D). Use una gasa para proteger los tejidos circundantes para evitar que el papel de pesaje toque el riñón y el intestino circundantes.
NOTA: La solución de fenol es estable en tubos de plástico, pero no en viales de vidrio. Por lo tanto, la solución debe estar recién preparada para cada experimento18. - Realice el mismo procedimiento para la arteria renal derecha. Realizar la cirugía simulada con papel pesaje sumergido en solución salina.
- Reposicione los músculos en su posición inicial y cierre el peritoneo con suturas 6-0 Vicryl en una sutura interrumpida. Luego, cierre la piel con suturas de nylon 4-0 interrumpidas. Controle a todos los ratones hasta que estén completamente recuperados.
4. Cuidados postoperatorios
- Aplique povidona yodada a la incisión y coloque al animal en una manta eléctrica caliente para la recuperación y el monitoreo postoperatorio.
- Controle a los ratones dos veces al día para evaluar si hay enrojecimiento, hinchazón y dolor o infección abdominal. Proporcionar meloxicam (0,5 mg/kg, SC) a todos los ratones aproximadamente 1 h antes y 24 h después del procedimiento RDN.
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Representative Results
Estadística
Todos los datos se expresan como media ± desviación estándar. Se utilizó ANOVA unidireccional para experimentos con tres o más condiciones seguidas de pruebas posthoc de Bonferroni para comparaciones entre grupos individuales. Considere un valor p igual o menor que 0.05 como significativo. Se utilizó un software comercial para realizar todos los análisis estadísticos.
El aumento de la presión arterial inducido por Ang II se atenuó después de RDN
Se observó un aumento significativo de la PA sistólica (PAS) a 1 semana después de la infusión de Ang II. El grupo RDN + Ang II mostró una reducción significativa de la PAS en comparación con el grupo Sham + Ang II a los 21 días después del procedimiento RDN (143,50 ± 5,43 vs 196,67 ± 14,26 mmHg, p < 0,01). No hubo diferencia entre el grupo Sham y el grupo RDN (113,33 ± 9,35 vs 113,17 ± 8,47 mmHg, p > 0,05) a las 2 semanas después de RDN (Figura 2).
Confirmación de RDN y daño de la arteria renal
Después de 21 días de infusión de Ang II, los animales fueron sacrificados con inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (250 mg / kg). Se recogieron corazón y riñón. Se realizó tinción H&E para detectar el daño al nervio renal y las arterias renales. Los resultados mostraron que no hubo engrosamiento obvio de la capa íntima vascular renal en cada grupo (Figura 3A-D). La tinción H&E de los nervios renales mostró un gran número de núcleos picnóticos, cámaras de digestión e hinchazón de los núcleos nerviosos causados por RDN (Figura 3E-H). La inmunohistoquímica de los haces nerviosos reveló que la expresión de tirosina hidroxilasa (TH, dilución 1:500) disminuyó significativamente en el grupo RDN y RDN+Ang II (Figura 4). RDN redujo el contenido de norepinefrina cortical renal tanto en el grupo normotenso como en el hipertenso (grupo simulado vs grupo RDN, 18,60 ± 6,91 vs 180,76 ± 11,47 ng/g, p < 0,01; Figura 5).
El tratamiento con RDN mitigó la hipertrofia cardíaca patológica inducida por infusión de Ang II
La tinción de Masson no mostró un aumento notable en la íntima media de la aorta abdominal entre estos grupos. La hipertrofia cardíaca inducida por infusión de Ang II mejoró con el tratamiento con RDN, como lo demuestra la disminución de la fibrosis intersticial (7,45% ± 0,28 vs 4,53% ± 0,32, p < 0,01) y el tamaño de los cardiomiocitos (348,39 ± 31,56 vs 322,21 ± 22,26 μm, p = 0,37; Figura 6).
Figura 1: Procedimiento de RDN con papel de pesaje. (A,B) Imágenes anatómicas de la arteria renal de ratones C57BL/6 (ex vivo). (C) La parte dentro de las dos líneas punteadas se refiere al área cubierta por el papel de pesaje. (D) Cubrir la superficie de la arteria renal bilateral con el papel de pesaje apropiado sumergido en una solución de fenol / etanol al 10%. No cubra el papel de filtro más allá de la línea punteada. * indica el papel de pesaje. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: RDN alivia la hipertensión inducida por la infusión de Ang II. La presión arterial se midió mediante el método de pletismografía del manguito de la cola al inicio del estudio y cada semana después de la infusión de Ang II. * indica significación estadística (p < 0,05), ** indica significación estadística (p < 0,01). Los valores se representan como media ± error estándar; N = 6 en cada grupo; El grupo RDN + Ang II indica denervación renal operada 1 semana después de la infusión de Ang II en ratones C57BL/6. Abreviaturas: PAS = presión arterial sistólica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes representativas del nervio simpático renal y la arteria renal. (A-D) No se observó engrosamiento de la capa íntima de la arteria renal en los cuatro grupos. Imágenes representativas de los nervios renales dañados después de RDN. (E-H) Se observaron núcleos fragmentados y picnóticos, digestión, hinchazón del tejido endoneural tanto en el grupo RDN como en el grupo RDN + Ang II. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Inmunotinción de tirosina hidroxilasa en nervio simpático renal . (A) Se observó una fuerte reacción positiva a la tinción de anticuerpos TH en ratones operados con simulacro, mientras que se observó una reacción más débil en ratones operados con RDN. Barra de escala = 50 μm. (B) Cuantificación de la expresión de TH en nervios renales. ** indica significación estadística (p < 0,01), ns indica no significativa. Los valores son medios ± error estándar; N = 6 en cada grupo; El grupo RDN + Ang II indica denervación renal operada 1 semana después de la infusión de Ang II en ratones C57BL/6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Niveles de norepinefrina en el tejido cortical renal analizados por ELISA. El contenido de norepinefrina cortical renal en los riñones denervados disminuyó notablemente en comparación con los del riñón inervado. ** indica significación estadística (p < 0,01), ns indica no significativa. Los valores son medios ± error estándar; N = 6 en cada grupo; El grupo RDN+Ang II indica denervación renal operada 1 semana después de la infusión de Ang II en C57BL/6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: RDN alivia la hipertrofia cardíaca patológica inducida por Ang II . (A) Imágenes representativas de la aorta abdominal. No se observó engrosamiento de la capa íntima de la aorta abdominal en estos grupos (tinción de Masson). (B,C) Imágenes representativas del miocardio en diferentes grupos (H&E, tinción de Masson). (D) Cuantificación del porcentaje de fibrosis en el área ventricular izquierda y el análisis del porcentaje de área de fibrosis (el número de campos visuales por ratones). Barra de escala = 50 μm. N = 6 en cada grupo; RDN + Ang II indica denervación renal operada 1 semana después de la infusión de Ang II en C57BL/6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Si la RDN podría disminuir la presión arterial se ha vuelto controvertida desde la publicación del resultado negativo del ensayo de simplicidad HTN-3 7,25. Sin embargo, los diversos ensayos clínicos y experimentos con animales han demostrado resultados positivos y efectivos de RDN en humanos y animales hipertensos 9,10,11,12,13,14,15,16,17. El fenol se utiliza para la destrucción del nervio renal en animales, y los detalles de la ablación siguen siendo desconocidos en investigaciones previas, como el área de ablación y el tiempo de ablación, lo que podría haber contribuido a resultados diferentes16.
Los métodos convencionales para RDN, como el uso de hisopo de algodón con fenol en ratas, ablación basada en catéter y radioterapia estereotáctica en cerdos, causan daño al nervio renal 18,26,27,28. Estos métodos tampoco son adecuados para ratones, que pesan solo decenas de gramos, y tienen más probabilidades de provocar la muerte. Además, estos métodos causan estenosis de la arteria renal. De hecho, preparamos modelos RDN y utilizamos estos métodos en nuestro pre-experimento. Sin embargo, 40/50 ratones murieron. El método que utilizó hisopo de algodón con fenol resultó en una alta mortalidad.
Así, en este estudio, se estableció un método que permite el desempeño estandarizado de RDN, pero requiere menos habilidad quirúrgica y menor tiempo de operación. Utilizamos papel de pesaje empapado en solución de fenol / etanol al 10%, colocado durante 2 minutos en la arteria renal, que proporciona un método confiable para corroer el nervio simpático renal en ratones. Su eficacia se confirma por histopatología del nervio renal. Atenuó significativamente la elevación de la PAS inducida por Ang II. Además, también alivió la hipertrofia cardíaca inducida por Ang II. Además, el procedimiento mejorado tiene varias características, incluida la facilidad de realizar y una mayor tasa de éxito y tasas de supervivencia en comparación con los procedimientos convencionales.
La parte más crítica del protocolo es que el papel de pesaje con fenol no debe tocar los tejidos circundantes, de lo contrario, puede causar obstrucción intestinal fatal, infección abdominal y estenosis de la arteria renal. Se aconseja no tocar la solución en el riñón ya que sólo una pequeña cantidad de fenol puede causar hiperactividad simpática renal18. Además, se debe prestar especial atención al cortar el papel de pesaje. Es mejor adaptarlo bajo el microscopio con tijeras quirúrgicas. No recomendamos aislar los nervios renales con micropinzas, ya que esto puede dañar los vasos sanguíneos renales. Por lo general, el procedimiento se puede realizar de forma segura dentro de los 20 minutos, incluso con un rendimiento lento. Además, el punto de fusión del fenol es de 40,5 °C.
La principal limitación del procedimiento RDN mejorado es que el tiempo de seguimiento postoperatorio fue de solo 2 semanas. El efecto de la RDR a largo plazo sobre la PA y la regeneración del nervio renal no está claro.
La aplicación futura de este modelo es producir modelos animales de denervación más estandarizados que puedan contribuir a exponer las vías que subyacen al proceso de hipertensión e hipertrofia cardíaca.
En conclusión, este método es práctico y repetible. Lo más importante es que puede generar modelos estandarizados de RDN para estudiar los mecanismos que controlan la hipertensión y combaten enfermedades cardiovasculares como la hipertrofia cardíaca.
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Disclosures
No hay conflictos de intereses, financieros o de otro tipo, según lo declarado por los autores.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81770420), la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghai (20140900600), el Laboratorio Clave de Medicina Geriátrica Clínica de Shanghai (13dz2260700), la Especialidad Clínica Municipal Clave de Shanghai (shslczdzk02801) y el Centro de Enfermedad Arterial Coronaria Geriátrica, Hospital Huadong Afiliado a la Universidad de Fudan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sangon Biotech | CAS:4474-91-3 | To make a hypertensive animol model |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Abcam | ab137869 | To evaluate the expression of TH of renal nerves |
| Blood Pressure Analysis | Visitech Systems | BP-2000 | Measure the blood pressure of mice |
| Mini-osmotic pump | DURECT Corporation | CA 95014 | To fill with Angiotensin II |
| Norepinephrine ELISA Kit | Abcam | ab287789 | to measure renal norepinephrine levels |
| Phenol | Sangon Biotech | CAS:108-95-2 | Damage the renal sympathetic nerve |
| Weighing paper | Sangon Biotech | F512112 | To destroy renal nerve with weighing paper immersed with phenol; https://www.sangon.com/productDetail?productInfo.code=F512112. |
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