Summary
נוירונים Nociceptor ותאי NK אינטראקציה פעילה בהקשר דלקתי. גישה של תרבות משותפת מאפשרת ללמוד את יחסי הגומלין האלה.
Abstract
נוירונים סומטוסנסוריים התפתחו כדי לזהות גירויים רעילים ולהפעיל רפלקסים הגנתיים. על ידי שיתוף אמצעי תקשורת, נוירונים nociceptor גם לכוון את הגנות המארח על ידי שליטה על הפעילות של המערכת החיסונית. התקשורת בין מערכות אלה היא בעיקר אדפטיבית, עוזר להגן על הומאוסטזיס, זה יכול גם להוביל, או לקדם, את הופעת מחלות כרוניות. שתי המערכות התפתחו יחד כדי לאפשר אינטראקציה מקומית כזו, כפי שנמצאת ברקמות לימפה ראשוניות ומשניות וברירית. מחקרים אחרונים הראו כי nociceptors מזהים ומגיבים ישירות לאנטיגנים זרים, ציטוקינים שמקורם בתאי מערכת החיסון ומיקרובים.
הפעלת Nociceptor לא רק גורמת לרגישות יתר לכאב וגירוד, אלא מורידה את סף ירי הנוציצפטור, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים. הפפטידים המיוצרים על ידי, ומשוחררים, הטרמינלים ההיקפיים של nociceptors יכול לחסום את chemotaxis ואת הקיטוב של לימפוציטים, שליטה על לוקליזציה, משך, וסוג של דלקת. עדויות עדכניות מראות כי נוירונים תחושתיים מתקשרים עם תאי חיסון מולדים באמצעות מגע בין תאים, לדוגמה, תוך הפעלת קולטני דו-ממד מקבוצה (NKG2D) על תאי הרג טבעי (NK).
בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor, ניתן להעלות על הדעת כי nociceptors להשתמש נוירופפטידים כדי לשלוט על הפעילות של תאי NK. כאן, אנו מפתחים שיטת תרבית משותפת כדי לחקור אינטראקציות נוירון-NK של nociceptor בצלחת. באמצעות גישה זו, מצאנו כי נוירונים של nociceptor מותני מפחיתים את ביטוי הציטוקינים של תאי NK. באופן כללי, שיטה רדוקציוניסטית כזו יכולה להיות שימושית כדי לחקור כיצד נוירונים מעוררי גידול שולטים בתפקוד האנטי-סרטני של תאי NK, וכיצד תאי NK שולטים בחיסול תאי עצב פצועים.
Introduction
גופי התאים של נוירונים חושיים מקורם בגרעיני השורש הגבי (DRG). ה- DRG ממוקמים במערכת העצבים ההיקפית (PNS), בין הקרן הגבית של חוט השדרה לבין קצות העצבים ההיקפיים. האופי הפסאודו-חד קוטבי של נוירוני DRG מאפשר העברת מידע מהענף ההיקפי, אשר innervates את רקמת המטרה, אל הענף המרכזי, אשר נושא את המידע הסומטוסנסורי אל חוט השדרה1. באמצעות קולטני תעלות יונים מיוחדים, נוירונים מסדר ראשון חשים איומים הנשקפים מפתוגנים, אלרגנים ומזהמים2, מה שמוביל לזרם הקטיונים (Na+, Ca2+) וליצירת פוטנציאל פעולה 3,4,5.
תאי עצב אלה גם שולחים פוטנציאל פעולה אנטי-דרומי לכיוון הפריפריה, שם התרחשה חישת הסכנה הראשונית, מה שמוביל לשחרור מקומי של נוירופפטידים 1,4. לכן, נוירונים nociceptor לשמש מנגנון הגנה, התראה המארח על סכנה סביבתית 4,5,6,7.
כדי לתקשר עם נוירונים מסדר שני, הנוציצפטורים משחררים מוליכים עצביים שונים (למשל, גלוטמט) ונוירופפטידים (למשל, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP), חומר P (SP) ופפטיד מעיים vasoactive (VIP))6,7. פפטידים אלה פועלים על נימים ומקדמים אקסטרווזיה של פלזמה, בצקת, ואת הזרימה והמודולציה המקומית של תאי מערכת החיסון 2,4,7.
המערכת הסומטוסנסורית ומערכת החיסון משתמשות במערכת תקשורת משותפת המורכבת מציטוקינים ונוירופפטידים, והקולטנים הקוגנטיים שלהם4. בעוד שתקשורת דו-כיוונית זו מסייעת בהגנה מפני סכנה ובשימור הומאוסטזיס, היא יכולה גם לתרום לפתופיזיולוגיה של מחלות4.
תאי NK מסווגים כתאי לימפה מולדים והם מתמחים בחיסול תאים נגועים ויראליים. תפקוד תאי NK נשלט על ידי איזון של קולטנים מגרים ומעכבים, כולל הקולטן המפעיל NKG2D8. הליגנד האנדוגני של NKG2D, חומצה רטינואית מוקדמת1 (RAE1), מתבטא בתאים העוברים עקה כגון גידולים וזיהום 8,9.
מחקרים אחרונים הראו כי פגיעה עצבית היקפית מניעה נוירונים תחושתיים לבטא מולקולות לא מסתגלות כגון stathmin 2 (STMN2) ו- RAE1. כך, באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הופעלו על ידי אינטראקציה עם נוירונים המבטאים RAE1. בתורו, תאי NK היו מסוגלים לחסל נוירונים nociceptor פצוע קהה רגישות יתר כאב קשורה בדרך כלל עם פגיעה עצבית10. בנוסף לציר NKG2D-RAE1, תאי NK מבטאים את הקולטנים הקוגנטיים עבור מתווכים שונים המיוצרים על ידי nociceptor. לכן ייתכן שהמתווכים האלה מווסתים את פעילות תאי ה-NK. מאמר זה מציג שיטת תרבית משותפת כדי לחקור את הביולוגיה של האינטראקציה בין תאי הנוירון-NK של nociceptor. גישה זו תסייע לקדם את ההבנה כיצד נוירונים של nociceptor מווסתים תגובות של תאי חיסון מולדים לפציעה, זיהום או ממאירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מונטריאול (#22053, #22054) אישרו את כל ההליכים לבעלי חיים. ראה טבלה 1 לקבלת רשימה של פתרונות והרכבם וטבלת החומרים לקבלת רשימה של חומרים, ציוד וריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. בידוד תאי NK, תרבית וגירוי
- צור נוירון nociceptor שלם (שליטה littermate; TRPV1 wt::D TA fl/wt) ועכברים אבלטים (TRPV1 cre::D TA fl/wt) על ידי חציית עכברי רעלן לוקס-סטופ-לוקס-דיפתריה (DTA fl/fl) עם עכברי TRPV1 cre/wt.
- באמצעות שאיפת CO2, הרדימו עכבר תמים (TRPV1 wt::D TAfl/wt).
- אסוף את הטחול בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של תמיסת מלח סטרילית עם אגירת פוספט (PBS).
- הומוגניזציה של הטחול באמצעות מזיק.
- לדלל את התאים עם 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- מסננים את התערובת דרך מסננת תאים בקוטר 50 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל.
- טען את עוצמת הקול (10 מ"ל) עם PBS סטרילי.
- לאסוף 10 μL ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- צנטריפוגה של התאים (500 × גרם, 5 דקות) ולהסיר את supernatant.
- השהה את התאים בריכוז של 108 תאים למ"ל בתוספת RPMI 1640 בינונית.
- עקוב אחר הוראות היצרן לטיהור מגנטי של תאי NK בטחול באמצעות ערכת בידוד תאי NK של עכבר. אשר את טוהר תאי NK באמצעות ציטומטריה של זרימה11.
- לאסוף 10 μL ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- צנטריפוגה של התאים (500 × גרם, 5 דקות) ולהסיר את supernatant.
- יש להשעות את תאי ה-NK בתרבית RPMI 1640 בתוספת (המכילה IL-2 ו-IL-15).
- תרבית 2 × 106 תאי NK / מ"ל בצלחת תחתית U 96 היטב במשך 48 שעות.
2. בידוד ותרבית נוירונים DRG
- ב-24 שעות לפני סיום גירוי תאי ה-NK (שלב 1.15), צפו צלחת של 96 באר עם 100 μL/באר של למינין (1 ng/mL) ודגרו במשך 45 דקות (37 °C).
- לאחר הדגירה, הסר את התמיסה ואפשר לבארות להתייבש באוויר בארון בטיחות ביולוגית.
- באמצעות שאיפת CO2, להרדים נוירון nociceptor שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1cre::D TAfl/wt).
הערה: שאיפת CO2 עדיפה על פריקת צוואר הרחם מכיוון שהיא מונעת הפרעה לעצבי עמוד השדרה המחוברים ל- DRG. - הצמידו את העכבר על הלוח במצב נוטה, הרימו את העור וחתכו את העור לאורך העמוד הגבי. עיין ב- Perner et al. לסרטון מפורט12.
- חותכים את המפרק המותני ומפרידים את העצה מעמוד השדרה המותני באמצעות מספריים.
- הפרד את עמוד השדרה על ידי חיתוך השרירים והצלעות משני צידי עמוד השדרה בכיוון הגולגולת עד להגעה לבסיס הגולגולת.
- באמצעות מספריים, לחתוך את עמוד השדרה במפרק atlanto-occipital.
- הסר שריר ורקמת שומן מעמוד השדרה.
- הצמד ופתח את עמוד השדרה כדי להסיר את חוט השדרה ולקבל גישה ל- DRG. חפשו את ה-DRG בפורמינה הבין-חולייתית המחוברת לחוט השדרה דרך השורש הגבי אך מופרדת מקרום המוח.
- קצור את ה-DRGs לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל מלא ב-10 מ"ל של תוסף DMEM קר כקרח.
- צנטריפוגה את ההכנה (200 × גרם, 5 דקות, טמפרטורת החדר) ולהסיר את supernatant.
- יש להוסיף 250 μL של PBS המכיל קולגןאז IV (1 מ"ג/מ"ל) ו-Dispase II (2.4 U/mL).
- דגירה של DRG עם תמיסת קולגן IV/Dispase II (C/D) (80 דקות, 37 מעלות צלזיוס, תסיסה קלה). בעת איגום גרעינים ממספר עכברים, יש לשמור על יחס של 125 μL של תמיסת C/D לכל גנגליון.
- כדי להשבית את האנזימים, יש להוסיף 5 מ"ל של תוסף DMEM בינוני.
- צנטריפוגה את התמיסה (200 × גרם, 5 דקות) ולהסיר בעדינות את supernatant באמצעות פיפטה.
- כדי למנוע אובדן תאים לא רצוי, השאירו ~ 100 μL של הסופר-נטנט.
- יש להוסיף 1 מ"ל של תוסף DMEM בינוני.
- באמצעות אקדח פיפטה ושלושה פיפטות פסטר זכוכית בגדלים הולכים ופוחתים, טריטוראט בעדינות (~ 10 למעלה / למטה לכל גודל פיפטה פסטר) את ה- DRG להכנת תא יחיד.
- בארון בטיחות ביולוגית, יש לדלל אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-PBS סטרילי לריכוז סופי של 15%. אחסן 1 מ"ל aliquots ב -20 °C.
- צור גרדיאנט BSA בצינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי הוספת 2 מ"ל של PBS סטרילי וחלוקה איטית של 1 מ"ל של 15% תמיסת BSA בתחתית הצינור. הימנע מהפרעה לשיפוע על ידי הסרה עדינה של הפיפטה.
- באמצעות פיפטה P200, לאט לאט פיפטה את תרחיף הגרעינים המשולשים (המכיל את הנוירונים) על צד הצינור לתוך השיפוע.
- צנטריפוגה של שיפוע BSA המכיל נוירון (200 × גרם, 12 דקות, טמפרטורת החדר). הגדר את ההאצה וההאטה של הצנטריפוגה למהירות המינימלית.
הערה: לאחר צנטריפוגה, הנוירונים יהיו בתחתית הצינור בעוד שפסולת התאים תילכד בשיפוע BSA. - יש להסיר בעדינות את כל הסופרנטנט באמצעות פיפטה.
- השהה את התאים ב-500 μL של Neurobasal.
- צלחת 104 נוירונים לכל באר (200 μL של נוירובסל/באר) בצלחת 96 באר מצופה למינין, בעלת תחתית שטוחה.
הערה: בממוצע, חוקר יוכל למלא ~ 8 בארות לכל עכבר. - תרבית את הנוירונים (37 מעלות צלזיוס, לילה) כדי לאפשר התקשרות.
3. תרבות משותפת וציטומטריה של זרימה
- לאט לאט להסיר את neurobasal מתרבית נוירון.
- לאחר גירוי של 48 שעות עם IL-2 ו-IL-15 (ראה שלבים 1.14-1.15), יש להשעות את תאי ה-NK ולהוסיף 10 תאי NK5 /באר לתרבית הנוירונים (צלחת תחתונה שטוחה 96 היטב).
הערה: בממוצע, החוקר יוכל למלא ~ 6 בארות לכל עכבר. - תרבית משותפת של התאים בתוספת MX נוירובסאלי (37 °C, 48 שעות).
- לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
- השליכו את הסופרנאטנט והכתימו את התאים ב-Viability Dye eFlour-780 (1:1,000, 15 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
- לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
- חסום אתרים לא ספציפיים בתאים באמצעות CD16/32 (1:100, 15 דקות, 4 °C).
- לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 °C).
- כתם (15 דקות, 4 מעלות צלזיוס) התאים עם BV421 anti-NK-1.1 (1:100), פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) אנטי-NKp46 (1:100), ופיקואריתרין (PE) אנטי-GM-CSF (1:100).
- לאסוף את התאים, לשטוף עם PBS (3x), צנטריפוגה (500 × גרם, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס).
- יש להשליך את הסופר-נטנט, לתלות מחדש את התאים במאגר FACS (500 μL) ואת האימונופנוטיפ של תאי ה-NK על ידי ציטומטריה של זרימה11. ראו איור 1A עבור אסטרטגיית ה-gating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי NK טוהרו באופן מגנטי מבקרת פסולת (TRPV1 wt::D TAfl/wt) של עכברים ספלנוציטים ועוררו (48 שעות) עם IL-2 ו-IL-15. לאחר מכן תאי ה-NK גודלו בתרבית בלבד או בתרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מנוירון נוסיצפטור שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1cre::D TAfl/wt). לאחר מכן נחשפו התאים לקפסאיצין אגוניסט TRPV1 (1 μM) או לרכבו. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, תאי ה-NK טוהרו באמצעות FACS ורמות ההפעלה שלהם היו אימונופנוטיפיות באמצעות ציטומטריה של זרימה (איור 1A).
בתרבית בלבד, תאי NK ביטאו את הרמות הבסיסיות של GM-CSF ו-NKp46. כאשר תרבית יחד עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברי nociceptor שלמים (TRPV1 wt::D TAfl/wt), גירוי קפסאיצין הפחית את הביטוי של תאי NK של GM-CSF. לקפסאיצין לא הייתה השפעה על הפעלת תאי NK כאשר הוא תרבית יחד עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברי nociceptor ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) (איור 1A,B). ראוי לציין כי אבלציה של תאים מתווכים TRPV1 בתיווך באמצעות רעלן דיפתריה A (DTA) תבטל את כל תאי העצב TRPV1+, פפטידרגיים ולא פפטידרגיים כאחד (תאי MrgD+)13,14.
איור 1: תאי עצב TRPV1+ שולטים בהפעלת תאי NK. תאי NK טוהרו באופן מגנטי מבקרת פסולת (TRPV1 wt::D TAfl/wt) של עכברים ספלנוציטים ועוררו (48 שעות) עם IL-2 ו-IL-15. לאחר מכן תאי ה-NK גודלו בתרבית בלבד או בתרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מנוירון נוסיצפטור שלם (בקרת פסולת; TRPV1 wt::D TA fl/wt) או עכברים אבלטים (TRPV1cre::D TAfl/wt). לאחר מכן נחשפו התאים לקפסאיצין אגוניסט TRPV1 (1 μM) או לרכבו. לאחר 24 שעות של תרבית משותפת, תאי ה-NK טוהרו על-ידי FACS ורמות ההפעלה שלהם היו אימונופנוטיפיות באמצעות ציטומטריה של זרימה (A). בתרבית בלבד, תאי NK ביטאו רמות בסיסיות של GM-CSF ו-NKp46. ביטוי GM-CSF פחת כאשר תאי NK גודלו בתרבית משותפת עם נוירוני DRG שנקטפו מנוציצפטור ללא פגע (TRPV1 wt::D TAfl/wt) עכברים ועוררו עם קפסאיצין (A,B). הרמה של NKp46 לא הושפעה (A,B). לקפסאיצין לא הייתה השפעה על הפעלת תאי NK כאשר תרבית בתרבית יחד עם נוירוני DRG שנקטפו מעכברי nociceptor ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt) (A,B). חלקת FACS מייצגת מוצגת (A). הנתונים מוצגים כממוצע ± S.E.M (B). הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים והתקבלו מסקנות דומות. מוצג מספר בעלי החיים שנוסו; n = 5 שכפולים ביולוגיים/קבוצה (B). ערכי P מוצגים באיור ונקבעים על ידי ANOVA חד-כיווני פוסט-הוק בונפרוני (B). קיצורים: TRPV1 = תת-משפחה של ערוץ קטיון פוטנציאלי קולטן חולף V חבר 1; NK = רוצח טבעי; DTA = רעלן דיפתריה A; DRG = גנגליון שורש הגב; FACS = מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה; GM-CSF = גרנולוציטים-מקרופאגים מושבה גורם מגרה; Veh = רכב; כובע = קפסאיצין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| תמיסה | הרכב | ||
| קולגןאז/דיספאז (C/D) | PBS סטרילי בתוספת קולגןאז (1 מ"ג/מ"ל) ו-Dispase II (2.4 U/mL) | ||
| DMEM | תוסף DMEM סטרילי עם FBS (10%), פניצילין (100 יחב"ל) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל) | ||
| תוספת RPMI 1640 | RMPI 1640 סטרילי בתוספת פניצילין (100 I.U.), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), סרום בקר עוברי (10%), L-גלוטמין (300 ננוגרם/מ"ל), רקומביננטי לעכבר IL-2 (200 U/mL) ורקומביננטי עכבר IL-15 (10 ננוגרם/מ"ל) | ||
| נוירובסאל | תוספת נוירובסאל סטרילית עם פניצילין (100 יחב"ל), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), L-גלוטמין (200 מיקרומטר), B-27 (2%), NGF (50 ננוגרם/מ"ל) ו-GDNF (2 נ"ג/מ"ל) | ||
| נוירובסל MX | תוספת נוירובסל סטרילית עם פניצילין (100 I.U.), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם/מ"ל), L-גלוטמין (200 מיקרומטר), B-27 (2%), NGF (50 ננוגרם/מ"ל), GDNF (2 ננוגרם/מ"ל), רקומביננטי בעכבר IL-2 (200 U/mL) ורקומביננטי עכבר IL-15 (10 ננוגרם/מ"ל) | ||
| מאגר מיון FACS | PBS סטרילי בתוספת FBS (2%) ו-EDTA (1 mM) | ||
טבלה 1: רשימת הפתרונות והמדיה המשמשים בפרוטוקול זה. קיצורים: NGF = גורם גדילה עצבי; GDNF = גורם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה; FBS = סרום בקר עוברי; PBS = מלח חצוב פוספט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Davies et al.11 מצאו שתאי עצב פצועים מווסתים את RAE1. באמצעות מגע בין תאים, תאי NK המבטאים NKG2D הצליחו לזהות ולחסל נוירונים RAE1+ , אשר בתורם מגבילים כאב כרוני11. בהתחשב בכך שתאי NK מבטאים גם קולטני נוירופפטידים שונים, וכי נוירופפטידים אלה ידועים ביכולותיהם האימונומודולטוריות, נראה חשוב יותר ויותר לחקור את האינטראקציה בין תאי NK לנוירונים nociceptor במבחנה. כאן פיתחנו פרוטוקול פשוט של תרבית משותפת המאפשר לחוקרים לחקור כיצד תאי עצב שולטים בתפקוד תאי NK, ובאופן הדדי, כיצד תאי NK יכולים לווסת את תפקודם של נוירוני DRG. ציטומטריה של זרימה שימשה לאימונופנוטיפ שבו נוירונים מווסתים את הפעלת תאי ה-NK. לחלופין, חוקרים יכולים להשתמש בריצוף qPCR או RNA כדי למדוד שינויי תעתיק בתאים מטוהרים של FACS או לנתח את הפרשת הגורמים המופרשים, כגון ציטוקינים או נוירופפטידים, באמצעות ELISAs. נתונים גולמיים מופקדים וזמינים באופן חופשי ב- www.talbotlab.com.
כאן מצאנו כי TRPV1+ נוירונים nociceptor, משני לפעולה של קפסאיצין, לחסום הפעלת תאי NK (ביטוי GM-CSF). בעוד שקפסאיצין המשמש בריכוז גבוה עלול לפגוע בתפקודי תאי NK14, שללנו אפשרות זו באופן ניסיוני מכיוון שפעילות תאי NK לא הושפעה מחשיפה לקפסאיצין (1 μM) בהיעדר נוירונים פפטידרגיים (TRPV1cre::D TAfl/wt). מכיוון שקפסאיצין מוביל לזרם סידן ולשחרורם לאחר מכן בנוירופפטידים, נתונים אלה מצביעים על כך שהפעלת תאי NK היא ככל הנראה משנית לפעולה של גורמים מסיסים המשתחררים על ידי נוירונים. לכן, גישה כזו של תרבית משותפת הייתה שימושית כדי לחקור כיצד שחרור של נוירופפטידים עשוי לווסת את תפקוד תאי ה-NK. בנוסף לגורמים מסיסים, יחסי הגומלין המקומיים בין התאים בין שני סוגי התאים עשויים גם לווסת את תפקודם, דבר שיש לבחון באופן ניסיוני (למשל, להשוות את ההשפעה של תווך מותנה לזה של תרבית משותפת).
באופן כללי, יחסי גומלין כאלה מצביעים על כך שבתוך המיקרו-סביבה של הרקמה, סביר להניח שתפקוד תאי NK מכוון על ידי טרמינלי נוירונים של nociceptor. נתונים אלה מדגישים את החשיבות של הערכת תגובות דלקתיות באופן הוליסטי על-ידי מחקר בו-זמני של תפקידם של תאי עצב ותאי מערכת החיסון המולדת (כלומר, תאי NK). לדוגמה, סביר להניח ש-crosstalk בין תאי NK לנוירונים ממלא תפקיד ביולוגי חשוב בהקשרים המשתרעים מפגיעה עצבית, פגיעה ברקמות, זיהום חיידקי או ויראלי ועד ממאירויות. יש צורך בעבודה עתידית, כולל שימוש בשיטת תרבית משותפת זו, כדי להעריך את ההשפעה של יחסי הגומלין בין תאי נוירון-NK לבריאות ולמחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר New Frontiers in Research (NFRFE201901326), המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (162211, 461274, 461275), הקרן הקנדית לחדשנות (37439), תוכנית קתדרה למחקר בקנדה (950-231859), המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2019-06824), ו- Fonds de Recherche du Québec Nature et technologies (253380).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD16/32 | Jackson Laboratory | Cat no: 017769 | |
| B-27 | Jackson Laboratory | Cat no: 009669 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade | World Precision Instruments | Cat no: 504167 | |
| BV421 anti-mouse NK-1.1 | Fisher Scientific | Cat no: 12430112 | |
| Cell strainer (50 μm) | Fisher Scientific | Cat no: A3160702 | |
| Collagenase IV | Fisher Scientific | Cat no: 15140148 | |
| Diphteria toxinfl/fl | Fisher Scientific | Cat no: SH3057402 | |
| Dispase II | Fisher Scientific | Cat no: 13-678-20B | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | Cat no: 07-200-95 | |
| EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit | Sigma | Cat no: CLS2595 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | Cat no: C0130 | |
| FACSAria III | Sigma | Cat no: 04942078001 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | Cat no: 806552 | |
| FITC anti-mouse NKp46 | Sigma | Cat no: L2020 | |
| Flat bottom 96-well plate | Sigma | Cat no: 03690 | |
| Glass Pasteur pipette | Sigma | Cat no: 470236-274 | |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) | VWR | Cat no: 02-0131 | |
| Laminin | Cedarlane | Cat no: 03-50/31 | |
| L-Glutamine | Gibco | Cat no: A14867-01 | |
| Mouse recombinant IL-15 | Gibco | Cat no: 22400-089 | |
| Mouse recombinant IL-2 | Gibco | Cat no: 21103-049 | |
| Nerve Growth Factor (NGF) | Life Technologies | Cat no: 13257-019 | |
| Neurobasal media | PeproTech | Cat no: 450-51-10 | |
| PE anti-mouse GM-CSF | PeproTech | Cat no: 212-12 | |
| Penicillin and Streptomycin | PeproTech | Cat no: 210-15 | |
| Pestles | Stem Cell Technology | Cat no: 19855 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biolegend | Cat no: 108732 | Clone PK136 |
| RPMI 1640 media | Biolegend | Cat no: 137606 | Clone 29A1.4 |
| TRPV1Cre | Biolegend | Cat no: 505406 | Clone MP1-22E9 |
| Tweezers and dissection tools. | Biolegend | Cat no: 65-0865-14 | |
| U-Shaped-bottom 96-well plate | Biolegend | Cat no: 101319 | |
| Viability Dye eFlour-780 | Becton Dickinson |
References
- Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).
- Baral, P., et al. Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia. Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).
- Binshtok, A. M., et al.
- Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H.
- Samad, T. A., et al. Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity. Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).
- Godinho-Silva, C., et al. Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis. Nature. 574, 254-258 (2019).
- Talbot, J., et al. Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier. Nature. 579, 575-580 (2020).
- Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor. Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).
- Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331, 44-49 (2011).
- Davies, A. J., et al. Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury. Cell. 176, 716-728 (2019).
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2, 100333 (2021).
- Goswami, S. C., et al. Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis. Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).
- Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation. EMBO J. 30, 582-593 (2011).
- Kim, H. S., et al. Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism. Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).
