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Neuroscience

प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स के बीच परस्पर क्रिया को छेड़ना

Published: June 30, 2022 doi: 10.3791/63800
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology and Physiology, Université de Montréal

Summary

नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स और एनके कोशिकाएं सक्रिय रूप से एक भड़काऊ संदर्भ में बातचीत करती हैं। एक सह-संस्कृति दृष्टिकोण इस अंतःक्रिया का अध्ययन करने में सक्षम बनाता है।

Abstract

सोमाटोसेंसरी न्यूरॉन्स हानिकारक उत्तेजनाओं का पता लगाने और रक्षात्मक सजगता को सक्रिय करने के लिए विकसित हुए हैं। संचार के माध्यमों को साझा करके, नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स प्रतिरक्षा प्रणाली की गतिविधि को नियंत्रित करके मेजबान सुरक्षा को भी ट्यून करते हैं। इन प्रणालियों के बीच संचार ज्यादातर अनुकूली है, जो होमियोस्टैसिस की रक्षा करने में मदद करता है, यह पुरानी बीमारियों की शुरुआत को भी जन्म दे सकता है, या बढ़ावा दे सकता है। दोनों प्रणालियां इस तरह की स्थानीय बातचीत की अनुमति देने के लिए सह-विकसित हुईं, जैसा कि प्राथमिक और माध्यमिक लिम्फोइड ऊतकों और म्यूकोसा में पाया जाता है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि नोसिसेप्टर सीधे विदेशी एंटीजन, प्रतिरक्षा कोशिका-व्युत्पन्न साइटोकिन्स और रोगाणुओं का पता लगाते हैं और प्रतिक्रिया करते हैं।

नोसिसेप्टर सक्रियण के परिणामस्वरूप न केवल दर्द अतिसंवेदनशीलता और खुजली होती है, बल्कि नोसिसेप्टर फायरिंग सीमा कम हो जाती है, जिससे न्यूरोपैप्टाइड्स की स्थानीय रिहाई होती है। पेप्टाइड्स जो नोसिसेप्टर्स के परिधीय टर्मिनलों द्वारा उत्पादित और जारी किए जाते हैं, केमोटैक्सिस और लिम्फोसाइटों के ध्रुवीकरण को अवरुद्ध कर सकते हैं, स्थानीयकरण, अवधि और सूजन के प्रकार को नियंत्रित कर सकते हैं। हाल के सबूत ों से पता चलता है कि संवेदी न्यूरॉन्स सेल-सेल संपर्क के माध्यम से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत करते हैं, उदाहरण के लिए, प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं पर समूह 2 डी (एनके 2 डी) रिसेप्टर्स को संलग्न करना।

यह देखते हुए कि एनके कोशिकाएं विभिन्न नोसिसेप्टर-उत्पादित मध्यस्थों के लिए आत्मीय रिसेप्टर्स को व्यक्त करती हैं, यह संभव है कि नोसिसेप्टर एनके कोशिकाओं की गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए न्यूरोपैप्टाइड्स का उपयोग करते हैं। यहां, हम एक डिश में नोसिसेप्टर न्यूरॉन-एनके सेल इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि तैयार करते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने पाया कि काठ नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स एनके सेल साइटोकिन अभिव्यक्ति को कम करते हैं। कुल मिलाकर, इस तरह की एक कमीवादी विधि यह अध्ययन करने के लिए उपयोगी हो सकती है कि ट्यूमर-इनरवेटिंग न्यूरॉन्स एनके कोशिकाओं के एंटीकैंसर फ़ंक्शन को कैसे नियंत्रित करते हैं और एनके कोशिकाएं घायल न्यूरॉन्स के उन्मूलन को कैसे नियंत्रित करती हैं।

Introduction

संवेदी न्यूरॉन्स के कोशिका निकाय पृष्ठीय रूट गैन्ग्लिया (डीआरजी) में उत्पन्न होते हैं। डीआरजी परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएनएस) में स्थित होते हैं, रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय सींग और परिधीय तंत्रिका टर्मिनलों के बीच। डीआरजी न्यूरॉन्स की छद्म-एकध्रुवीय प्रकृति परिधीय शाखा से सूचना के हस्तांतरण की अनुमति देती है, जो लक्ष्य ऊतक को केंद्रीय शाखा में आंतरिक करती है, जो रीढ़ की हड्डी1 में सोमाटोसेंसरी जानकारी ले जाती है। विशेष आयन चैनल रिसेप्टर्स का उपयोग करके, प्रथम-क्रम न्यूरॉन्स रोगजनकों, एलर्जी और प्रदूषक2 द्वारा उत्पन्न खतरों को महसूस करते हैं, जिससे पिंजरों (Na+, Ca2+) की आमद होती है और एक क्रिया क्षमता 3,4,5 उत्पन्न होती है।

ये न्यूरॉन्स परिधि की ओर एंटीड्रोमिक एक्शन क्षमता भी भेजते हैं, जहां प्रारंभिक खतरे की संवेदन हुआ था, जो न्यूरोपैप्टाइड्स 1,4 की स्थानीय रिहाई की ओर जाता है। इसलिए, नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स एक सुरक्षात्मक तंत्र के रूप में काम करते हैं, मेजबान को पर्यावरणीय खतरे 4,5,6,7 के प्रति सचेत करते हैं।

दूसरे क्रम के न्यूरॉन्स के साथ संवाद करने के लिए, नोसिसेप्टर विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर (जैसे, ग्लूटामेट) और न्यूरोपैप्टाइड्स (जैसे, कैल्सीटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी), पदार्थ पी (एसपी), और वासोएक्टिव आंतों पेप्टाइड (वीआईपी)) 6,7 जारी करते हैं। ये पेप्टाइड्स केशिकाओं पर कार्य करते हैं और प्लाज्मा एक्स्ट्रावेसन, एडिमा और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानीय प्रवाह और मॉड्यूलेशनको बढ़ावा देते हैं 2,4,7.

सोमाटोसेंसरी और प्रतिरक्षा प्रणाली साइटोकिन्स और न्यूरोपैप्टाइड्स से बनी एक साझा संचार प्रणाली का उपयोग करती है, और उनके संबंधित आत्मीय रिसेप्टर्स4. जबकि यह द्विदिश संचार खतरे से बचाने और होमियोस्टैसिस को संरक्षित करने में मदद करता है, यह रोग पैथोफिज़ियोलॉजी4 में भी योगदान कर सकता है।

एनके कोशिकाओं को जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं के रूप में वर्गीकृत किया जाता है और वायरल संक्रमित कोशिकाओं को खत्म करने के लिए विशिष्ट होते हैं। एनके सेल फ़ंक्शन उत्तेजक और निरोधात्मक रिसेप्टर्स के संतुलन द्वारा नियंत्रित होता है, जिसमें सक्रिय रिसेप्टर एनकेजी 2 डी 8 शामिलहै। एनकेजी 2 डी का अंतर्जात लिगैंड, रेटिनोइक एसिड अर्ली इंड्यूसेबल 1 (आरएई 1), ट्यूमरजेनिसिस और संक्रमण 8,9 जैसे तनाव से गुजरने वाली कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किया जाता है।

हाल की जांच से पता चला है कि परिधीय तंत्रिका चोट संवेदी न्यूरॉन्स को स्टैथमिन 2 (एसटीएमएन 2) और आरएई 1 जैसे दुर्भावनापूर्ण अणुओं को व्यक्त करने के लिए प्रेरित करती है। इस प्रकार, सेल-सेल संपर्क के माध्यम से , एनकेजी 2 डी-व्यक्त एनके कोशिकाओं को आरएई 1-व्यक्त न्यूरॉन्स के साथ बातचीत द्वारा सक्रिय किया गया था। बदले में, एनके कोशिकाएं घायल नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स को खत्म करने और दर्द अतिसंवेदनशीलता को कुंद करने में सक्षम थीं जो सामान्य रूप से तंत्रिका चोट10 से जुड़ी होती हैं। एनकेजी 2 डी-आरएई 1 अक्ष के अलावा, एनके कोशिकाएं विभिन्न नोसिसेप्टर-उत्पादित मध्यस्थों के लिए आत्मीय रिसेप्टर्स को व्यक्त करती हैं। इसलिए यह संभव है कि ये मध्यस्थ एनके सेल गतिविधि को संशोधित करें। यह पेपर नोसिसेप्टर न्यूरॉन-एनके सेल इंटरैक्शन के जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक सह-संस्कृति विधि प्रस्तुत करता है। यह दृष्टिकोण इस बात को समझने में मदद करेगा कि नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स चोट, संक्रमण या घातकता के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिका प्रतिक्रियाओं को कैसे नियंत्रित करते हैं।

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Protocol

Université de Montreal (# 22053, # 22054) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों ने सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दी। समाधानों और उनकी संरचना की सूची के लिए तालिका 1 और इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्री , उपकरण और अभिकर्मकों की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. एनके सेल अलगाव, संस्कृति और उत्तेजना

  1. नोसिसेप्टर न्यूरॉन बरकरार उत्पन्न करें (लिटरमेट नियंत्रण; TRPV1wt: :D TAfl/wt) और ablated (TRPV1cre: :D TAfl/wt) चूहों को TRPV1cre/wt चूहों के साथ lox-स्टॉप-लोक्स-डिप्थीरिया टॉक्सिन चूहों (DTAfl/fl) को पार करके।
  2. सीओ2 इनहेलेशन का उपयोग करके, एक भोले कूड़े के नियंत्रण (TRPV1wt: :D TAfl / wt) माउस को इच्छामृत्यु करें।
  3. प्लीहा को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इकट्ठा करें जिसमें 500 μL बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (PBS) होता है।
  4. मूसल का उपयोग करके तिल्ली को समरूप करें।
  5. बाँझ पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को पतला करें।
  6. मिश्रण को 50 μm सेल छन्नी के माध्यम से 15 mL शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें।
  7. बाँझ पीबीएस के साथ वॉल्यूम (10 एमएल) को टॉप अप करें।
  8. 10 μL एकत्र करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  9. कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें (500 × ग्राम, 5 मिनट) और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  10. पूरक RPMI 1640 माध्यम में 108 कोशिकाओं / mL की एकाग्रता पर कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया।
  11. माउस एनके सेल अलगाव किट का उपयोग करके प्लीहा एनके कोशिकाओं को चुंबकीय रूप से शुद्ध करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें। फ्लो साइटोमेट्री11 का उपयोग करके एनके सेल शुद्धता की पुष्टि करें।
  12. 10 μL एकत्र करें और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें।
  13. कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें (500 × ग्राम, 5 मिनट) और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  14. पूरक आरपीएमआई 1640 संस्कृति माध्यम (आईएल -2 और आईएल -15 युक्त) में एनके कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया।
  15. कल्चर 2 × 48 घंटे के लिए96-वेल यू-बॉटम प्लेट में 10 6 एनके कोशिकाएं / एमएल।

2. डीआरजी न्यूरॉन अलगाव और संस्कृति

  1. एनके सेल उत्तेजना (चरण 1.15) के अंत से 24 घंटे पहले, लैमिनिन (1 एनजी / एमएल) के 100 μL / वेल के साथ एक 96-वेल प्लेट को कोट करें और 45 मिनट (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. इनक्यूबेशन के बाद, घोल को हटा दें और कुओं को जैव सुरक्षा कैबिनेट में हवा से सूखने दें।
  3. सीओ2 इनहेलेशन का उपयोग करके, नोसिसेप्टर न्यूरॉन बरकरार (लिटरमेट नियंत्रण; TRPV1wt: :D TAfl /wt) या ablated (TRPV1cre: :D TAfl / wt) चूहे।
    नोट: सीओ2 इनहेलेशन को ग्रीवा अव्यवस्था के लिए पसंद किया जाता है क्योंकि यह डीआरजी से जुड़ी रीढ़ की हड्डी की नसों को बाधित करने से बचाता है।
  4. एक प्रवण स्थिति में बोर्ड पर माउस को सुरक्षित करें, त्वचा को उठाएं, और पृष्ठीय स्तंभ के साथ त्वचा को संक्रमित करें। एक विस्तृत वीडियो12 के लिए Perner et al. देखें।
  5. लंबोसेराल जोड़ को काट लें और कैंची से काठ की रीढ़ से थैली को अलग करें।
  6. रीढ़ की हड्डी के दोनों किनारों पर मांसपेशियों और पसलियों को कपाल दिशा में काटकर रीढ़ को अलग करें जब तक कि खोपड़ी का आधार नहीं पहुंच जाता।
  7. कैंची का उपयोग करके, एटलांटो-ओसीसीपिटल जोड़ में रीढ़ की हड्डी काट दें।
  8. रीढ़ की हड्डी से मांसपेशियों और फैटी ऊतक को हटा दें।
  9. रीढ़ की हड्डी को हटाने और डीआरजी तक पहुंच प्राप्त करने के लिए कशेरुक स्तंभ को पिन करें और खोलें। पृष्ठीय जड़ के माध्यम से रीढ़ की हड्डी से जुड़े इंटरवर्टेब्रल फोरामिना में डीआरजी की तलाश करें लेकिन मेनिंगेस से अलग हो जाएं।
  10. डीआरजी को 10 एमएल बर्फ-ठंडा पूरक डीएमईएम से भरे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में काट लें।
  11. तैयारी को सेंट्रीफ्यूज करें (200 × ग्राम, 5 मिनट, कमरे का तापमान) और सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  12. कोलेजनेज IV (1 mg/mL) और डिस्पेज़ II (2.4 U/mL) युक्त PBS का 250 μL जोड़ें।
  13. डीआरजी को कोलेजनेज IV/डिस्पेज़ II (C/D) समाधान (80 मिनट, 37 °C, हल्के आंदोलन) के साथ इनक्यूबेट करें। कई चूहों से गैन्ग्लिया को पूल करते समय, प्रति गैंग्लियन सी / डी समाधान के 125 μL का अनुपात बनाए रखें।
  14. एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए, पूरक डीएमईएम माध्यम के 5 एमएल जोड़ें।
  15. घोल को सेंट्रीफ्यूज करें (200 × ग्राम, 5 मिनट) और धीरे से पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  16. अवांछित सेल हानि से बचने के लिए, सतह पर तैरने वाले के ~ 100 μL को छोड़ दें।
  17. पूरक डीएमईएम माध्यम के 1 एमएल जोड़ें।
  18. एक पिपेट गन और घटते आकार के तीन ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे डीआरजी को एकल-सेल तैयारी में ट्राइट्यूरेट (~ 10 ऊपर / नीचे प्रति पाश्चर पिपेट आकार) करें।
  19. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में, बाँझ पीबीएस में गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) को 15% की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल एलिकोट स्टोर करें।
  20. 2 एमएल बाँझ पीबीएस जोड़कर और ट्यूब के तल पर 15% बीएसए समाधान के 1 एमएल को धीरे-धीरे वितरित करके 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बीएसए ढाल बनाएं। धीरे से पिपेट को हटाकर ढाल को बाधित करने से बचें।
  21. पी 200 पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे ट्यूब के किनारे पर ट्राइट्यूरेटेड गैन्ग्लिया निलंबन (जिसमें न्यूरॉन्स होते हैं) को ढाल में डालें।
  22. न्यूरॉन युक्त बीएसए ढाल (200 × ग्राम, 12 मिनट, कमरे का तापमान) को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूज के त्वरण और मंदी को न्यूनतम गति पर सेट करें।
    नोट: सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, न्यूरॉन्स ट्यूब के तल पर होंगे जबकि सेल मलबे बीएसए ढाल में फंस जाएंगे।
  23. धीरे से पिपेट का उपयोग करके सभी सतह पर तैरने वाले को हटा दें।
  24. न्यूरोबेसल के 500 μL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित किया।
  25. प्लेट 104 न्यूरॉन्स प्रति कुएं (200 μL न्यूरोबेसल / वेल) एक लैमिनिन-लेपित, फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट में।
    नोट: औसतन, एक अन्वेषक प्रति माउस ~ 8 कुओं को भरने में सक्षम होगा।
  26. लगाव की अनुमति देने के लिए न्यूरॉन्स (37 डिग्री सेल्सियस, रात भर) को कल्चर करें।

3. सह-संस्कृति और प्रवाह साइटोमेट्री

  1. धीरे-धीरे न्यूरॉन संस्कृति से न्यूरोबेसल को हटा दें।
  2. आईएल -2 और आईएल -15 के साथ 48 घंटे की उत्तेजना के बाद (चरण 1.14-1.15 देखें), एनके कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और न्यूरॉन संस्कृति (96-अच्छी तरह से फ्लैट बॉटम प्लेट) में 105 एनके कोशिकाओं /
    नोट: औसतन, अन्वेषक प्रति माउस ~ 6 कुएं भरने में सक्षम होगा।
  3. पूरक न्यूरोबेसल एमएक्स (37 डिग्री सेल्सियस, 48 घंटे) में कोशिकाओं को सह-संस्कृति करें।
  4. कोशिकाओं को इकट्ठा करें, पीबीएस (3x), और सेंट्रीफ्यूज (500 × ग्राम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ धोएं।
  5. सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और वायबिलिटी डाई ईफ्लोर -780 (1: 1,000, 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ कोशिकाओं को दाग दें।
  6. कोशिकाओं को इकट्ठा करें, पीबीएस (3x), और सेंट्रीफ्यूज (500 × ग्राम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ धोएं।
  7. CD16/32 (1:100, 15 मिनट, 4 °C) के साथ कोशिकाओं पर गैर-विशिष्ट साइटों को ब्लॉक करें।
  8. कोशिकाओं को इकट्ठा करें, पीबीएस (3x), और सेंट्रीफ्यूज (500 × ग्राम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ धोएं।
  9. दाग (15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) बीवी 421 एंटी-एनके -1.1 (1: 100), फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) एंटी-एनकेपी 46 (1: 100), और फाइकोएरिथ्रिन (पीई) एंटी-जीएम-सीएसएफ (1: 100) के साथ कोशिकाएं।
  10. कोशिकाओं को इकट्ठा करें, पीबीएस (3x), और सेंट्रीफ्यूज (500 × ग्राम, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ धोएं।
  11. सुपरनैटेंट को छोड़ दें, एफएसीएस बफर (500 μL) में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और फ्लो साइटोमेट्री11 द्वारा एनके कोशिकाओं को इम्यूनोफेनोटाइप करें। गेटिंग रणनीति के लिए चित्रा 1 ए देखें।

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Representative Results

एनके कोशिकाओं को लिटरमेट कंट्रोल (टीआरपीवी 1डब्ल्यूटी: :D टीएएफएल / डब्ल्यूटी) चूहों स्प्लेनोसाइट्स से चुंबकीय रूप से शुद्ध किया गया और आईएल -2 और आईएल -15 के साथ उत्तेजित (48 घंटे) किया गया। एनके कोशिकाओं को तब अकेले सुसंस्कृत किया गया था या नोसिसेप्टर न्यूरॉन से काटे गए डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया था (कूड़े का नियंत्रण; TRPV1wt: :D TAfl/wt) या ablated (TRPV1cre: :D TAfl/wt) चूहे। कोशिकाओं को तब टीआरपीवी 1 एगोनिस्ट कैप्साइसिन (1 μM) या इसके वाहन के संपर्क में लाया गया था। सह-संस्कृति के 24 घंटे के बाद, एनके कोशिकाओं को एफएसीएस-शुद्ध किया गया था और उनके सक्रियण स्तर को प्रवाह साइटोमेट्री (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके इम्यूनोफेनोटाइप किया गया था।

जब अकेले सुसंस्कृत किया जाता है, तो एनके कोशिकाओं ने जीएम-सीएसएफ और एनकेपी 46 के बेसल स्तरों को व्यक्त किया। जब नोसिसेप्टर बरकरार (टीआरपीवी 1डब्ल्यूटी: :D टीएएफएल / डब्ल्यूटी) चूहों से काटे गए डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया, तो कैप्साइसिन उत्तेजना ने जीएम-सीएसएफ की एनके कोशिकाओं की अभिव्यक्ति को कम कर दिया। कैप्साइसिन का एनके सेल सक्रियण पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा जब नोसिसेप्टर एब्लेटेड (टीआरपीवी 1सीआरई: :D टीएएफएल / डब्ल्यूटी) चूहों से काटे गए डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ सह-संवर्धित किया गया (चित्रा 1 ए, बी)। यह ध्यान देने योग्य है कि डिप्थीरिया टॉक्सिन ए (डीटीए) का उपयोग करके टीआरपीवी 1सीआरई मध्यस्थता सेल एब्लेशन सभी टीआरपीवी 1 + न्यूरॉन्स, पेप्टाइडर्जिक और गैर-पेप्टाइडर्जिक समान रूप से (एमआरजीडी + कोशिकाओं) 13,14 को खत्म कर देगा।

Figure 1
चित्रा 1: टीआरपीवी 1 + न्यूरॉन्स एनके सेल सक्रियण को नियंत्रित करते हैं। एनके कोशिकाओं को लिटरमेट कंट्रोल (TRPV1wt: :D TAfl/wt) चूहों स्प्लेनोसाइट्स से चुंबकीय रूप से शुद्ध किया गया और IL-2 और IL-15 के साथ उत्तेजित (48 घंटे) किया गया। एनके कोशिकाओं को तब अकेले सुसंस्कृत किया गया था या नोसिसेप्टर न्यूरॉन से काटे गए डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ सह-सुसंस्कृत किया गया था (कूड़े का नियंत्रण; TRPV1wt: :D TAfl/wt) या ablated (TRPV1cre: :D TAfl/wt) चूहे। कोशिकाओं को तब टीआरपीवी 1 एगोनिस्ट कैप्साइसिन (1 μM) या इसके वाहन के संपर्क में लाया गया था। सह-संस्कृति के 24 घंटे के बाद, एनके कोशिकाओं को एफएसीएस-शुद्ध किया गया था और उनके सक्रियण स्तर को फ्लो साइटोमेट्री (ए) का उपयोग करके इम्यूनोफेनोटाइप किया गया था। जब अकेले संवर्धित किया जाता है, तो एनके कोशिकाओं ने जीएम-सीएसएफ और एनकेपी 46 के बेसल स्तरों को व्यक्त किया। जीएम-सीएसएफ अभिव्यक्ति में कमी आई जब एनके कोशिकाओं को नोसिसेप्टर बरकरार (TRPV1wt: :D TAfl / wt) चूहों से काटे गए DRG न्यूरॉन्स के साथ सह-संवर्धित किया गया और कैप्साइसिन (A, B) के साथ उत्तेजित किया गया। एनकेपी 46 का स्तर अप्रभावित था (ए, बी)। कैप्साइसिन का एनके सेल सक्रियण पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा जब नोसिसेप्टर एब्लेटेड (टीआरपीवी 1सीआरई: :D टीएएफएल / डब्ल्यूटी) चूहों (ए, बी) से काटे गए डीआरजी न्यूरॉन्स के साथ सह-संवर्धित किया गया। प्रतिनिधि एफएसीएस प्लॉट दिखाया गया है (ए)। डेटा को एसईएम (बी) ± माध्य के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। प्रयोग को तीन बार दोहराया गया और इसी तरह के निष्कर्ष प्राप्त किए गए। परीक्षण किए गए जानवरों की संख्या दिखाई गई है; एन = 5 जैविक प्रतिकृति / समूह (बी)। पी मान आंकड़े में दिखाए गए हैं और एक-तरफ़ा एनोवा पोस्ट-हॉक बोनफेरोनी (बी) द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। संक्षेप: TRPV1 = क्षणिक रिसेप्टर संभावित केशन चैनल उपपरिवार V सदस्य 1; एनके = प्राकृतिक हत्यारा; डीटीए = डिप्थीरिया विष ए; डीआरजी = पृष्ठीय जड़ नाड़ीग्रन्थि; एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; जीएम-सीएसएफ = ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक; वेह = वाहन; कैप = कैप्साइसिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

घोल संयोजन
कोलेजनेज /डिस्पेस (सी / डी) बाँझ पीबीएस कोलेजनेज (1 मिलीग्राम / एमएल) और डिस्पेस II (2.4 यू / एमएल) के साथ पूरक है
DMEM बाँझ डीएमईएम एफबीएस (10%), पेनिसिलिन (100 आईयू) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL) के साथ पूरक है
पूरक RPMI 1640 बाँझ आरएमपीआई 1640 पेनिसिलिन (100 आईयू), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL), भ्रूण गोजातीय सीरम (10%), L-ग्लूटामाइन (300 ng / mL), माउस पुनः संयोजक IL-2 (200 U / mL), और माउस पुनः संयोजक IL-15 (10 ng / mL) के साथ पूरक है
न्यूरोबेसल बाँझ न्यूरोबेसल पेनिसिलिन (100 आईयू), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL), L-ग्लूटामाइन (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng / mL), और GDNF (2 ng / mL) के साथ पूरक है।
न्यूरोबेसल एमएक्स बाँझ न्यूरोबेसल पेनिसिलिन (100 आईयू), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL), L-ग्लूटामाइन (200 μM), B-27 (2%), NGF (50 ng / mL), GDNF (2 ng / mL), माउस पुनः संयोजक IL-2 (200 U / mL), और माउस पुनः संयोजक IL-15 (10 ng / mL) के साथ पूरक है।
FACS सॉर्टिंग बफर बाँझ पीबीएस एफबीएस (2%) और ईडीटीए (1 एमएम) के साथ पूरक

तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों और मीडिया की सूची। संक्षेप: एनजीएफ = तंत्रिका विकास कारक; जीडीएनएफ = ग्लियल सेल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक; एफबीएस = भ्रूण गोजातीय सीरम; पीबीएस = फॉस्फेट-बफर्ड खारा।

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Discussion

डेविस एट अल .11 ने पाया कि घायल न्यूरॉन्स आरएई 1 को विनियमित करते हैं। सेल-सेल संपर्क के माध्यम से , एनकेजी 2 डी-व्यक्त एनके कोशिकाएं तब आरएई 1 + न्यूरॉन्स की पहचान करने और खत्म करने में सक्षम थीं, जो बदले में पुराने दर्द11 को सीमित करती हैं। यह देखते हुए कि एनके कोशिकाएं विभिन्न न्यूरोपैप्टाइड रिसेप्टर्स को भी व्यक्त करती हैं, और यह कि उन न्यूरोपैप्टाइड्स को उनकी इम्यूनोमॉड्यूलेटरी क्षमताओं के लिए जाना जाता है, इन विट्रो में एनके कोशिकाओं और नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स के बीच बातचीत का अध्ययन करना तेजी से महत्वपूर्ण प्रतीत होता है। यहां हमने एक सरल सह-संस्कृति प्रोटोकॉल तैयार किया जो जांचकर्ताओं को यह अध्ययन करने की अनुमति देता है कि न्यूरॉन्स एनके सेल फ़ंक्शन को कैसे नियंत्रित करते हैं, और पारस्परिक रूप से, एनके कोशिकाएं डीआरजी न्यूरॉन्स के कार्य को कैसे संशोधित कर सकती हैं। फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग इम्यूनोफेनोटाइप के लिए किया गया था कि न्यूरॉन्स एनके सेल सक्रियण को कैसे संशोधित करते हैं। वैकल्पिक रूप से, जांचकर्ता एफएसीएस-शुद्ध कोशिकाओं में प्रतिलेख परिवर्तनों को मापने के लिए क्यूपीसीआर या आरएनए-अनुक्रमण का उपयोग कर सकते हैं या ईएलआईएसए का उपयोग करके साइटोकिन्स या न्यूरोपैप्टाइड्स जैसे स्रावित कारकों के स्राव का विश्लेषण कर सकते हैं। कच्चे डेटा जमा किए जाते हैं और www.talbotlab.com पर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध होते हैं।

यहां हमने पाया कि टीआरपीवी 1 + नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स, कैप्साइसिन की कार्रवाई के लिए द्वितीयक, एनके सेल सक्रियण (जीएम-सीएसएफ अभिव्यक्ति) को अवरुद्ध करते हैं। जबकि उच्च सांद्रता पर उपयोग किए जाने वाले कैप्साइसिन एनके सेलकार्यों को खराब कर सकते हैं, हमने प्रयोगात्मक रूप से इस संभावना को खारिज कर दिया क्योंकि एनके सेल गतिविधि पेप्टाइडर्जिक न्यूरॉन्स (टीआरपीवी 1सीआरई: :D टीएएफएल / डब्ल्यूटी) की अनुपस्थिति में कैप्साइसिन (1 μM) जोखिम से प्रभावित नहीं थी। जैसा कि कैप्साइसिन कैल्शियम प्रवाह और न्यूरोपैप्टाइड्स में उनकी बाद की रिहाई की ओर जाता है, इन आंकड़ों से पता चलता है कि एनके सेल सक्रियण इसलिए न्यूरॉन्स द्वारा जारी घुलनशील कारकों की कार्रवाई के लिए द्वितीयक है। इसलिए, इस तरह का एक सह-संस्कृति दृष्टिकोण यह अध्ययन करने के लिए उपयोगी था कि न्यूरोपैप्टाइड्स की रिहाई एनके सेल फ़ंक्शन को कैसे संशोधित कर सकती है। घुलनशील कारकों के अलावा, दो सेल प्रकारों के बीच स्थानीय सेल-सेल इंटरैक्शन भी उनके कार्यों को संशोधित करने की संभावना रखते हैं, कुछ ऐसा जिसे प्रयोगात्मक रूप से परीक्षण किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, सह-संस्कृति में वातानुकूलित माध्यम के प्रभाव की तुलना करना)।

कुल मिलाकर, इस तरह के एक अंतःक्रिया से पता चलता है कि ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर, एनके सेल फ़ंक्शन को नोसिसेप्टर न्यूरॉन टर्मिनलों द्वारा ट्यून किया जाता है। ये डेटा न्यूरॉन्स और जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं (यानी, एनके कोशिकाओं) की भूमिका का एक साथ अध्ययन करके समग्र रूप से भड़काऊ प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के महत्व पर जोर देते हैं। उदाहरण के लिए, एनके सेल-न्यूरॉन क्रॉसस्टॉक संभवतः तंत्रिका चोट, ऊतक की चोट, जीवाणु या वायरल संक्रमण से लेकर दुर्भावनाओं तक फैले संदर्भों में एक महत्वपूर्ण जैविक भूमिका निभाता है। स्वास्थ्य और बीमारी में न्यूरॉन-एनके सेल इंटरप्ले के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस सह-संस्कृति विधि के उपयोग सहित भविष्य के काम की आवश्यकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को द न्यू फ्रंटियर्स इन रिसर्च फंड (एनएफआरएफई 201901326), कैनेडियन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ रिसर्च (162211, 461274, 461275), कैनेडियन फाउंडेशन फॉर इनोवेशन (37439), कनाडा रिसर्च चेयर प्रोग्राम (950-231859), नेचुरल साइंसेज एंड इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (आरजीपीआईएन-2019-06824) और फोंड्स डी रेचेरचे डु क्यूबेक नेचर एट टेक्नोलॉजीज (2533) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse CD16/32 Jackson Laboratory Cat no: 017769
B-27 Jackson Laboratory Cat no: 009669
Bovine Serum Albumin (BSA) culture grade World Precision Instruments Cat no: 504167
BV421 anti-mouse NK-1.1 Fisher Scientific Cat no: 12430112
Cell strainer (50 μm) Fisher Scientific Cat no: A3160702
Collagenase IV Fisher Scientific Cat no: 15140148
Diphteria toxinfl/fl Fisher Scientific Cat no: SH3057402
Dispase II Fisher Scientific Cat no: 13-678-20B
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific Cat no: 07-200-95
EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit Sigma Cat no: CLS2595
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Cat no: C0130
FACSAria III Sigma Cat no: 04942078001
Fetal bovine serum (FBS) Sigma Cat no: 806552
FITC anti-mouse NKp46 Sigma Cat no: L2020
Flat bottom 96-well plate Sigma Cat no: 03690
Glass Pasteur pipette Sigma Cat no: 470236-274
Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) VWR Cat no: 02-0131
Laminin Cedarlane Cat no: 03-50/31
L-Glutamine Gibco Cat no: A14867-01
Mouse recombinant IL-15 Gibco Cat no: 22400-089
Mouse recombinant IL-2 Gibco Cat no: 21103-049
Nerve Growth Factor (NGF) Life Technologies Cat no: 13257-019
Neurobasal media PeproTech Cat no: 450-51-10
PE anti-mouse GM-CSF PeproTech Cat no: 212-12
Penicillin and Streptomycin PeproTech Cat no: 210-15
Pestles Stem Cell Technology Cat no: 19855
Phosphate Buffered Saline (PBS) Biolegend Cat no: 108732 Clone PK136
RPMI 1640 media Biolegend Cat no: 137606 Clone 29A1.4
TRPV1Cre Biolegend Cat no: 505406 Clone MP1-22E9
Tweezers and dissection tools. Biolegend Cat no: 65-0865-14
U-Shaped-bottom 96-well plate Biolegend Cat no: 101319
Viability Dye eFlour-780 Becton Dickinson

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References

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न्यूरोसाइंस अंक 184 न्यूरो-इम्युनिटी न्यूरोपैप्टाइड्स एनके कोशिकाएं एनकेजी 2 डी आरएई 1
प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और नोसिसेप्टर न्यूरॉन्स के बीच परस्पर क्रिया को छेड़ना
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Ahmadi, A., Balood, M., Roversi, K., … More

Ahmadi, A., Balood, M., Roversi, K., Ahmadi, M., Rafei, M., Talbot, S. Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons. J. Vis. Exp. (184), e63800, doi:10.3791/63800 (2022).

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