Summary
Darmmicroben kunnen de gezondheid van hun gastheer positief of negatief beïnvloeden via specifieke of geconserveerde mechanismen. Caenorhabditis elegans is een handig platform om te screenen op dergelijke microben. Het huidige protocol beschrijft high-throughput screening van 48 bacteriële isolaten op impact op nematodenstressresistentie, gebruikt als proxy voor de gezondheid van wormen.
Abstract
Met zijn kleine formaat, korte levensduur en gemakkelijke genetica biedt Caenorhabditis elegans een handig platform om de impact van microbiële isolaten op de fysiologie van de gastheer te bestuderen. Het fluoresceert ook in blauw tijdens het sterven, wat een handig middel is om de dood te lokaliseren. Deze eigenschap is gebruikt om high-throughput labelvrije C. elegans survival assays (LFASS) te ontwikkelen. Deze omvatten time-lapse fluorescentieregistratie van wormpopulaties in multiwell-platen, waaruit populatiemediane tijd van overlijden kan worden afgeleid. De huidige studie hanteert de LFASS-benadering om meerdere microbiële isolaten tegelijk te screenen op de effecten op de gevoeligheid van C. elegans voor ernstige hitte en oxidatieve stress. Een dergelijke microbiële screeningspijplijn, die met name kan worden gebruikt om probiotica vooraf te screenen, met behulp van ernstige stressresistentie als een proxy voor de gezondheid van de gastheer, wordt hier gerapporteerd. Het protocol beschrijft hoe zowel C. elegans darmmicrobiota-isolaatcollecties als synchrone wormpopulaties in multiwell-arrays kunnen groeien voordat ze worden gecombineerd voor de assays. Het gegeven voorbeeld omvat het testen van 47 bacteriële isolaten en één controlestam op twee wormstammen, in twee stresstests parallel. De aanpakpijplijn is echter gemakkelijk schaalbaar en toepasbaar op de screening van vele andere modaliteiten. Het biedt dus een veelzijdige opstelling om snel een multiparametrisch landschap van biologische en biochemische omstandigheden te onderzoeken die van invloed zijn op de gezondheid van C. elegans .
Introduction
Het menselijk lichaam herbergt naar schatting 10-100 biljoen levende microbiële cellen (bacteriën, archaea-schimmels), die voornamelijk worden aangetroffen in de darm-, huid- en mucosale omgevingen1. In een gezonde toestand bieden deze voordelen voor hun gastheer, waaronder vitamineproductie, rijping van het immuunsysteem, stimulatie van aangeboren en adaptieve immuunresponsen op pathogenen, regulatie van vetmetabolisme, modulatie van stressreacties en meer, met een impact op groei en ontwikkeling, het begin van de ziekte en veroudering 2,3,4,5 . De darmmicrobiota evolueert ook aanzienlijk gedurende het hele leven. De meest drastische evolutie vindt plaats tijdens de kindertijd en de vroege kindertijd6, maar significante veranderingen treden ook op met de leeftijd, waaronder een afname van de overvloed aan Bifidobacterium en een toename van Clostridium, Lactobacillus, Enterobacteriaceae en Enterococcus species7. Levensstijl kan de microbiële samenstelling van de darm verder veranderen, wat leidt tot dysbiose (verlies van nuttige bacteriën, overgroei van opportunistische bacteriën), wat resulteert in verschillende pathologieën zoals inflammatoire darmaandoeningen, diabetes en obesitas5, maar ook bijdragen aan de ziekte van Alzheimer en Parkinson 8,9,10,11.
Dit besef heeft kritisch bijgedragen aan het verfijnen van het concept van de darm-hersenas (GBA), waar interacties tussen darmfysiologie (nu inclusief de microben erin) en het zenuwstelsel worden beschouwd als de belangrijkste regulator van dierlijk metabolisme en fysiologische functies12. De precieze rol van microbiota in darm-hersensignalering en de bijbehorende werkingsmechanismen zijn echter nog lang niet volledig begrepen13. Met darmmicrobiota als een belangrijke determinant van gezond ouder worden, is hoe bacteriën het verouderingsproces moduleren een onderwerp geworden van intensief onderzoek en controverse 6,14,15.
Met de demonstratie dat de rondworm Caenorhabditis elegans een bonafide darmmicrobiota herbergt die wordt gedomineerd - zoals bij andere soorten - door Bacteroidetes, Firmicutes en Actinobacteria 16,17,18,19,20, is de snelle opkomst ervan als een experimenteel platform om gastheer-darm commensale interacties te bestuderen 21,22,23,24 ,25,26 heeft ons onderzoeksarsenaal aanzienlijk uitgebreidmet 26,27,28,29. In het bijzonder kunnen high-throughput experimentele benaderingen die beschikbaar zijn voor C. elegans om gen-dieet, gen-medicijn, gen-pathogeen, enz. interacties te bestuderen, worden aangepast om snel te onderzoeken hoe bacteriële isolaten en cocktails de gezondheid en veroudering van C. elegans beïnvloeden.
Het huidige protocol beschrijft een experimentele pijplijn om in één keer arrays van bacteriële isolaten of mengsels in multiwell-platen te screenen op effecten op C. elegans stressresistentie als een proxy voor gezondheid, die kan worden gebruikt om probiotica te identificeren. Het beschrijft hoe grote wormpopulaties kunnen groeien en bacteriële arrays in 96- en 384-well plaatformaten kunnen worden verwerkt voordat wormen worden verwerkt voor geautomatiseerde stressbestendigheidsanalyse met behulp van een fluorescentieplaatlezer (figuur 1). De aanpak is gebaseerd op labelvrije geautomatiseerde overlevingstests (LFASS)30 die gebruik maken van het fenomeen van doodsfluorescentie31, waarbij stervende wormen een uitbarsting van blauwe fluorescentie produceren die kan worden gebruikt om het tijdstip van overlijden te bepalen. Blauwe fluorescentie wordt uitgestoten door glucosylesters van anthranilic acid opgeslagen in C. elegans darmkorrels (een soort lysosoom-gerelateerd organel), die barsten wanneer een necrotische cascade wordt geactiveerd in de worm darm bij overlijden31.
Figuur 1: Experimentele workflow voor high-throughput screening van bacteriële isolaten met impact op C. elegans resistentie tegen stress. (A) Tijdlijn voor worm- en bacterieonderhoud en testopstelling. (B) 96-well bacteriële plaat array setup en handling. (C) 384-well wormplaat opstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De twee C. elegans-stammen die parallel voor deze studie werden gebruikt, waren Bristol N2 wild type en HT1890: daf-16 (mgDf50), die met vergelijkbare snelheden groeien. Het protocol kan echter worden gerepliceerd met elke combinatie van twee stammen met vergelijkbare groeisnelheden. Merk op dat bij het parallel testen van andere stammen (bijvoorbeeld wildtype en langzaam groeiende daf-2-mutanten ), verschillende groeisnelheden moeten worden overwogen en dat het protocol dienovereenkomstig moet worden aangepast. De tijdschalen en hoeveelheden wormen en bacteriën in het volgende protocol zijn geoptimaliseerd voor parallelle testen van 48 bacteriële isolaten op twee wormstammen in twee LFASS-assays in tetraplicaten. Aanpassingen zullen nodig zijn om meer voorwaarden parallel te testen. Escherichia coli OP50 bacteriestam werd verkregen van het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), Universiteit van Minnesota. De 48 bacteriële isolaten werden verkregen uit het Schulenburg lab en onderhouden op LB agar.
1. C. elegans kweken op OP50 (Dag 1 - 8)
OPMERKING: De huidige aanpak is erop gericht om C. elegans hermafrodieten in alle stadia op een vast medium te laten groeien en onnodige veranderingen in het dieet te voorkomen (d.w.z. met behulp van alternatieve sneller groeiende E. coli-stammen zoals NA22 of rijkere groeimedia zoals eiplaten) om zo dicht mogelijk bij de standaard groeiomstandigheden32,33 te blijven die nog steeds veel worden gebruikt. De groeitemperatuur van de worm (hier ingesteld op 15 °C) is afhankelijk van de gebruikte C. elegans-stam(en) en moet mogelijk worden aangepast (bijvoorbeeld om de expressie van een temperatuurgevoelig fenotype of biomarker te voorkomen of te activeren). Voor informatie over de wormenhouderij, zie referentie33.
- Bereid acht NGM-platen met een diameter van 6 cm (10 ml nematodengroeimedia agar, NGM, aanvullend bestand 1) 32,33 per wormstam en laat ze 1 dag drogen bij kamertemperatuur.
- Bereid een verzadigde vloeibare cultuur van E. coli OP50-bacteriën door een enkele bacteriële kloon te zaaien uit een vers gekweekte Lysogeny Broth agar (LB agar, Supplementary File 1) plaat in 25 ml OP50 medium (Aanvullend bestand 1) in een conische buis van 50 ml. Kweek de kweek 's nachts bij 37 °C in een shaker incubator.
- Ent de acht NGM-platen van 6 cm per stam in met 100 μL verzadigde vloeistofkweek van E. coli OP50 per plaat en houd de platen gedurende 2 dagen voor gebruik op 20 °C.
- Snijd en breng met behulp van een scalpel een vierkant agar-stuk van 0,5 cm met wormen van een onlangs uitgehongerde NGM-plaat over op elk van de acht geënte 6 cm NGM-platen en incubeer deze platen bij 20 ° C gedurende 3 dagen (of totdat de wormen het voedsel hebben voltooid).
- Bereid vijf NGM-platen van 15 cm per wormenstam (30 ml NGM-medium per plaat) en ent u in met 3 ml OP50. Laat de borden drogen voor het broeden bij 37 °C een nacht. Houd de platen op 20 °C tot gebruik in latere stappen.
- Voeg met behulp van een P-1000-pipet tot 3 ml steriele M9-buffer (aanvullend bestand 1) toe aan de NGM-platen van 6 cm (stap 1.1.) om de wormen te resuspenderen en verzamel de wormoplossing van alle acht platen per stam in een enkele conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer bij 142 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een P-5000 pipet of een waterpomp uitgerust met een steriele Pasteur pipet of tip. Voeg 10 ml steriele M9-buffer toe om de wormkorrel te wassen. Herhaal 2x.
- Verwijder het supernatant (zoveel mogelijk) en breng de wormen over op een 15 cm OP50 geënt NGM-bord (stap 1.5.) met behulp van een pipet. Voeg 0,5 ml geconcentreerde OP50-cultuur toe.
- Om geconcentreerde OP50 te maken, ent u elk van de vier 1 L-flessen LB met 2 ml OP50-startercultuur (bereid in stap 1.2.) en groeit u in een schudincubator gedurende 6 uur bij 37 °C en 160 x g. Pellet de bacteriën bij 3057 x g en 20 °C gedurende 15 min. Gooi het supernatant weg, resuspendeer de bacteriële pellets met 6 ml OP50-medium en verzamel in een steriele conische buis van 50 ml.
OPMERKING: Bacteriën kunnen maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.
- Kweek elke wormenstam op een NGM-plaat met een diameter van 15 cm gedurende 3-4 dagen bij 15 °C door de wormen dagelijks opnieuw te voeden met 0,5 ml geconcentreerde OP50.
- Zodra de wormen bijna klaar zijn met het voedsel, verzamelt en wast u in M9-buffer (stap 1.6.1.), brengt u elke wormenstamcultuur over naar twee NGM-platen van 15 cm (stap 1.5.) en vermeerdert u wormen bij 20 °C tot ~ 95% van de populatie gravid volwassenen zijn (het duurt ongeveer 24 uur voor het wilde type Bristol N2).
OPMERKING: Gravid-volwassenen worden gekenmerkt door de aanwezigheid van eieren in de worm, en de ideale plaat moet ook een overvloed aan niet-gehate eieren op het bord hebben gelegd zonder al te veel larven33.
- Zodra de wormen bijna klaar zijn met het voedsel, verzamelt en wast u in M9-buffer (stap 1.6.1.), brengt u elke wormenstamcultuur over naar twee NGM-platen van 15 cm (stap 1.5.) en vermeerdert u wormen bij 20 °C tot ~ 95% van de populatie gravid volwassenen zijn (het duurt ongeveer 24 uur voor het wilde type Bristol N2).
2. Onderhoud van darmmicrobiota-isolaatcollecties (dag 9)
- Streep de 48 bacteriële isolaten op individuele 6 cm LB agarplaten en groei gedurende 48 uur bij 20 °C.
OPMERKING: Bacteriën kunnen indien nodig eerder bij 25 °C gedurende 24-36 uur worden gekweekt, maar de langere groei van 20 °C maakt het mogelijk om potentiële verontreinigingen te spotten. - Synchroniseer een groot aantal C. elegans.
- Bleek volwassen wormen door de standaard eibereidingsmethode33 te volgen en breng de eieren gedurende 24 uur bij 15 °C over op twee ongezaaide NGM-platen van 15 cm om alle L1-larven in de volgende stappen synchroon te laten uitkomen en groeien.
LET OP: Wees voorzichtig bij het hanteren van bleekoplossingen.
- Bleek volwassen wormen door de standaard eibereidingsmethode33 te volgen en breng de eieren gedurende 24 uur bij 15 °C over op twee ongezaaide NGM-platen van 15 cm om alle L1-larven in de volgende stappen synchroon te laten uitkomen en groeien.
3. Het kweken van grote C. elegans culturen (Dag 10)
- Eenmaal uitgekomen, verzamel de L1-larven (vanaf stap 2.2.1.) in 3-4 ml M9 in een schone conische buis van 15 ml. Pipetteer vier druppels wormoplossing van 10 μL op een dia of een plaat en tel het aantal wormen in elke druppel onder een stereomicroscoop bij 16x vergroting. Bepaal de wormconcentratie van de oplossing door het gemiddelde van het aantal larven van alle druppels wormoplossing te berekenen. Vermenigvuldig deze waarde met het volume dat overblijft en schat het totale aantal wormen voor elke stam.
OPMERKING: In dit stadium zijn 46.000-50.000 L1-larven per stam nodig om later een plaat met 384 putten of twee halve platen te vullen.- Breng voor elke stam alle L1-larven over op twee NGM-platen van 15 cm (23.000-25.000 L1 per plaat) die eerder zijn ingeënt met 3 ml OP50 (stap 1.5.) en opnieuw zijn ingezaaid met 0,5 ml geconcentreerde OP50.
- Incubeer bij 15 °C en vul indien nodig dagelijks 0,5 ml geconcentreerde OP50 aan totdat de wormen het L4-stadium bereiken.
OPMERKING: Het L4-stadium wordt gekenmerkt door een iets donkerdere darm en een halve schijf of halvemaanvormige witte vlek waar de vulva uiteindelijk 32,33 zal vormen. - Bereid 96-well NGM-agarose platen volgens de onderstaande stappen.
- Bereid acht 96-well NGM-agarose platen voor door elke put te vullen met 125 μL NGM-agarose (vier platen per assay).
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om wat extra platen te plaatsen als sommige in de volgende stappen besmet raken. Twee plaatlezers moeten assays parallel uitvoeren, maar ze kunnen ook achtereenvolgens worden uitgevoerd, te beginnen met de hittestresstest, omdat deze slechts 6 uur kan worden uitgevoerd. Voor deze platen wordt de <4% as-agar vervangen door agarose (zie Materiaaltabel), waardoor langzamer en gelijkmatiger drogen over de NGM-pluggen mogelijk is en het graven van wormen wordt verminderd voor een beter herstel. - Zorg ervoor dat de putten gelijkmatig en bubbelvrij gevuld zijn. Gebruik een warmteblok ingesteld op 70 °C (met langzame warmteoverdracht door het plastic van de multiwellplaat, mag de NGM-agarose slechts tot ongeveer 55-60 °C opwarmen) om te voorkomen dat het mengsel tijdens het proces stolt. Om bubbels in putten te verwijderen, gebruikt u een steriele vlamverwarmde naald.
- Laat de 96-well platen op kamertemperatuur zetten in een steriele omgeving voordat u omkeert (deksel naar beneden om condensatie te voorkomen) en bewaar bij 4 °C in een schone doos totdat het nodig is.
- Bereid acht 96-well NGM-agarose platen voor door elke put te vullen met 125 μL NGM-agarose (vier platen per assay).
- Controleer op dag 11 de wormen uit stap 3.2. om ervoor te zorgen dat er geen verontreinigingen zijn verschenen en dat de wormen nog steeds vol zijn.
- Controleer op dag 12 de wormen uit stap 3.1. om ervoor te zorgen dat er geen verontreinigingen zijn verschenen en dat de wormen nog steeds vol zijn. Controleer ook het ontwikkelingsstadium van de wormen.
OPMERKING: Het geslacht /de stam en het ontwikkelingsstadium van de worm, zoals L4 of L4 + 24 h wormen die worden gebruikt, zijn afhankelijk van de behandelingen waaraan de wormen worden onderworpen. Hier werden wild-type hermafrodieten gedurende 36 uur blootgesteld aan bacteriële isolaten uit L4.
4. Het voorbereiden van darmmicrobiota-isolaatcollecties voor het opnieuw voeden van wormen
- Monitor de bacteriegroei op de LB agar platen uit stap 2.1. en blijven incuberen bij 20 °C.
OPMERKING: Hoewel het niet ideaal is, kunnen bacteriën, in het geval dat sommige klonen niet groeien of besmettingen onthullen, opnieuw worden gestreept van schone voorraden op 6 cm LB-platen en gedurende 24 uur bij 25-28 ° C worden gekweekt om klaar te zijn voor het experiment. - Definieer een array-lay-out met 96 putten voor de bacteriële verzameling die wordt getest, waardoor systematische plaatzaaiing en gegevensanalyse in de volgende stappen mogelijk wordt (aanvullende tabel 1).
- Verzamel de bacteriële massa van elke bacteriële plaat van 6 cm (stap 4.1.) en breng deze over naar een gelabelde microcentrifugebuis van 1,5 ml met 1 ml M9-buffer. Voer dit uit met behulp van een steriele plastic lus met een diameter voor eenmalig gebruik van 2 mm of een metalen lus met een diameter van 5 mm. Steriliseer de metalen lus tussen bacteriestammen door 100% ethanol in te dopen, te vlammen en gedurende 5 s af te koelen.
- Vortex de microcentrifugebuizen totdat de bacteriële pellets volledig geresuspendeerd zijn (afhankelijk van de bacteriestam kan dit ~ 1-10 s duren).
- Draai af op 9.300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, verwijder 700 μL supernatant en resuspensieer de bacteriële pellet door vortexing.
- Breng 200 μL van elke bacteriële suspensie over in een enkele put van een lege steriele 96-wellsplaat volgens de lay-out in stap 4.2.
- Ent vanaf deze plaat acht 96-well NGM-agarose platen (bereid in stap 3.3.) met 10 μL bacteriële oplossing met behulp van een meerkanaals pipet en incubeer met het deksel op bij 25 °C gedurende 24 uur. Sluit de platen niet af om plaatdroging en bacteriële aerobe groei mogelijk te maken en om overmatige condensatie te voorkomen.
- Sluit de 96-well ophangplaat af die is voorbereid in stap 4.6. met schone zelfklevende afdichtingsfolie (zie Materiaaltabel) en bewaren bij 15 °C gedurende maximaal 5 dagen. Dit zal worden gebruikt voor het opnieuw voeden van wormen als dat nodig is.
5. LFASS hitteschok en oxidatieve test setup (dagen 13 - 14)
- Kijk naar de platen uit stap 3.5., beoordeel het ontwikkelingsstadium van de wormen. Zodra >90% van de wormen L434 heeft bereikt, verzamelt u de wormen in maximaal 10 ml steriele M9-oplossing in conische buizen van 15 ml.
- Was de wormen uitgebreid (minstens 4x) door gedurende 2 minuten op 4 °C op 142 x g te draaien, het supernatant te verwijderen en 10 ml vers steriel M9 tussen elke wasbeurt toe te voegen om op50-bacteriën te verwijderen. Resuspendeer de wormkorrel in 10 ml M9.
- Breng 50 μL wormoplossing over in een laag oppervlak bindende buis (zie Materiaaltabel) die 950 μL M9 bevat. Nadat u de inhoud van de buis voorzichtig hebt gemengd om bezinking van de worm te voorkomen, gebruikt u snel een bevochtigde pipetpunt met lage binding om 3-4 afzonderlijke druppels van 10 μL over te brengen op een glazen dia of een NGM-plaat en telt u wormnummers onder een stereomicroscoop (zie Materiaaltabel) bij vergroting van 16x. Gemiddelde van de tellingen van de 3-4 druppels en bepaal het aantal wormen per microliter in de wormoplossing (zie stap 3.1.).
- Pas de wormconcentratie in de buis van 10 ml aan om ~ 120 wormen in 8 μL te bereiken. Indien de oplossing bereid in stap 5.2. is niet geconcentreerd genoeg, spin de wormen naar beneden en verwijder M9 dienovereenkomstig om 120 wormen per 8 μL te bereiken.
- Breng 8 μL wormoplossing (~ 120 wormen) over in elk van de putten van de acht 96-well NGM-agarose-platen uit stap 4.7., met behulp van een meerkanaals pipet of een herhaalde pipet. Zorg ervoor dat u tips voor lage retentie gebruikt om wormverlies te beperken. Het kan ook nodig zijn om de uiteinden van de punt te snijden om grote volwassen wormen mogelijk te maken om mechanische stress op volwassen wormen te beperken.
OPMERKING: De test vereist een minimum van 30 levende gezonde wormen om betrouwbaar te werken, maar werkt het beste met ongeveer 100 wormen per put. - Incubeer de worm en bacterie-gezaaide 96-well NGM-agarose platen bij 25 °C gedurende 36 h.
- Controleer de platen tussen 12-24 uur en zorg ervoor dat de wormen overal vol blijven. Als hervoeding nodig is, resuspenseer de bacteriën dan in de 96-well bacteriële arrayplaat die in stap 4.8 bij 15 °C is opgeslagen, en voeg tot 10 μL van de overeenkomstige bacteriële oplossing toe aan de 96-well NGM-agarose-platen waar wormen het risico lopen te verhongeren vóór het einde van de incubatietijd van 36 uur (uitgehongerde wormen zullen enorm verschillende resultaten opleveren, dit is dus erg belangrijk).
OPMERKING: De volgende stappen moeten worden uitgevoerd op dag 15. Voordat de test wordt gestart, kan het nodig zijn om de leeshoogte te optimaliseren. De optimale meting wordt bereikt 20-50 μm boven de bodem van de put. Dit is afhankelijk van het model van de plaatlezer. Sommige bieden de mogelijkheid van een Z-scan, terwijl andere handmatige hoogte-invoer toestaan. Stel de optimale hoogte in op het niveau waar het hoogste blauwe fluorescentiesignaal (365 nm/430 nm) wordt gedetecteerd. Sommige plaatlezers werken op een vaste hoogte die is geoptimaliseerd voor adherente celtests en zijn mogelijk niet ideaal voor LFASS-assays. - Doseer na 36 uur 30 μL M9 in elk putje van de 96-putplaat.
OPMERKING: Voor thermische stresstests moet de plaatlezer de vereiste temperatuur hebben bereikt om de test uit te voeren en moet deze mogelijk van tevoren worden ingeschakeld. Het huidige protocol gebruikt 42 °C om de dodingssnelheid te maximaliseren, maar de aanpak is van toepassing op andere temperaturen boven de 30 °C. - Breng wormen (ongeveer 20 μL) over naar de 384-well plaat volgens de ingestelde lay-outs, met behulp van tips met lage retentie (overweeg het uiteinde van de tips af te snijden om grote wormen in staat te stellen mechanische stress voor volwassen wormen te verminderen).
OPMERKING: Voor deze studie worden twee verschillende instellingen voor plaatlezers gebruikt voor de twee hier beschreven testen (thermische stress en oxidatieve stress), en daarom mogen monsters die voor deze twee assays zijn bedoeld, niet in dezelfde 384-well plaat worden geplaatst. - Zorg ervoor dat de plaatlezers correct zijn ingesteld (tabel 1).
- Vul de 384-well platen aan met meer M9, met als doel een eindvolume van 60 μL per put. Voeg voor thermische stresstest 40 μL M9 toe en voeg voor t-BHP-geïnduceerde oxidatieve stress 34 μl M9 toe in 6 μl t-BHP (zie Materiaaltabel).
- Start de test binnen 2 minuten na het toevoegen van t-BHP (idealiter moeten alle wormen tegelijkertijd worden blootgesteld aan t-BHP, waarbij de resolutie van de testtijd 2 minuten is). Als dit niet mogelijk is, gebruik dan een timer om de tijd te schatten die wordt besteed aan het pipetteren van t-BHP vóór het begin van de test om latere aanpassing van het mediane tijdstip van overlijden mogelijk te maken.
- Sluit de borden met hun transparante deksel. Sluit de randen van de 384-well platen af met afplaktape (taping over de plaat en het deksel), zodat de tape niet over het deksel of onder de plaat gaat. Snijd de tape tussen deksel en plaat met tussenpozen met behulp van een scalpel om luchtuitwisseling mogelijk te maken en tegelijkertijd de verdamping tijdens de test te minimaliseren.
- Steek de plaat in de plaatlezer (zie Materiaaltabel) en start de run. Streef naar exciteren bij 365 nm en detecteer emissie bij 435 nm elke 2 min gedurende 6-12 uur (tabel 1).
OPMERKING: Typisch, 6 uur is genoeg voor 42 °C hittestress assays en 8 h voor 7% t-BHP oxidatieve stress assays.
6. Verwerking van plaatlezergegevens
- Sla de onbewerkte fluorescentiegegevens van de platenlezer op als komma- of tabgescheiden .txt-, .csv- of .xls /.xlsx-indeling en converteer vervolgens naar xls /.xlsx-indeling. Afhankelijk van het gegevensformaat kunt u ze reorganiseren om overeen te komen met de Excel-bladlay-out die nodig is voor LFASS-analyse. Volg de gedetailleerde instructies in referentie30.
OPMERKING: Hoewel gegevens handmatig kunnen worden geanalyseerd, elke tijdreeks kunnen worden genormaliseerd en op zoek kunnen gaan naar de tijd waarop de doodsfluorescentie het halve maximum bereikt, kan geautomatiseerde analyse worden uitgevoerd in Matlab met de LFASS-routine30. - Download en installeer Matlab (versie 2014a of hoger) en het LFASS-softwarepakket vanaf https://github.com/ABA80/LFASS. Volg de richtlijnen en annotaties die erin worden vermeld.
OPMERKING: Figuur 1C geeft een korte beschrijving van de aanpak. Matlab is verplicht om de LFASS-routine uit te voeren. Als alternatief kan de Matlab-code worden vertaald naar Oracle, met uitzondering van de aanpassingsfunctie, die eigendom is. Nieuwe smoothing- en sigmoid-functies kunnen worden herschreven om gebruik in een volledig open-sourceplatform mogelijk te maken. - Verplaats tussen LFASS-analyses de gegevens en resultaten naar een nieuwe locatie, omdat de LFASS-analyse alle bestanden in de gegevensmap verwerkt en bestanden in de map Resultaten overschrijft.
7. Gegevensinspectie
- Open het Excel-bestand en label de rijen op basis van de putpositie op de 384-well-plaat. Aanvullend bestand 2 toont een voorbeeld van het Excel-bestand van de ruwe fluorescentiegegevens die zijn gegenereerd voor de hitteschoktest. Gebruik de putpositie op de 384-well plaat om de worm en bacteriestammen te labelen.
- Voorafgaand aan de Matlab-analyse inspecteert u de gegevens visueel in Excel en plot u de fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd voor een representatieve put. Afhankelijk van de gebruikte platenlezer kunnen de gegevens luidruchtig zijn, maar moeten ze een duidelijke piek vertonen. In het bijzonder:
- Bepaal een fluorescentiewaarde waaronder een piek niet significant zou verschillen van ruis (het instellen van een dergelijke drempel in LFASS zal de analyse versnellen door lege putten uit te sluiten).
- Let op het vroegste tijdstip waarop fluorescentiefluctuaties dempen voordat ze stijgen (dieren kunnen krachtig gedurende maximaal 30 minuten slaan, wat leidt tot snel fluctuerende blauwe fluorescentiemetingen).
OPMERKING: De piekaanpassing kan worden verbeterd door deze vroege tijdspunten uit te sluiten van het curve-aanpassingsvenster. - Let op de tijdspunten waartussen minimale en maximale fluorescentiewaarden naar verwachting zullen dalen (kijk naar verschillende putten om deze bereiken te identificeren), omdat ze zullen worden gebruikt voor het passen van curven.
- Controleer of de amplitudes van de fluorescentiepieken aanzienlijk variëren tussen de putten, normaliseer de gegevens voorafgaand aan verdere analyse met behulp van de volgende formule:
Genormaliseerde fluorescentieputn (t) = (Fluorescentieputn [t] - minimale fluorescentieput [Dt]) / (maximale fluorescentieput [Dt] - minimale fluorescentieput [Dt])
waarbij "n" het huidige putgetal is, "t" het tijdspunt en "Dt" de reeks tijdspunten voor de test.
8. LFASS-gegevensverwerking
OPMERKING: Details worden verstrekt in https://github.com/ABA80/LFASS en in de aanvullende materialen van referentie30.
- Maak twee submappen in de LFASS-map, één voor de te analyseren gegevens en één voor resultaten, bijvoorbeeld "mijn gegevens" en "resultaten".
- Kopieer het assay excel data bestand naar de LFASS submap "my data" na data inspectie.
- Start MATLAB, navigeer naar de map LFASS , typ en voer de fitfolder uit in het opdrachtvenster (aanvullend bestand 3). Volg vervolgens de instructies op het scherm.
- Na het intypen van "fitfolder" vraagt het systeem om de naam van de map waarin het Excel-bestand zich bevindt, bijvoorbeeld 'mijn gegevens'. Typ de naam van uw gegevensmap (in dit voorbeeld 'mijn gegevens').
- Volg de instructies op het scherm en geef de verschillende gevraagde parameters op.
- Voer "2" in voor het tijdsinterval tussen opeenvolgende metingen in het huidige protocol (als u dit opgeeft, kunnen de resultaten worden uitgedrukt in minuten in plaats van tijdspunteenheden).
OPMERKING: Het tijdsinterval kan worden aangepast om fluorescentiemetingen meer of minder vaak uit te voeren (om de tijdresolutie te verlagen of te verhogen) en ook afhankelijk van de mogelijkheden van de plaatlezer (d.w.z. het tijdsinterval moet mogelijk worden verhoogd voor plaatlezers die niet snel genoeg metingen kunnen uitvoeren). Zorg ervoor dat het experimentele tijdsinterval altijd overeenkomt met de LFASS-routine. - Wijs de bovenste tolerantiedrempel toe door "0,95" te typen (dit kan indien nodig worden gewijzigd om de pasvorm te verbeteren) en de onderste tolerantiedrempel door "0,05" te typen (dit kan indien nodig worden gewijzigd om de pasvorm te verbeteren) om de pasvorm van het sigmoïd te beperken.
OPMERKING: Andere tijdparameters zijn gebaseerd op gebruikersnotities van de gegevensinspectie (stap 7.2.).
- Voer "2" in voor het tijdsinterval tussen opeenvolgende metingen in het huidige protocol (als u dit opgeeft, kunnen de resultaten worden uitgedrukt in minuten in plaats van tijdspunteenheden).
- Kies of u al dan niet gemonteerde en vloeiende curven wilt weergeven door "y" voor JA of "n" voor NEE te typen wanneer daarom wordt gevraagd. Als u de convergerende pasvormen visueel wilt inspecteren, selecteert u de eerste.
OPMERKING: Dit laatste is handig om alle afgevlakte gegevens te visualiseren, maar wordt meestal niet geselecteerd omdat het te veel pop-upgrafieken genereert. Hierna voert Matlab de LFASS-routine uit, die 1-10 minuten kan duren als meerdere Excel-bestanden in één keer worden verwerkt. Pop-upvensters met curven worden weergegeven volgens de selectie in stap 8.6. Aanvullend bestand 4A toont een voorbeeld van een aangepaste curve. - Kies of u (1) curven wilt analyseren die als ruis zijn geïdentificeerd of (2) slecht passende curven wilt aanpassen met een optie [j/n]. Typ y om goed te keuren en n om af te wijzen.
OPMERKING: Het goedkeuren van refitting wordt aanbevolen, vooral als er veel slecht gemonteerde of niet-gemonteerde curven zijn. Dit stelt de gebruiker in staat om aangepaste curve-aanpassingsparameters te bieden voor elke curve zoals deze op het scherm verschijnt en alleen om eerdere en latere grenzen te vragen voor de sigmoid fit. Het kan zo vaak als nodig worden geprobeerd. - Zodra de gegevens zijn geanalyseerd, sluit u Matlab en opent u de map LFASS .
- Klik op de LFASS-submap Mijn resultaten, omdat de resultaatbestanden automatisch worden opgeslagen in de map Resultaten als .txt.
OPMERKING: Matlab genereert drie .txt bestanden: "Batch-fitted.txt", "Batch and noise-fitted.txt" en "Refitted.txt". De eerste twee worden uit voorzorg opgeslagen in geval van een computercrash of gebruikersfout tijdens de refitting. Het bestand met de meest nauwkeurige volledige analyse is "Refitted.txt". - Open het bestand Refitted.txt met Microsoft Excel en sla het op als .xls voor verdere verwerking. Aanvullend bestand 4B toont een voorbeeld van een dergelijk resultaatbestand.
OPMERKING: Voor elke put (georganiseerd in rijen) worden drie waarden gegeven in de kolommen die schattingen geven van de mediane tijd van overlijden van de wormpopulatie: "Raw": rapporteert de tijd die kruist op het halve maximum van de experimentele gegevenspiek; "Batch-fitted": meldt de tijd om elkaar te kruisen op het halve maximum van de batch-gemonteerde curve; "Refit": meldt de tijd om te kruisen op het halve maximum van de opnieuw gemonteerde curve. - Sla het bestand in .xls-indeling op als kopie op een veilige locatie. Als u dit niet doet, loopt u het risico dat de bestanden worden overschreven tijdens de volgende run van de LFASS-routine.
OPMERKING: De resultaten kunnen vervolgens verder worden verwerkt voor grafieken of statistische analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LFASS-testen bieden robuuste, snelle screening van meerdere testomstandigheden tegelijk, zoals het screenen van tal van genetische en microbiotaparameters die bijdragen aan stressbestendigheid en veroudering. Het duurt slechts 2-3 weken voordat het experiment een uitgebreide dataset van meerdere testomstandigheden heeft verkregen. L4 + 36 h volwassen wild-type wormpopulaties werden blootgesteld aan 42 °C thermische stress en 7% t-BHP-geïnduceerde oxidatieve stress na een 36 h kweek op 48 darm microbiële isolaten gedurende 36 h. De test werd vier keer uitgevoerd, waarbij elke aandoening vier keer in elke test werd gerepliceerd. Onder alle geteste omstandigheden varieerde de mediane tijd van overlijden tussen 40-130 minuten voor de thermische stresstest en tussen 90-240 minuten voor de t-BHP geïnduceerde oxidatieve stresstest. Thermische stresstests op jonge leeftijd vertonen meestal consistentere resultaten en minder variabiliteit tussen de dagen en binnen de dag dan oxidatieve stresstests en zijn betere voorspellers van de daaropvolgende levensduur30. Het verschil in de mediane tijd van overlijden van wormen gevoed met verschillende microbiële diëten illustreert overtuigend hoe darmcommensalen de stressbestendigheid van de gastheer beïnvloeden. Figuur 2 toont typische resultaten van 16 biologische replicaties voor Bristol N2 wild-type wormen op twee darmmicrobiota-isolaten van belang en de standaard laboratoriumstam E. coli OP50.
Figuur 2: Representatieve resultaten van gepaarde hitte/oxidatieve stressresistentietests van wormen gekweekt op twee bacteriële isolaten en een controlestam. (A) Hittestresstest. Wild-type wormen werden gedurende 36 uur gevoed met MYb11 (Pseudomonas lurida) of MYb115 (Pseudomonassp.) bacteriële isolaten of OP50-controlebacteriën. MYb11 leidde tot een significant eerder mediane tijdstip van overlijden (p < 0,001). (B) Oxidatieve stresstest. Wild-type wormen werden gedurende 36 uur gevoed met MYb11 of MYb115 bacteriële isolaten of OP50-controlebacteriën. MYb11 leidde tot een significant vroegere mediane tijd van overlijden (p < 0,05). 120-150 wormen werden geanalyseerd in vier sets monsters en elk experiment werd uitgevoerd in quadruplicaat. Putten met slechte kwaliteit/slecht passende gegevens leidden tot ontbrekende waarden. Boxplotrepresentaties geven waarden van één put, minimum-, mediaan- en maximumwaarden aan. *Geeft statistische significantie aan op p < 0,05 en ***p < 0,001, met eenrichtings-ANOVA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Een | |||
| Parameter | Montuur | Commentaar | |
| Temperatuur | 25 °C | ||
| Fluorescentie excitatie | 365 NM | 10 nm bandbreedte | |
| Fluorescentie-emissie | 430 NM | 20 nm bandbreedte | |
| Aantal flitsen | 8 flitsen, 1ms settle tijd | ||
| Behalen | 100 tot 130 | Aan te passen afhankelijk van het monster. Streef naar een leeswaarde van 2-5 k aan het begin van de test | |
| Vertragingstijd | 1 μs | ||
| Integratietijd | 30 μs | ||
| Leestijdinterval | Elke 2 min | Afhankelijk van de ernst van de stress, moeten de duur en het tijdsinterval mogelijk worden aangepast (8 uur is voldoende bij 7% t-BHP) | |
| Duur | 8-12u | ||
| Lees richting | Van onderaf | ||
| B | |||
| Parameter | Montuur | Commentaar | |
| Temperatuur | 42 °C | ||
| Fluorescentie excitatie | 365 NM | 10 nm bandbreedte | |
| Fluorescentie-emissie | 430 NM | 20 nm bandbreedte | |
| Aantal flitsen | 8 flitsen, 1ms settle tijd | ||
| Behalen | 100 tot 130 | Aan te passen afhankelijk van het monster. Streef naar een leeswaarde van 2-5 k aan het begin van de test | |
| Vertragingstijd | 1 μs | ||
| Integratietijd | 30 μs | ||
| Leestijdinterval | Elke 2 min | Afhankelijk van de ernst van de stress, moeten de duur en het tijdsinterval mogelijk worden aangepast (6 uur is voldoende bij 42 °C) | |
| Duur | 6-12u | ||
| Lees richting | Van onderaf | ||
Tabel 1: Oxidatieve en hittestress testinstellingen. Voorbeelden van instellingen die worden gebruikt voor oxidatieve (A) en warmte (B) stresstests op de fluorescentieplaatlezers die in deze studie worden gebruikt.
Aanvullend bestand 1: Media-, buffer- en cultuurrecepten. Samenstelling van verschillende media, buffers en culturen die in deze studie worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: Onbewerkte fluorescentiegegevens van de plaatlezer nadat deze zijn geëxporteerd en geconverteerd naar Excel .xls-indeling. (A) Het Excel-bestand toont de ruwe fluorescentiegegevens voor een hitteschoktest. Ruwe fluorescentiegegevens worden weergegeven met een tijdsinterval van 2 minuten. (B) De kolom met "putpositie" op de 384-well plaat wordt gemarkeerd, die kan worden gebruikt om de worm en bacteriestammen te labelen. (C) Het bestand is gelabeld met worm- en bacteriestammen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 3: LFASS-analyse met Matlab. (A) Na het openen van de LFASS-map in Matlab verschijnt er een opdrachtvenster. (B) "fitfolder" wordt in het opdrachtvenster getypt om het programma te starten en de naam van de map met het te analyseren bestand wordt aangegeven. (C) Zodra het programma het Excel-gegevensbestand voor analyse heeft gevonden, moet de gebruiker de instructies op het scherm volgen en de verschillende gevraagde parameters opgeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 4: LFASS-gegevens geanalyseerd met Matlab. (A) Een voorbeeld van een curve die door matlabanalyse is aangebracht, waarbij de zwarte lijn het tijdspunt aangeeft dat overeenkomt met de eerdere tijdsgrens en de blauwe lijn de latere tijdsgrens voor de curve-fitting. De aangebrachte sigmoïde curve wordt in het rood weergegeven. (B) Het door Matlab gegenereerde resultatenbestand wordt geopend in .xls formaat. De waarden worden gemarkeerd en weergegeven in getalnotatie. De tweede kolom geeft de tijd aan waarop de waarde op de onbewerkte gegevenscurve voor het eerst meer dan 50% van de maximale waarde bedraagt. De derde kolom geeft het tijdstip weer waarop de waarde van de aangebrachte curve gelijk is aan 50% van de maximale waarde, zoals bepaald tijdens de batch-fittinganalyse. De vierde kolom geeft het tijdstip aan waarop de waarde op de aangebrachte curve gelijk is aan 50% van de maximale waarde na batchanalyse en definitieve aanpassing indien nodig. De vierde kolom moet dus het meest betrouwbare resultaat opleveren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Voorbeeld van experimentele plaatindelingen. (A) 96-well plaat lay-out voor het testen van 47 verschillende worm darm microbiota bacteriële isolaten op twee afzonderlijke wormstammen, waarbij live OP50 wordt gebruikt als controle. Vier exemplaren van deze plaat zijn vereist voor elke test die wordt uitgevoerd. B) 384-well lay-out voor warmte- of oxidatieve stresstests, overeenkomend met de vorige 96-well plate assay onder (A). Met deze opstelling kunnen tetraplicaten worden uitgevoerd voor elke aandoening, waarbij elke wormstam zijn eigen OP50-controle heeft. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans biedt vele voordelen voor het snel screenen van meerdere experimentele parameters tegelijk, vanwege het kleine formaat, de transparantie, de snelle ontwikkeling, de korte levensduur, de goedkoopheid en het gebruiksgemak. Het aanzienlijk eenvoudigere genoom, het lichaamsplan, het zenuwstelsel, de darm en het microbioom, maar toch complex en vergelijkbaar genoeg met mensen, maken het een krachtig preklinisch model, waar mechanistisch inzicht kan worden verkregen tijdens het testen op bioactieve werkzaamheid of toxiciteit. Aangezien de interesse groeit in het ontwikkelen van microbiële interventies voor ziekten 8,9,34,35, is het profiteren van dergelijke preklinische modellen om probiotica snel te onderzoeken een aantrekkelijke optie met het grotendeels onbenutte en bijna onbeperkte therapeutische potentieel van microben34. Het hier beschreven protocol is geschikt om de impact van milieubacteriën op de gezondheid van C. elegans te bestuderen, maar kan gemakkelijk worden aangepast voor andere doeleinden.
Veelzijdigheid
De verschillende "modules" die deze pijplijn vormen, kunnen worden aangepast aan experiment- of laboratoriumspecifieke vereisten. Bacteriële isolaten kunnen bijvoorbeeld worden vervangen door bacteriële mengsels, bacteriële mutanten of RNAi-producerende bacteriën, en de opstelling kan worden gebruikt om te screenen op bacteriële genen die betrokken zijn bij interacties tussen gastheer en microbe, te screenen op gastheergenen die betrokken zijn bij stressresistentie, of de impact van individuele microben te bestuderen als onderdeel van gedefinieerde bacteriële gemeenschappen. Deze methode beschrijft de screening van verschillende bacteriële isolaten in de genetische achtergrond van een enkele worm. De test is echter schaalbaar en meerdere gastheer- en bacteriële genotypen kunnen tegelijkertijd worden bestudeerd. Dit kan verder worden gecombineerd met differentiële medicamenteuze behandelingen en /of voedingsregimes om inzicht te krijgen in de interacties tussen het gen-microbe-gen en het dieet van de gastheer.
Het protocol moet nog worden geprobeerd op andere nematodensoorten, maar het moet ook rechtstreeks van toepassing zijn op C. remanei en C. briggsae, en het kan van toepassing zijn op L3-stadium parasitaire nematodensoorten die morfologische, grootte- en doodsfluorescentiekenmerken delen met C. elegans30. Ten slotte kunnen andere stressoren (juglone, paraquat, arsenaat, andere temperaturen) binnen dezelfde pijplijn worden gebruikt om aanvullende of bevestigende informatie te verstrekken.
Potentiële uitdagingen
De tijdsinvestering tot dag 12 om wormen en bacteriën te laten groeien vóór de testen is aanzienlijk, maar vanwege de doorvoer van de aanpak wordt deze ruimschoots gecompenseerd door de breedte van de verzamelde gegevens. Niettemin is voorzichtigheid bij het plannen van dergelijke testen essentieel om tijdverspilling te voorkomen door de voorbereidingsstappen te herhalen, omdat materialen suboptimaal zijn tegen de tijd dat de testen kunnen beginnen. De belangrijkste vroege problemen zijn monsterbesmetting (wormen of bacteriën), slecht gesynchroniseerde wormpopulaties en het opraken van materialen (wormpopulaties eten sneller dan verwacht door hun voedsel en voeden of verplaatsen dieren vaker dan gepland).
Besmettingen vermijden
Vanwege de omvang en duur van het protocol is een belangrijk potentieel probleem besmetting door schimmels en bacteriën, waarvan het optreden de resultaten zeker zou verstoren. De ideale opstelling is dus een speciale laboratoriumruimte met airconditioning en luchtfilter zonder directe luchtstroom boven de experimentele bank, met behulp van steriele verbruiksartikelen. Het naleven van regelmatige reinigingsprocedures (het ontsmetten van banken voor en na het werk, het reinigen van plaatdozen en het gebruik van steriele verbruiksartikelen) en het werken met een vlam in een afgesloten ruimte (vermijd gangen, ruimtes in de buurt van open deuren en ramen) zijn meestal voldoende om een schone omgeving te behouden. Als er milde besmettingen optreden voorafgaand aan de bereiding van eieren in stap 2.2.1., zal de bleekprocedure ervoor zorgen en kan het protocol volgens plan verlopen. Omgekeerd zullen besmettingen die de groeiende wormpopulatie beïnvloeden voordat ze op testbacterieplaten worden overgebracht, het einde van die poging betekenen en moet het protocol opnieuw worden opgestart vanaf stap 1. Latere besmettingen zullen de neiging hebben om enkele bacteriestammen of testomstandigheden te beïnvloeden. Afhankelijk van hun omvang kan het de moeite waard zijn om door te gaan of het protocol opnieuw op te starten.
Worm synchronisatie
Aangezien de weerstand tegen thermische en oxidatieve uitdagingen verandert wanneer wormen zich ontwikkelen en groeien, kunnen testomstandigheden die leiden tot verschillende ontwikkelingsstadia tegen de tijd dat LFASS-testen worden uitgevoerd, niet gemakkelijk worden vergeleken. Het is essentieel om goed gesynchroniseerde populaties op te leveren voor eindpunttests. Aangezien de testen worden uitgevoerd op wormen die in bulk zijn verzameld in L4- of L4 + 48-uursstadia, moeten de wormpopulaties bij afwezigheid van een wormensorteerder of andere sorteerprocedure om perfect geënsceneerde wormen te verzamelen, zeer goed gesynchroniseerd zijn bij L1. Er moet voor worden gezorgd dat jongen lang genoeg van voedsel worden gehouden zodat alle levende eieren kunnen uitkomen voordat het testcohort wordt gekweekt (>15 uur bij 20 °C en >18 uur bij 15 °C). Genotype kan de verspreiding in ontwikkelingstijdstip beïnvloeden, die ook wordt beïnvloed door de temperatuur. Groeiende wormpopulaties bij 15 °C geven hierover een betere controle en beperken de impact van temperatuurgevoelige mutaties tijdens de uitbreidingsfase van de wormpopulatie (met name bij het werken met insulinesignalerende mutanten). De belangrijkste reden om de effecten van microben van L4 of L4 + 48 h te bestuderen, is om de ontwikkelingseffecten van een verschillend dieet te omzeilen en de impact van levende darmbacteriën te bestuderen in plaats van hun impact op voeding. Wormen gekweekt in een eerder larvaal stadium op verschillende bacteriële isolaten of mengsels zullen onvermijdelijk leiden tot ongelijke ontwikkelingssnelheden en een verlies van synchronie.
Gevolgen van vertrouwen op blauwe fluorescentie
In staat zijn om de dood in LFASS-assays te lokaliseren zonder de noodzaak van individuele wormtracking of extra reagentia zoals Sytox green36, maar in plaats daarvan een endogene signaal te benutten in een fluorescentiebereik dat waarschijnlijk niet overlapt met traditionele wormbiomarkers, is een duidelijk voordeel. Het blijft echter van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat fluorescentie van wormdood consistent kan worden gedetecteerd in veel testomstandigheden. Hoewel de test niet afhankelijk is van fluorescentiekwantificering, maar van de dynamiek ervan, moet er nog steeds voldoende fluorescentie worden uitgestoten door de wormen om de mediane tijd van overlijden (TOD) nauwkeurig te schatten. Omdat de test geen oplossing van enkele wormdood mogelijk maakt, moeten de blauwe fluorescentie-uitbarstingen die door stervende individuen worden uitgestoten, voldoende temporele overlap hebben voor fluorescentieaccumulatie om een fluorescentiepiek van één populatie te geven. Alleen dan kan de mediane TOD nauwkeurig worden afgeleid. Dit betekent dat wormen die niet in staat zijn om voldoende niveaus van blauwe fluorescentie te produceren, niet kunnen worden gebruikt in dit protocol, dat met name enkele mutanten van de kynurenine-route omvat, zoals tdo-2 en kynu-130,31, evenals uitgehongerde dieren. Daarom is het belangrijk om ervoor te zorgen dat wormen overal in volledige omstandigheden worden gehouden. Dit kan met name een probleem zijn bij het uitvoeren van HT115-aangedreven RNAi-schermen, omdat HT115-gazons op NGM-medium aangevuld met IPTG en antibiotica meestal dunner zijn dan OP50-gazons. Het monitoren van de voedselvoorziening van wormen tijdens de dagen voorafgaand aan de testen is dus van cruciaal belang.
Een ander gevolg van de dynamiek van doodsfluorescentie is dat hoe sneller de test, hoe beter de gevoeligheid, omdat wormen uit dezelfde populatie synchroner zullen sterven en een meer gedefinieerde populatiedoodfluorescentiepiek zullen produceren. Dus hoe langer de test, hoe groter de populatiegrootte die nodig is om goede doodsfluorescentiepieken te genereren. Mutanten met een laag metabolisme, zoals eat-2 en daf-230, zullen ook minder fluorescentie afgeven en hogere aantallen per put vereisen. Terwijl 10-15 wild-type wormen per put voldoende zijn voor een thermische stresstest van 42 °C die ze allemaal binnen 4 uur doodt, is bijna het dubbele van die hoeveelheid vereist voor daf-2 (e1370) wormen in dezelfde test, en >100 wild-type wormen zijn vereist voor een test die wormen zou doden gedurende een periode van 24 uur.
In de context van bacteriële isolaten in het milieu kan een verschillend microbieel metabolisme ook een differentiële invloed hebben op de kynurenineroute die de blauwe fluorescerende verbindingen produceert. Vandaar dat sommige bacteriële isolaten leiden tot een lagere piekdoodfluorescentie, terwijl andere leiden tot hogere pieken dan OP50. Als gevolg hiervan moet men streven naar voldoende wormen per put om alle eventualiteiten op te vangen.
Ten slotte is het correct optimaliseren van de parameters voor het aflezen van platen essentieel. Dit protocol behandelt de instelling van fluorescentie-excitatie- en emissieparameters en de diepte waarop metingen idealiter moeten worden uitgevoerd. Met een mogelijk breed scala aan doodsfluorescentieopbrengsten over meerdere omstandigheden in één test, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat zwakke signalen worden gedetecteerd, maar dat detectoren nooit verzadigd zijn. Instrumenten met detectoren met een hoog dynamisch bereik zullen dus beter presteren.
Beperkingen van de methode
De hier beschreven methode is robuust en flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende omstandigheden. Voor het gemak worden belangrijke beperkingen en beperkingen vermeld in het protocol waar ze in het spel komen. Kortom, de afhankelijkheid van doodsfluorescentie als een endogene marker van de dood is zowel een kracht als een beperking van deze testen.
Onder een beperkt aantal specifieke voedingsomstandigheden (lage tryptofaandiëten of uithongering) en in mutante omstandigheden die het tryptofaanmetabolisme beïnvloeden (d.w.z. tdo-2, kynu-1, sommige daf-2-allelen ), kan de doodsfluorescentie (DF) sterk worden verzwakt, in die mate dat de piekfluorescentie moeilijk te detecteren is en TOD-schattingen minder betrouwbaar zijn.
Omgekeerd kunnen sommige microben blauwe fluorescerende verbindingen produceren waarvan de excitatie- en emissiespectra overlappen met DF-signalen (d.w.z. Enterococcus faecalis). Hoewel hun dynamiek verschilt van de DF en vaak kan worden ontkoppeld, kunnen ze de analyse verwarren.
Vervolgens vertrouwen de testen op de cumulatie van signalen van stervende individuele wormen, maar DF wordt in de loop van de tijd geblust. Daarom, als wormen te ver uit elkaar sterven, zullen individuele fluorescentiepieken geen populatiepiek produceren, waardoor de meting van een populatiemediane TOD wordt voorkomen. Hoe langzamer de test doodt, hoe hoger het wormnummer dat nodig is in elke put30. Vandaar dat 10-15 volwassen wormen per put voldoende zijn voor een hittestresstest van 42 °C die de helft van de wormen binnen 2 uur doodt, maar meer dan 70 wormen per put zijn nodig voor een bacteriële sneldodende test die de helft van de wormen in 12 uur doodt.
Ten slotte hebben gebruikers toegang nodig tot een plaatlezer om dergelijke testen uit te voeren die time-lapse fluorescentiemetingen op de vereiste golflengten kunnen uitvoeren. Excitatie- en emissiegolflengten kunnen ook enigszins variëren tussen systemen en variëren tussen nematodensoorten, zoals vermeld30.
Vergelijking en complementariteit met andere C. elegans-assays
In de afgelopen 10-15 jaar zijn veel testen ontwikkeld om de gezondheid van C. elegans in meerdere omstandigheden tegelijk te beoordelen, waarbij een verscheidenheid aan strategieën wordt gebruikt en verschillende niveaus van gegevensdiepte en -breedte worden geboden 30,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45, 46. Er zijn met name verschillende krachtige testen ontwikkeld om automatisch veel wormen tegelijk op vaste media te controleren gedurende hun levensduur, met behulp van camera-arrays en scanners met multi-worm tracking-algoritmen en / of gemicrofabriceerde individuele wormarrays 37,38,39,40,41,43 . In de context van gastheer-microbe interacties, soortgelijke benaderingen van het hierboven beschreven protocol, maar niet vertrouwend op DF, hebben ook genoombrede RNAi-screening van C. elegans-genen mogelijk gemaakt die betrokken zijn bij bacteriële infecties 46,47,48. Deze high-throughput assays zijn echter afhankelijk van het hanteren van wormen in vloeistof, wat niet wenselijk is bij het omgaan met meerdere bacterietypen tegelijk vanwege de verhoogde risico's op kruisbesmetting en omdat vloeistofcultuur het gastheer- en microbiële metabolisme beïnvloedt. Vandaar dat bij traditionele infectie-, stress-, gezondheids- en levensduurtests C. elegans worden onderhouden en gerijpt op bacteriële gazons die op vaste media worden gekweekt. Zoals ook het geval is in dit protocol, kunnen resultaten van schermen die met deze pijplijn worden uitgevoerd, gemakkelijker worden gerelateerd aan en de uitkomst van downstream bevestigende experimenten met schermhits voorspellen.
De voordelen van de LFASS-aanpak zelf zijn goed behandeld in Referentie30. In vergelijking met meer uitgebreide continue beeldvormingsopstellingen die kunnen worden hergebruikt voor vergelijkbare studies, is LFASS goedkoper (op voorwaarde dat mediane TOD de enige uitlezing is die nodig is), en de eenvoud betekent dat het niet veel technische vaardigheden of gespecialiseerde apparatuur vereist. LFASS gaat vooral over breedte over diepte. LFASS-gegevens geven geen andere informatie dan het mediane tijdstip van overlijden van een wormpopulatie en een indirecte uitlezing van een kynurenineroute-output. Omgekeerd, met een lagere maar nog steeds behoorlijke doorvoer, kunnen complexe eigenschappen worden gemeten uit andere assays 37,38,39,40,41,43 over de hele levensduur van wormen, waardoor ze uitstekende downstream-benaderingen zijn om hits van een LFASS-scherm te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken de CGC Minnesota (Madison, VS, NIH - P40 OD010440) voor het leveren van wormstammen en OP50 en Pr. Hinrich Schulenburg (CAU, Kiel, Duitsland) voor het leveren van alle microbiële isolaten uit het milieu die hier worden afgebeeld. Dit werk werd gefinancierd door een UKRI-BBSRC-subsidie aan AB (BB/S017127/1). JM wordt gefinancierd door een Lancaster University FHM PhD-beurs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm diameter plates (Non-vented) | Fisher Scientific | 10720052 | Venting is not necessary for bacterial cultures |
| 15 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 168381 | |
| 384-well black, transparent flat bottom plates | Corning | 3712 or 3762 | Not essential to be sterile for fast stress assays |
| 6 cm diameter plates (Vented) | Fisher Scientific | 150288 | Venting is necessary for worm cultures to avoid hypoxia |
| 96-well transparent plates (Biolite) | Thermo | 130188 | |
| Agar (<4% ash) | Sigma-Aldrich | 102218041 | Good quality agar is important for the structural integrity of the culture media, to avoid worm burrowing |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356 | |
| Avanti Centrifuge J-26 XP | Beckman coulter | ||
| Bleach | Honeywell | 425044 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| LB agar | Difco | 240110 | |
| LB broth | Invitrogen | 12795084 | |
| LoBind tips | VWR | 732-1488 | Lo-bind reduce worm loss during transfers |
| LoBind tubes | Eppendorf | 22431081 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M/1100/53 | |
| Plate reader- infinite M nano+ | Tecan | Monochromator setup enables fluorescence tuning but adequate filter-based setups may be used | |
| Plate reader- Spark | Tecan | ||
| Potassium phosphate monobasic | Honeywell | P0662 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S/3160/63 | |
| Stereomicroscope setup with transillumination base | Leica | MZ6, or M80 | Magnification from 0.6-0.8x up to 40-60x is necessary, as is a good quality transillumination base with a deformable, titable or slidable mirror to adjust contrast |
| t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide) | Sigma-Aldrich | 458139 | |
| Transparent adhesive seals Nunc | Fisher Scientific | 101706871 | It is important that it is transparent and that it can tolerate the temperatures involved in the assays. |
| Tryptophan | Sigma-Aldrich | 1278-7099 | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
- Krishna, S., et al. Integrating microbiome network: establishing linkages between plants, microbes and human health. The Open Microbiology Journal. 13, 330-342 (2019).
- Amon, P., Sanderson, I.
- Belkaid, Y., Harrison, O. J.
- Cabreiro, F., Gems, D. Worms need microbes too: microbiota, health and aging in Caenorhabditis elegans. EMBO Molecular Medicine. 5 (9), 1300-1310 (2013).
- Vaga, S., et al. Compositional and functional differences of the mucosal microbiota along the intestine of healthy individuals. Scientific Reports. 10 (1), 14977 (2020).
- Nagpal, R., et al. Gut microbiome and aging: Physiological and mechanistic insights. Nutrition and Healthy Aging. 4 (4), 267-285 (2018).
- Mitsuoka, T.
- Bonfili, L., et al. Microbiota modulation as preventative and therapeutic approach in Alzheimer's disease. The FEBS Journal. 288 (9), 2836-2855 (2021).
- Vendrik, K. E. W., et al. Fecal microbiota transplantation in neurological disorders. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 98 (2020).
- Wang, Q., et al. The role of gut dysbiosis in Parkinson's disease: mechanistic insights and therapeutic options. Brain. 144 (9), 2571-2593 (2021).
- Zhu, X., et al. The relationship between the gut microbiome and neurodegenerative diseases. Neuroscience Bulletin. 37 (10), 1510-1522 (2021).
- Miller, I.
- Foster, J. A., Rinaman, L., Cryan, J. F. Stress & the gut-brain axis: Regulation by the microbiome. Neurobiology of Stress. 7, 124-136 (2017).
- Coman, V., Vodnar, D. C. Gut microbiota and old age: Modulating factors and interventions for healthy longevity. Experimental Gerontology. 141, 111095 (2020).
- Conway, J., Duggal, N. A. Ageing of the gut microbiome: Potential influences on immune senescence and inflammageing. Ageing Research Reviews. 68, 101323 (2021).
- Berg, M., et al. Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments. The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).
- Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans Microbiome Resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
- Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Felix, M. A., Ruvkun, G. Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).
- Zimmermann, J., et al. The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans. The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2020).
- Dinic, M., et al. Host-commensal interaction promotes health and lifespan in Caenorhabditis elegans through the activation of HLH-30/TFEB-mediated autophagy. Aging. 13 (6), 8040-8054 (2021).
- Goya, M. E., et al. Probiotic Bacillus subtilis protects against alpha-Synuclein aggregation in C. elegans. Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).
- Hacariz, O., Viau, C., Karimian, F., Xia, J. The symbiotic relationship between Caenorhabditis elegans and members of its microbiome contributes to worm fitness and lifespan extension. BMC Genomics. 22 (1), 364 (2021).
- Shin, M. G., et al. Bacteria-derived metabolite, methylglyoxal, modulates the longevity of C. elegans through TORC2/SGK-1/DAF-16 signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (29), 17142-17150 (2020).
- Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
- Zhang, F., et al. High-throughput assessment of changes in the Caenorhabditis elegans gut microbiome. Methods in Molecular Biology. 2144, 131-144 (2020).
- Chan, J. P., et al. Using bacterial transcriptomics to investigate targets of host-bacterial interactions in Caenorhabditis elegans. Scientific Reports. 9 (1), 5545 (2019).
- Hartsough, L. A., et al. Optogenetic control of gut bacterial metabolism to promote longevity. Elife. 9, 56849 (2020).
- Pryor, R., et al. Host-microbe-drug-nutrient screen identifies bacterial effectors of Metformin therapy. Cell. 178 (6), 1299-1312 (2019).
- Benedetto, A., et al. New label-free automated survival assays reveal unexpected stress resistance patterns during C. elegans aging. Aging Cell. 18 (5), 12998 (2019).
- Coburn, C., et al. Anthranilate fluorescence marks a calcium-propagated necrotic wave that promotes organismal death in C. elegans. PLOS Biology. 11 (7), 1001613 (2013).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T.
- Naomi, R., et al. Probiotics for Alzheimer's disease: a systematic review. Nutrients. 14 (1), 20 (2021).
- Zheng, S. Y., et al. Potential roles of gut microbiota and microbial metabolites in Parkinson's disease. Ageing Research Reviews. 69, 101347 (2021).
- Gill, M. S., Olsen, A., Sampayo, J. N., Lithgow, G. J. An automated high-throughput assay for survival of the nematode Caenorhabditis elegans. Free Radical Biology and Medicine. 35 (6), 558-565 (2003).
- Park, H. -E. H., Jung, Y., Lee, S. -J. V. Survival assays using Caenorhabditis elegans. Molecules and Cells. 40 (2), 90-99 (2017).
- Partridge, F. A., et al. An automated high-throughput system for phenotypic screening of chemical libraries on C. elegans and parasitic nematodes. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 8 (1), 8-21 (2018).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Stroustrup, N., et al. The Caenorhabditis elegans lifespan machine. Nature Methods. 10 (7), 665-670 (2013).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Brown, A. E., Schafer, W. R. Unrestrained worms bridled by the light. Nature Methods. 8 (2), 129-130 (2011).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. Elife. 6, 26652 (2017).
- Jushaj, A., et al. Optimized criteria for locomotion-based healthspan evaluation in C. elegans using the WorMotel system. PLoS One. 15 (3), 0229583 (2020).
- Nambyiah, P., Brown, A. E. X. Quantitative behavioural phenotyping to investigate anaesthesia induced neurobehavioural impairment. Scientific Reports. 11 (1), 19398 (2021).
- Squiban, B., Belougne, J., Ewbank, J., Zugasti, O. Quantitative and automated high-throughput genome-wide RNAi screens in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (60), e3448 (2012).
- Zugasti, O., et al. Activation of a G protein-coupled receptor by its endogenous ligand triggers the innate immune response of Caenorhabditis elegans. Nature Immunology. 15 (9), 833-838 (2014).
- Zugasti, O., et al. A quantitative genome-wide RNAi screen in C. elegans for antifungal innate immunity genes. BMC Biology. 14, 35 (2016).
